鐘 閏,吳思偉,何秀苗,龍 寒,禤金彩,劉紅全(廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院,廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530007)

微藻是生活在淡水或鹽水中的原核或真核光合微生物,在水生生態(tài)系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用,因?yàn)樗鼈冐?fù)責(zé)全球約40%的光合作用[1]。鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina),亦被稱為杜氏鹽藻,是一種嗜鹽的綠色微藻,屬綠藻綱團(tuán)藻目,比較常見于海鹽田。相關(guān)研究表明,杜氏鹽藻及其代謝產(chǎn)物具有多種生物學(xué)功能,包括抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、免疫調(diào)節(jié)[4-5]和抗炎活性[6],可廣泛應(yīng)用到功能性的食品中,具有非常高的研究價(jià)值[7]。

全球癌癥發(fā)病率和死亡率正在迅速增長[8]。盡管癌癥生物學(xué)和治療學(xué)取得了一定進(jìn)展,但耐藥性仍然存在問題[9]。許多癌細(xì)胞對化療藥物表現(xiàn)出顯著耐藥性,市場上幾乎所有化療藥物都會(huì)引起嚴(yán)重的副作用[10]。因此,迫切需要新的無毒或副作用小的替代治療藥物[11]。在過去十年中,越來越多的證據(jù)表明,海洋生物提供廣泛的天然抗腫瘤化合物,可以作為抗腫瘤藥物[12]。海藻是海洋中最豐富的資源,其活性代謝產(chǎn)物如多糖和多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物具有抗腫瘤活性或可提高常規(guī)化療藥物的療效[13-14]。

目前有關(guān)DsEPS的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制仍有待闡明。本實(shí)驗(yàn)以人宮頸癌Hela細(xì)胞為靶細(xì)胞,研究DsEPS的抗腫瘤活性,通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析闡明抗腫瘤與相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系,再通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)找到互作網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)對應(yīng)的hub基因,從而確定DsEPS可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜氏鹽藻 上海光語生物科技有限公司提供;Hela細(xì)胞、Vero細(xì)胞 本課題組保存;配制F/2培養(yǎng)基的藥品 均為國產(chǎn)分析純;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;MTT 深圳市康初源有限公司;二甲基亞砜(DMSO)、EDTA胰蛋白酶、青鏈霉素 北京索萊寶科技有限公司;Trizol試劑 Takara Bio。

HBS-1096A型酶標(biāo)分析儀 南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司;EYELA型冷凍干燥機(jī) 上海愛朗儀器有限公司;HPS-250型人工氣候箱 哈爾濱東明醫(yī)療器械廠;TG150-WS型臺(tái)式高速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;YRE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器公司。

1.2 微藻培養(yǎng)與胞外多糖提取

將微藻按照15%的接種量培養(yǎng)于含250 mL的F/2培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中。人工氣候箱的培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度3500 lux,暗光周期為12 h/12 h,培養(yǎng)溫度為(24±1) ℃,每日搖動(dòng)3～4次。杜氏鹽藻胞外多糖(DsEPS)的提取方法參照Ishiguro等[15]略有改進(jìn)。將進(jìn)入穩(wěn)定期的藻懸液以8000 r/min離心10 min,收集上清液。用水浴溫度低于45 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮上清液,然后用陰離子交換樹脂純化胞外多糖。樣品經(jīng)超濾膜再濃縮后,冷凍干燥得到杜氏鹽藻胞外粗多糖。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

取出保存于液氮罐中的Hela細(xì)胞和Vero細(xì)胞,靜置于37 ℃的恒溫水浴鍋中解凍1 min,將解凍后的細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶內(nèi),添加DMEM培養(yǎng)液,置于CO2培養(yǎng)箱中,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2～3 d。

分別接種對數(shù)期的宮頸癌Hela細(xì)胞與普通Vero細(xì)胞于96孔板內(nèi),用含DsEPS的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)兩種細(xì)胞,使含DsEPS的的培養(yǎng)液濃度分別為0.1、0.5、1.0、10.0 mg/mL,每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)重復(fù)。選取96孔板其中一行做空白對照,即以不加多糖的DMEM培養(yǎng)液來培養(yǎng)細(xì)胞。加樣完成后振蕩均勻,于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間分別達(dá)到24、48、72 h時(shí)終止,并在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。然后使用MTT比色法,測定細(xì)胞數(shù)量。Hela細(xì)胞與Vero細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式如下:

細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組/空白組)×100

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序

在Hela細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用RNA-seq技術(shù)系統(tǒng)分析了DsEPS加入與否對Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)的影響。采用TRIzol(Invitrogen)法提取Hela細(xì)胞中的總RNA,再將樣品送往上海美吉生物制藥生物技術(shù)有限公司(中國上海)進(jìn)行RNA純化、反轉(zhuǎn)錄、文庫構(gòu)建和測序。

1.5 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控,映射與轉(zhuǎn)錄本組裝

由測序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)(圖像文件)首先將轉(zhuǎn)化為原始序列,即 Raw reads。使用軟件:SeqPrep(https://github.com/jstjohn/SeqPrep)和Sickle(https://github. com/najoshi/sickle)去除Raw reads中的空載、接頭和低質(zhì)量序列(未知堿基N≥10%),得到 Clean reads。Clean reads 運(yùn)用FastQC軟件進(jìn)行整體評(píng)估,包括:①堿基質(zhì)量分布統(tǒng)計(jì);②堿基錯(cuò)誤率分布統(tǒng)計(jì);③A/T/G/C堿基含量分布統(tǒng)計(jì)。

使用TopHat(http://TopHat. cbcb. umd. edu/,version2.1.1)[16]軟件,將clean reads與具有定向模式的參考基因組分別對齊。基于所選參考基因組序列,使用StringTie軟件對Mapped Reads進(jìn)行拼接,并與原有的基因組注釋信息進(jìn)行比較,尋找原來未被注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū),發(fā)掘該物種的新轉(zhuǎn)錄本和新基因,從而補(bǔ)充和完善原有的基因組注釋信息。

1.6 表達(dá)量分析與差異表達(dá)基因(DEGs)分析

基于表達(dá)矩陣,進(jìn)行樣本間相關(guān)性分析,相關(guān)性分析有助于理解樣本間特別是生物學(xué)重復(fù)間的相關(guān)性,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性。

為了確定兩組樣本間的差異表達(dá)基因(DEGs),可以先使用軟件RSEM(http://deweylab. biostat. wisc. edu/rsem/)用于量化基因豐度[17]。后續(xù)由于本實(shí)驗(yàn)有生物學(xué)重復(fù),直接使用基于負(fù)二項(xiàng)分布的DESeq2軟件對raw counts進(jìn)行分析,基于一定的標(biāo)準(zhǔn)化處理和篩選條件獲得比較組間表達(dá)差異的基因/轉(zhuǎn)錄本,默認(rèn)參數(shù):p-adjust<0.05 & |log2FC|>=1。

1.7 GO功能注釋分類和KEGG富集分析

利用GO數(shù)據(jù)庫,針對選擇的差異表達(dá)基因可以按照它們參與的生物學(xué)過程、構(gòu)成細(xì)胞的組分,實(shí)現(xiàn)的分子功能等進(jìn)行分類。使用軟件KOBAS 2.1.1(http://KOBAS.cbi.pku.edu.cn/download.php)進(jìn)行了和KEGG富集和代謝途徑分析[18]。

1.8 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)和中心基因分析

為了進(jìn)一步研究小球藻胞外多糖抗腫瘤的分子機(jī)制,使用生物在線數(shù)據(jù)庫工具(用于檢索相互作用基因的檢索工具,STRING,http://string-db.org)將所有DEG用于構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),確定并預(yù)測它們之間的相互作用[19]。綜合得分>0.7(高置信度得分)被認(rèn)為是有意義的,然后使用Cytoscape軟件(版本3.7.2)將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化[20]。為了評(píng)估PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的重要性,在本研究中用Cytoscape軟件中的CytoHubba插件用于節(jié)點(diǎn)的度中心計(jì)算[21-22]。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,從轉(zhuǎn)錄組測序鑒定到的在不同信號(hào)通路的13個(gè)差異表達(dá)基因,用Primer5軟件設(shè)計(jì)13對(包括1個(gè)內(nèi)參基因 GAPDH)熒光定量PCR引物,擴(kuò)增長度為80～250 bp,引物序列見表1。提取的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 鏈后,進(jìn)行熒光定量PCR測定,用2-ΔΔCt法計(jì)算每個(gè)基因相對于GAPDH的相對表達(dá),所有試驗(yàn)均獨(dú)立操作至少三次,并進(jìn)行歸一化處理,以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 抗腫瘤活性結(jié)果

