Cd2+脅迫下對單環(huán)刺螠行為響應(yīng)及淀粉酶活性的研究

王書揚(yáng) 王玥琛 杜興林 牟晉華 呂冬偉

摘要：采用靜水試驗(yàn)法，在水溫（10±2） ℃的條件下，用去離子水配制的Cd2+溶液（0、0.2、0.5、0.8、1.1 mg/L）對單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus）成體進(jìn)行48 h急性毒性試驗(yàn)。結(jié)果表明，單環(huán)刺螠體腔液中淀粉酶的活性與單環(huán)刺螠生活水體中Cd2+的濃度呈簡單的負(fù)相關(guān)，且隨暴露水體中Cd2+濃度的不斷增大，單環(huán)刺螠成體表現(xiàn)出不同程度應(yīng)激性變化。

關(guān)鍵詞：鎘;單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus）;急性毒性;淀粉酶;指示生物

中圖分類號：S94? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）18-0063-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.18.012 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on the response of Urechis unicinctus and amylase activity under Cd2+ stress

WANG Shu-yang， WANG Yue-chen， DU Xing-lin， MU Jin-hua， LYU Dong-wei

（China Agricultural University（Yantai）， Yantai? 264670，Shandong，China）

Abstract： Used hydrostatic test， cadmium ions solution （0， 0.2， 0.5， 0.8， 1.1 mg/L） prepared with deionized water at a water temperature of （10 ± 2） ℃ was used for 48 h acute toxicity test to Urechis unicinctus. The results showed that the activity of amylase in the body cavity of Urechis unicinctus was simply negatively correlated with? the concentration of Cd2+ in the living water body of Urechis unicinctus， and with the increasing concentration of Cd2+ in the exposed water， Urechis unicinctus showed varying degrees of stress change.

Key words： cadmium; Urechis unicinctus; acute toxicity; amylase; biological indicator

影響海水增養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境質(zhì)量狀況的主要因素是部分增養(yǎng)殖區(qū)水體呈富營養(yǎng)化狀態(tài)以及沉積物中糞大腸菌群、銅和鎘等重金屬含量超標(biāo)，這種狀況主要是由于外源輸入污染造成的。而在外源輸入污染中，海洋重金屬污染是近年來人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題[1]。重金屬是具有潛在危害的污染物，它不能被微生物分解，相反生物體可以富集重金屬，并將其轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的物質(zhì)[2]。崔毅等[3]研究了膠州灣海洋生物體中重金屬含量，表明以沉積物為主要餌料的底棲生物體內(nèi)重金屬含量比魚類高，其中鎘具有較強(qiáng)的富集能力。淀粉酶是由消化腺和消化系統(tǒng)分泌的一種水解酶，淀粉酶能將淀粉類食物分解成可吸收的小分子物質(zhì)，為機(jī)體提供所需的營養(yǎng)和能量，淀粉酶的活性變化能及時反映出生物體對消化生理調(diào)節(jié)和環(huán)境適應(yīng)的響應(yīng)?，F(xiàn)有的研究已經(jīng)證實(shí)有多種因素能對淀粉酶活性產(chǎn)生影響[4-9]，重金屬離子含量便是影響淀粉酶活性的主要因素之一[10-12]。單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus）俗名海腸、海腸子，屬于螠蟲動物門（Echiurioidea）螠綱（Echiurida）無管螠目（Xenopneusta）刺螠科（Urchidae）刺螠屬。單環(huán)刺螠和其他刺螠屬的生物一樣，是生活在海邊潮間帶泥性底質(zhì)或珊瑚礁區(qū)中的管狀螠蟲動物，主要分布在黃海、渤海沿岸的威海、煙臺等地，其洞穴為U形穴，曾被當(dāng)作沿海硫化物代謝相關(guān)研究的模式生物。本試驗(yàn)以重金屬Cd2+為應(yīng)急因子，采用急性毒性試驗(yàn)、酶活性檢測和觀察其行為響應(yīng)的方法，確定Cd2+對單環(huán)刺螠的影響，為深入研究重金屬Cd2+對單環(huán)刺螠的致毒機(jī)理以及螠蟲動物環(huán)境毒理學(xué)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用單環(huán)刺螠均來自煙臺北翠海鮮市場，選擇活力良好、體表無傷痕、體態(tài)均一的單環(huán)刺螠成體，體長（10±1） cm;體質(zhì)量（60±5） g，將單環(huán)刺螠成體放于7個（25.42±0.05） L泡沫保溫箱中，每箱5只，加沙加水并24 h不間斷供氧，暫養(yǎng)7 d，每天投餌1次，暫養(yǎng)期間每隔2 d換水1次。試驗(yàn)用沙取自渤海灣海灘，海水為實(shí)驗(yàn)室自制，通過海水晶配比，鹽度為30.5;藥品為CdCl2·2.5H2O，分析純固體，用去離子水配制成不同濃度梯度的暴露液。