DsEPS對Hela細(xì)胞作用的濃度和時(shí)間結(jié)果如圖1所示。隨著DsEPS濃度的增加,DsEPS對Hela細(xì)胞的抑制越來越強(qiáng),但在一定時(shí)間內(nèi)(72 h)隨著作用時(shí)間的延長,并沒有顯著提升胞外多糖對Hela細(xì)胞的抑制率。當(dāng)DsEPS濃度低于1.0 mg/mL時(shí),DsEPS對Hela細(xì)胞的抑制率低于50%,當(dāng)濃度為1.0 mg/mL時(shí),DsEPS對Hela細(xì)胞的抑制率高于50%,說明濃度為1.0 mg/mL時(shí)已經(jīng)達(dá)到IC50,且由圖2可知,此時(shí)對正常Vero細(xì)胞幾乎沒有抑制,說明該濃度對Hela細(xì)胞的抑制作用顯著(P<0.05)且對普通Vero細(xì)胞無毒副作用。

圖1 DsEPS對Hela 細(xì)胞作用的濃度與時(shí)效性Fig.1 Concentration and time effect of DsEPS solution on Hela cells

圖2 DsEPS對Vero細(xì)胞生長的影響Fig.2 The effect of DsEPS on the Vero cell growth

DsEPS對Hela細(xì)胞形態(tài)的影響如圖3所示。DsEPS明顯抑制Hela細(xì)胞的生長和繁殖。隨著濃度的增加,抑制作用也明顯增強(qiáng)?？鼓[瘤活性試驗(yàn)顯示細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、形狀異常、折射率減弱、細(xì)胞-細(xì)胞連接減少、細(xì)胞間空泡增多、重復(fù)性下降。

圖3 DsEPS對Hela細(xì)胞形態(tài)的影響(100×)Fig.3 Morphologic changes of Hela cell with DsEPS(100×)注:Control:不加DsEPS培養(yǎng)的Hela細(xì)胞;A:DsEPS濃度為0.1 mg/mL時(shí)的Hela細(xì)胞;B:DsEPS濃度為0.5 mg/mL時(shí)的Hela細(xì)胞;C:DsEPS濃度為1.0 mg/mL時(shí)的Hela細(xì)胞。

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控,映射和轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果

對照組(Control)和試驗(yàn)組(DsEPS)分別獲得大約5070萬和5710萬個(gè)Raw reads(表2)。對Raw reads進(jìn)行質(zhì)控,去除空載、接頭和低質(zhì)量序列(未知堿基N≥10%)后,對照組和試驗(yàn)組分別得到5020萬和5660萬的Clean reads。該結(jié)果表明經(jīng)過質(zhì)控后仍有很大比例(99.1%)的高質(zhì)量Clean reads可用于組裝和進(jìn)一步的下游分析。

表2 質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表Table 2 Quality control data statistics

Clean reads被映射到人類參考基因組,詳細(xì)的映射匯總在表3中?？偟膩碚f,對照組和Ds組的映射分別有96.95%和96.97%的reads可匹配到基因組中,其中唯一匹配的reads分別占93.8%和94.07%,表明兩組的基因表達(dá)水平都很高。

表3 比對結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 3 Statistical table of comparison results

使用StringTie軟件對每個(gè)樣本進(jìn)行拼接,最終merge在一起,對拼接之后的結(jié)果的統(tǒng)計(jì)和展示如圖4所示。

圖4 不同轉(zhuǎn)錄本長度分布情況Fig.4 Length distribution of transcripts

2.3 樣品間相關(guān)性檢驗(yàn)與DEGs分析

本實(shí)驗(yàn)生物學(xué)重復(fù)樣本之間的相關(guān)性分析,一方面為了檢驗(yàn)生物學(xué)重復(fù)之間的變異是否符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的預(yù)期,另一方面為差異基因分析提供基本參考。相關(guān)系數(shù)越接近于1,表明基因/轉(zhuǎn)錄本在樣本間的表達(dá)量相似度越高,即樣本間相關(guān)性越好。如圖5所示,樣本間的相關(guān)系數(shù)值均在0.9以上,重復(fù)性優(yōu)秀。

圖5 樣本間相關(guān)性熱圖Fig.5 Correlation thermogram between samples

對照組和實(shí)驗(yàn)組的差異基因表達(dá)分析表明,實(shí)驗(yàn)組(DsEPS)相較于對照組有2032個(gè)基因顯著差異表達(dá)(P-adjust<0.05 & |log2FC|>=1),其中1132個(gè)基因表達(dá)上調(diào),900個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(表4)。這些基因的功能包括細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和能量代謝,線粒體功能,細(xì)胞周期,分化和凋亡,蛋白質(zhì)氧化磷酸化和細(xì)胞信號(hào),RNA功能,DNA修復(fù)和蛋白質(zhì)合成,以及其他一些代謝酶。

表4 表達(dá)量差異統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 4 Statistical results of expression differences

如圖6所示,火山圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)特定的基因,左側(cè)深色點(diǎn)表示顯著上調(diào)的基因,右側(cè)淺色點(diǎn)表示顯著(P<0.05)下調(diào)的基因,灰色點(diǎn)為非顯著差異基因。將所有基因映射上去之后,可以獲知,在左邊的點(diǎn)為表達(dá)差異下調(diào)的基因,右邊的點(diǎn)為表達(dá)差異上調(diào)的基因,越靠左邊和上邊的點(diǎn)表達(dá)差異越顯著(P<0.05)。

圖6 Control_vs_DsEPS火山圖Fig.6 Control_vs_DsEPS volcano

2.4 GO功能注釋分類與KEGG富集分析

為探討DsEPS處理腫瘤Hela細(xì)胞引起基因表達(dá)改變的功能性后果,基于GO數(shù)據(jù)庫對2032 條DEGs進(jìn)行GO功能注釋并對其分類。圖7顯示了62個(gè)的GO分類,由圖7可知，DEGs分別注釋到生物學(xué)過程(biological process)27個(gè)亞類、細(xì)胞成分(cellular component)19個(gè)亞類、分子功能(molecular function)16個(gè)亞類。在生物學(xué)過程中,注釋到該GO二級(jí)分類功能的基因或轉(zhuǎn)錄本數(shù)目排名前三的分別是細(xì)胞過程1427個(gè),單一生物過程1338個(gè),生物調(diào)節(jié)1019個(gè)。在細(xì)胞成分中,涉及細(xì)胞、細(xì)胞部分、細(xì)胞器的基因較多,分別為1466、1464和1197個(gè)。在分子功能中,涉及連接和催化活性的基因較多,分別為1370個(gè)和563個(gè)。

圖7 GO分類統(tǒng)計(jì)柱形圖Fig.7 GO classification statistical histogram注:縱坐標(biāo)表示GO的二級(jí)分類術(shù)語,左方橫坐標(biāo)表示包含在該二級(jí)分類中的基因或轉(zhuǎn)錄本占總數(shù)的百分比,右方橫坐標(biāo)表示比對上該二級(jí)分類的基因/轉(zhuǎn)錄本數(shù)量,三個(gè)顏色表示三大分類。

在生物體內(nèi),基因相互協(xié)調(diào)以發(fā)揮生物學(xué)功能。路徑分析有助于更好地理解基因的生物學(xué)功能。通過路徑顯著性富集分析,確定了差異基因參與的生化代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn),治療組與對照組共有38條代謝途徑表達(dá)差異顯著(P<0.05),其中23條代謝途徑表達(dá)差異極顯著(P<0.01)。圖8顯示了KEGG 38條表達(dá)差異顯著的代謝途徑(P<0.05)。分別包含在KEGG代謝通路的4個(gè)分支中,其中,人類疾病(HD)7條,生物體系統(tǒng)(OS)17條,環(huán)境信息處理(EIP)10條,代謝(M)5條。許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被顯著豐富(P<0.05),包括腫瘤壞死因子信號(hào)途徑、MAPK信號(hào)途徑、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用、VEGF信號(hào)途徑、Ras信號(hào)途徑、PI3K-Akt信號(hào)通路和cAMP信號(hào)途徑。此外,細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和代謝等生物過程調(diào)控在本研究中得到了顯著的豐富(P<0.05)。這些結(jié)果可為研究DsEPS對宮頸癌Hela細(xì)胞的影響提供重要信息。