1.2 方法

根據(jù)王晶[13]對沙蠶污染物暴露濃度的設(shè)定，將暴露的最高濃度控制在單環(huán)刺螠半致死濃度以下。唐永政等[14]研究發(fā)現(xiàn)，單環(huán)刺螠幼螠在Cd2+溶液中48 h的急性毒性試驗(yàn)的半致死濃度為1.789 mg/L，Cd2+對其無害的濃度為 0.179 mg/L，又因單環(huán)刺螠成體對水中重金屬污染抗性更強(qiáng)，所以推斷Cd2+的總濃度應(yīng)控制在0.179～1.779 mg/L;已有研究表明，渤海灣重金屬污染海水中Cd2+的平均濃度為0.5 mg/L左右[15-18]。

以重金屬污染海區(qū)的平均濃度為基準(zhǔn)，設(shè)置0、0.2、0.5、0.8、1.1 mg/L 5個梯度;同時設(shè)置空白對照（CK），CK為過濾后的渤海灣純凈海水，每個梯度放入5只經(jīng)實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)的成螠，試驗(yàn)周期為48 h。試驗(yàn)期間微充氧，不投餌，分別于6、12、24、36、48 h觀察單環(huán)刺螠的體態(tài)變化和應(yīng)激反應(yīng)。

在暴露48 h之后，迅速將各組成體取出，放置到不同的大錐形瓶中，等待約10 min，待其將體內(nèi)所吸海水排出，將其取出，開始解剖并放出體腔液（此為單環(huán)刺螠血液和其他體液的混合物）。從單環(huán)刺螠背側(cè)肛門端開始，用解剖剪慢慢地向吻端呈直線剪去，當(dāng)?shù)谝坏误w腔液從開口開始流出時，用潔凈的小型注射器緩慢地吸取，直到體腔液不再流出。迅速將所得體腔液移入小型離心管中，待其他各組的體腔液都移入離心管后，3 500 r/min離心5 min，取上清液待用。

將上清液按照淀粉酶測試盒（南京建成生物工程研究所制）說明書進(jìn)行操作，在660 nm處用紫外分光光度計(jì)測量各處理的OD并記錄;取不同單環(huán)刺螠個體的體腔液進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，并計(jì)算平均值和不確定度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單環(huán)刺螠生理變化

由表1可知，暴露6 h 5個濃度梯度處理的單環(huán)刺螠體表身體未見疲軟，胴體有充水現(xiàn)象，海水澄清;暴露12 h，在暴露濃度為0.8、1.1 mg/L的處理中，其應(yīng)激性明顯下降，個體經(jīng)多次刺激后才有反應(yīng)，身體未見疲軟，胴體充水;暴露24 h，在暴露濃度為0.8、1.1 mg/L的處理中，單環(huán)刺螠已經(jīng)全部死亡，身體疲軟，胴體不充水，其余組內(nèi)單環(huán)刺螠經(jīng)多次刺激后才有反應(yīng);暴露48 h，暴露濃度為0.5 mg/L的處理中，個體全部死亡，身體疲軟，胴體不充水。

暴露6 h，單環(huán)刺螠體表普遍為粉紅色，0.5、0.8、1.1 mg/L的處理均無法進(jìn)行正常潛沙;暴露12 h，0.8、1.1 mg/L處理下單環(huán)刺螠體壁有類似白色凝霜物質(zhì)出現(xiàn)，體壁顏色變灰白，其余組無此現(xiàn)象;暴露24 h，0.8、1.1 mg/L處理中單環(huán)刺螠已經(jīng)全部死亡，體壁發(fā)白，0.5 mg/L處理下單環(huán)刺螠體壁變紅，部分蟲體從沙中露出;暴露48 h，0.5 mg/L處理下單環(huán)刺螠個體體壁變灰白，從沙中鉆出，大部分蟲體外露。

2.2 單環(huán)刺螠體內(nèi)淀粉酶活性變化

用Excel 2010得到誤差棒曲線，通過SPSS 18.0，利用LSD法對不同暴露濃度下淀粉酶的活力進(jìn)行多重比較，得LSD0.05=0.003 6，LSD0.01=0.005 1;因此，不同Cd2+濃度下所測淀粉酶活力之間差異極顯著，可以使用。