圖8 KEGG富集柱形圖Fig.8 KEGG enrichment histogram注:橫坐標(biāo)表示KEGG pathway,縱坐標(biāo)表示富集的顯著性水平,對應(yīng)的是柱子的高度,其中,FDR越小,-lg(FDR)值越大,該KEGG pathway越顯著富集。不同顏色表示KEGG代謝通路的不同分支,分別是代謝(M),環(huán)境信息處理(EIP),生物體系統(tǒng)(OS),人類疾病(HD)。

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

為了進(jìn)一步研究DsEPS抑制腫瘤生長的分子機(jī)制和所有DEGs之間的相互作用關(guān)系,將2032條DEGs映射到STRING數(shù)據(jù)庫中,并選擇綜合得分大于0.7(高置信度)的驗(yàn)證性相互作用構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。PPI網(wǎng)絡(luò)由161個(gè)節(jié)點(diǎn)組成(圖9)。在PPI網(wǎng)絡(luò)中,包括含2個(gè)自由基S-腺苷蛋氨酸結(jié)構(gòu)域(RSAD2)、ISG15泛素樣修飾劑(ISG15)、干擾素誘導(dǎo)的四肽重復(fù)蛋白1(IFIT1)、MX動(dòng)態(tài)蛋白樣GTPase 2(MX2),干擾素誘導(dǎo)蛋白與四肽重復(fù)序列2(IFIT2),2′-5′-寡腺苷酸合成酶樣(OASL),2′-5′-寡腺苷酸合成酶1(OAS1),Jun原癌基因(Jun),2′-5′-寡腺苷酸合成酶2(OAS2),XIAP相關(guān)因子1(XAF1)等10種蛋白質(zhì)。用Cytoscape軟件中的CytoHubba插件用于節(jié)點(diǎn)的度中心計(jì)算,這些蛋白與其他蛋白質(zhì)(節(jié)點(diǎn)度大于8)緊密相連,表明它們是互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)(圖10),這些hub基因可能在DsEPS抑制腫瘤生長中起重要作用。hub基因及其對應(yīng)各種拓?fù)湫再|(zhì)如表5所示。

圖9 STRING交互網(wǎng)絡(luò)Fig.9 STRING interaction network

圖10 PPI互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)Fig.10 Key nodes in PPI interactive networks

表5 基因互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)統(tǒng)計(jì)表Table 5 Statistical table of gene interaction network

2.6 qPCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果并進(jìn)一步分析具有重要抗癌作用的基因的表達(dá)模式,13個(gè)具有不同信號(hào)通路的基因,MAPK信號(hào)通路(TNF、PRKCA)、PI3K-AKT信號(hào)通路(PIK3AP1、JAK3)、TNF信號(hào)通路(JUN、MLKL、BCL3)、cAMP信號(hào)通路(ATP1B3、PPP1R1B)、Ras信號(hào)通路(ETS1,RAC3)和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用(CXCL8,IL11RA)中的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。qPCR驗(yàn)證結(jié)果如圖11所示,其表達(dá)趨勢與RNA-seq獲得的結(jié)果一致,表明RNA-seq數(shù)據(jù)可靠地反映了基因表達(dá)的變化。

根據(jù)RNA-seq和qPCR結(jié)果,DsEPS處理的Hela細(xì)胞中,TNF、PIK3AP1、CXCL8、JUN、ATP1B3和ETS1的表達(dá)增加,而PRKCA、JAK3、IL11RA、MLKL、BCL3、PPP1R1B和RAC3等其他基因的表達(dá)顯著(P<0.05)降低。