當(dāng)環(huán)境中Cd2+濃度為0.2 mg/L時，單環(huán)刺螠體腔液中淀粉酶活性為530.6 U;當(dāng)環(huán)境中Cd2+濃度為0.5 mg/L時，其淀粉酶活性為268.9 U;當(dāng)環(huán)境中Cd2+濃度為0.8 mg/L時，其淀粉酶活性為121.9 U;當(dāng)環(huán)境中Cd2+濃度為1.1 mg/L時，其淀粉酶活性為10.6 U。

3 小結(jié)與討論

結(jié)果表明，當(dāng)單環(huán)刺螠生活環(huán)境中的Cd2+濃度上升時，單環(huán)刺螠體腔液中的淀粉酶活性表現(xiàn)為抑制，生理活動受到脅迫。與其他近海底棲生物進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，此結(jié)果與Lai等[11]探究的在 Cd2+脅迫下紅樹蜆淀粉酶基本表現(xiàn)為抑制作用的研究結(jié)果基本一致，但與陳肖肖等[19]研究的低濃度Cd2+對泥蚶淀粉酶活性有誘導(dǎo)作用、高濃度Cd2+有抑制作用的結(jié)論不完全一致。陳肖肖等[19]將重金屬 Cd2+濃度設(shè)定為0.005～0.050 mg/L，是在較低濃度條件下 Cd2+對底棲濾食型動物淀粉酶影響的研究，其最高濃度（0.050 mg/L）較本試驗(yàn)的最低濃度（0.2 mg/L）還低，二者的 Cd2+ 濃度范圍不在同一個區(qū)間，所以二者的結(jié)果可比性較低。

除淀粉酶外，短時間低濃度重金屬離子脅迫下，單環(huán)刺螠可以通過提高超氧物歧化酶（Superoxidative dismuse，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）等抗氧化酶的活性來適應(yīng)脅迫;但高濃度長時間脅迫下，抗氧化酶活性下降，活性氧自由基積累，導(dǎo)致機(jī)體受到傷害[20]。已有研究表明，淀粉酶是Ca2+的依賴性酶，低濃度Cd2+對酶活性有激活作用，推測高濃度Cd2+可能通過占據(jù)Ca2+的結(jié)合位點(diǎn)，且與結(jié)合位點(diǎn)外的氨基酸殘基結(jié)合使酶的構(gòu)象改變，從而抑制酶的活性[21]。

根據(jù)研究中單環(huán)刺螠所表現(xiàn)出來的特性，可以提出將其作為海水中金屬鎘指示生物的設(shè)想。指示生物又叫生物指示物（Biological indicator），是指在一定地區(qū)范圍內(nèi)，能通過特性、數(shù)量、種類或群落等變化，指示環(huán)境或某一環(huán)境因子特征的生物[22]。在近海水域污染監(jiān)測中，經(jīng)常通過測定指示生物體內(nèi)重金屬濃度評價水域污染水平。常用的環(huán)境指示生物的選擇，是利用生物體從周圍環(huán)境中積累重金屬，并且其體內(nèi)重金屬濃度與環(huán)境重金屬濃度間有一定的相關(guān)關(guān)系。如馬藏允等[23]研究的重金屬鎘的指示生物紫貽貝、魁蚶、褶牡蠣都是利用了上述特性。本研究結(jié)果表明，單環(huán)刺螠體腔液中的淀粉酶活性與環(huán)境中鎘離子濃度呈負(fù)相關(guān)?？衫脝苇h(huán)刺螠這一性質(zhì)，通過測定某一海域成體體內(nèi)淀粉酶活性來衡量海水中金屬鎘的含量，作為一種金屬鎘的環(huán)境指示生物。通過碘液指示單環(huán)刺螠體腔中淀粉酶與淀粉混合液的顏色，以混合液分光光度作為一種指標(biāo)，可以更加直觀、簡便地衡量海水中金屬鎘的含量。

單環(huán)刺螠體腔液中的淀粉酶活性與其生存環(huán)境中Cd2+濃度呈簡單的負(fù)相關(guān)，當(dāng)單環(huán)刺螠生活環(huán)境中的Cd2+濃度上升時，單環(huán)刺螠體腔液中的淀粉酶活性表現(xiàn)為抑制，個體生命活動受到脅迫;同時，單環(huán)刺螠在Cd2+中毒時還會出現(xiàn)身體疲軟、胴體充水、體表黏膜脫落、體壁變暗等生理現(xiàn)象。

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