圖11 DEG的qPCR驗(yàn)證Fig.11 qPCR validation of DEG

3 討論與結(jié)論

本研究表明,杜氏鹽藻胞外多糖(DsEPS)具有抑制Hela細(xì)胞生長、促進(jìn)Hela細(xì)胞凋亡的作用。在此條件下進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,以探索與抗腫瘤相關(guān)的潛在關(guān)鍵DEG和涉及DEGs的生物學(xué)功能和途徑。通過構(gòu)建PPI,確定了一些可能在實(shí)驗(yàn)性腫瘤細(xì)胞抑制中起決定性作用的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的hub基因。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示DsEPS共篩選出2032個(gè)DEGs,其中上調(diào)的1132個(gè),下調(diào)的900個(gè)。腫瘤細(xì)胞的凋亡已經(jīng)被證明是許多癌癥療法誘導(dǎo)的最常見的抗腫瘤機(jī)制[23]。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNFSF10/TRAIL)激活的TNFRSF10A的mRNA水平增加,從而轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞死亡信號(hào)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]。BMF和BCL-2表達(dá)水平降低,這與抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。DsEPS對這些基因有明顯的調(diào)控作用,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其抗腫瘤作用的主要原因。下調(diào)的DEGs主要參與細(xì)胞代謝、有絲分裂和分化等功能。如甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1(SREBF1)、成纖維細(xì)胞生長因子受體樣1(FGFRL1)。此外,與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的基因,如遷移和侵襲增強(qiáng)因子1(MIEN1)[25]、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1(SREBP1)也被下調(diào)。Gao等結(jié)果表明SREBP1通過促進(jìn)與p65磷酸化相關(guān)的基質(zhì)金屬肽酶7(MMP7)的表達(dá)而促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[26]。本研究發(fā)現(xiàn)MMP7和SREBP1的基因表達(dá)顯著下調(diào),提示CEPS可能通過抑制SREBP1而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

PI3K-Akt信號(hào)通路在人類腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化及隨后的生長、增殖和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用[27]。大量研究表明,PI3K-Akt信號(hào)通路在多種癌癥中異常激活[28]。這種途徑的抑制劑被認(rèn)為是潛在的候選藥物,其中一些處于臨床試驗(yàn)的不同階段[29-30]。在人類癌癥中,抗凋亡的BCL-2蛋白在保護(hù)細(xì)胞免受不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞死亡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[31]。本研究提示DsEPS可能通過抑制PI3K-Akt信號(hào)蛋白的表達(dá)下調(diào)BCL-2基因,釋放其對細(xì)胞凋亡的抑制作用,從而使Hela細(xì)胞凋亡。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,可以觀察到一系列hub基因形成了一個(gè)局部網(wǎng)絡(luò),包括RSAD2、IFIT1、MX2、IFIT2、OASL、OAS1、OAS2、XAF1和ISG15,其中大多數(shù)DEGs與癌癥的發(fā)生有關(guān)。其中,OAS、OAS1和OAS2是OAS蛋白家族的成員。OAS蛋白由OAS1/2/3和OASL蛋白組成,是干擾素誘導(dǎo)的第一個(gè)阻礙病毒核酸翻譯的抗病毒蛋白[32]。HPV與Hela細(xì)胞之間的聯(lián)系已經(jīng)被清楚地建立起來,人們普遍認(rèn)為Hela細(xì)胞的主要原因是慢性感染致癌的HPV[33]。然而,OAS家族成員在腫瘤發(fā)展過程中的作用并沒有得到很好的證實(shí)。此外,IFIT1和IFIT2兩個(gè)hub基因與干擾素刺激密切相關(guān)。IFIT2與一些關(guān)鍵的細(xì)胞功能有關(guān),如增殖和遷移[34]。John等識(shí)別干擾素刺激蛋白IFIT1作為炎癥基因程序的負(fù)調(diào)控因子,并確定IFIT1在I型干擾素表達(dá)中的正調(diào)控作用[35]。JUN被廣泛認(rèn)為是一種癌基因,它是激活蛋白-1(AP-1)復(fù)合物中研究最廣泛的蛋白質(zhì),參與多種細(xì)胞活動(dòng),包括增殖、遷移和腫瘤進(jìn)展[36]。另一方面,c-Jun-NH2終末激酶(JNK)/c-Jun通路是癌細(xì)胞中重要的促凋亡信號(hào)通路。在目前的研究中,DsEPS處理的Hela細(xì)胞Jun顯著增加。然而,沒有證據(jù)表明DsEPS與這些中樞基因之間的關(guān)系。所以會(huì)進(jìn)一步研究DsEPS在控制這些中樞基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用。