醬鹵肉制品中雜環(huán)胺的生成及分離檢測技術(shù)研究進(jìn)展

孟圓 孟醒 夏秀芳

摘 要：醬鹵肉制品是我國典型的傳統(tǒng)肉制品，在生產(chǎn)加工過程中會(huì)產(chǎn)生一類致癌致突變的芳香烴類化合物雜環(huán)胺。雖然醬鹵肉制品的加工溫度較溫和，但由于其加工方式的特殊性，也導(dǎo)致了大量雜環(huán)胺的產(chǎn)生。本文針對醬鹵肉制品加工過程中雜環(huán)胺的形成機(jī)理、影響因素進(jìn)行綜述，以期為今后醬鹵肉制品中雜環(huán)胺的研究及相應(yīng)抑制措施提供進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)。同時(shí)總結(jié)現(xiàn)階段肉制品中雜環(huán)胺的分離檢測技術(shù)，對現(xiàn)存檢測技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)及局限性進(jìn)行分析及評估，為今后雜環(huán)胺的分析處理技術(shù)提供科學(xué)參考和指導(dǎo)方向。

關(guān)鍵詞：雜環(huán)胺;醬鹵肉制品;形成機(jī)理;影響因素;分離檢測技術(shù)

Abstract： Soy sauce and pot-roast meat products are typical traditional Chinese meat products. Despite the mild temperature during their production and processing， a large number of heterocyclic amines， a class of carcinogenic and mutagenic aromatic hydrocarbon compounds， can be generated due to the use of the special processing methods. This paper reviews the mechanism of the formation of heterocyclic amines in soy sauce and pot-roast meat products and the factors influencing it during processing in order to provide a scientific basis for future research on heterocyclic amines and developing countermeasures to inhibit their formation. Simultaneously， the currently available methods for the separation and detection of heterocyclic amines from the meat products are summarized， and their advantages and limitations are analyzed， which will provide scientific reference and directions for the analysis and processing of heterocyclic amines in the future.

Keywords： heterocyclic amines; soy sauce and pot-roast meat products; formation mechanism; factors; separation and detection technologies

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200422-099

中圖分類號：TS251.5 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）08-0091-11

引文格式：

孟圓， 孟醒， 夏秀芳. 醬鹵肉制品中雜環(huán)胺的生成及分離檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 肉類研究， 2020， 34（8）： 91-101. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200422-099. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

MENG Yuan， MENG Xing， XIA Xiufang. Progress in understanding the formation of heterocyclic amines in soy sauce and pot-roast meat products and a review of separation and detection technologies[J]. Meat Research， 2020， 34（8）： 91-101. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200422-099. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

醬鹵肉制品是一類以畜禽肉及其副產(chǎn)品為原料，經(jīng)煮制調(diào)味等工藝加工而成的中式傳統(tǒng)肉制品[1]，其加工的關(guān)鍵在于鹵煮和調(diào)味。醬鹵肉制品在加工過程中常產(chǎn)生一類致癌、致突變性的多環(huán)芳香族化合物——雜環(huán)胺（heterocyclic aromatic amines，HAAs），HAAs普遍產(chǎn)生于蛋白質(zhì)含量豐富的食品經(jīng)高溫油炸、煎烤或長時(shí)間烹調(diào)等加工過程[2]。醬鹵肉制品是在溫度相對較低（<100 ℃）的條件下進(jìn)行加工，鹵煮雖是較溫和的加熱過程，但研究發(fā)現(xiàn)醬鹵肉制品在經(jīng)過反復(fù)長時(shí)間的鹵煮后，其總HAAs含量會(huì)提高1～3 個(gè)數(shù)量級[3]，且形成的HAAs種類及數(shù)量區(qū)別于煎炸、烘烤等高溫處理肉制品。

20世紀(jì)70年代末，人們在烤魚和烤牛肉炭化表層中發(fā)現(xiàn)了HAAs。至今在各類烹調(diào)食品中發(fā)現(xiàn)并分離鑒定出的HAAs己超過30 種[4]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)基于長期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析將HAAs分為人類可能致癌物（2A級）及人類潛在致癌物（2B級）兩大類。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，長期攝入HAAs會(huì)造成人體多種組織和器官的損壞，甚至誘發(fā)結(jié)腸[5]、胰腺[6]、前列腺[7]、乳腺[8]、輸尿管[9]等靶器官的癌變，增加阿爾茲海默癥[10]的患病風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，HAAs的致突變能力極強(qiáng)，是亞硝酸鹽、黃曲霉毒素B1和苯并芘的數(shù)十倍甚至數(shù)百倍以上[7]。但烹調(diào)肉制品中HAAs結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且僅以痕量水平存在，因此高效、準(zhǔn)確地分離、檢測HAAs，對HAAs的研究分析至關(guān)重要。

本文系統(tǒng)綜述醬鹵肉制品中HAAs的形成機(jī)理、影響因素及分離檢測肉制品中HAAs的技術(shù)手段，為抑制醬鹵肉制品實(shí)際生產(chǎn)加工中HAAs的形成以及快速、準(zhǔn)確檢測HAAs提供一定的參考。

1 醬鹵肉制品中HAAs的形成機(jī)理

HAAs可分為熱反應(yīng)型HAAs（氨基咪唑氮雜芳烴類）和熱解型HAAs（氨基咔啉類）2 種，熱反應(yīng)型HAAs通常形成于典型烹飪/油炸溫度下（200 ℃），而熱解型HAAs通常在高于250 ℃的溫度下通過分解氨基酸和蛋白質(zhì)形成[11-12]。

1.1 氨基咪唑氮雜芳烴類HAAs形成機(jī)理

不同的氨基咪唑氮雜芳烴化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，都存在咪唑環(huán)、吡啶或吡嗪環(huán)。氨基咪唑氮雜芳烴類HAAs包括咪唑喹啉類、咪唑喹喔類及咪唑吡啶類化合物。咪唑吡啶類化合物中的2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑并[4，5-b]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenyl-imidazo[4，5-b]pyridine，PhIP）的形成途徑早已明確（圖1），而喹啉和喹喔啉類HAAs形成機(jī)制尚未完全明確，可能存在2 種途徑：一種是羰基途徑[13]（圖2），食品中含有的碳水化合物、脂質(zhì)、氨基酸等可作為反應(yīng)型羰基的主要來源，反應(yīng)型羰基化合物趨向于進(jìn)行環(huán)化和低聚，從而產(chǎn)生HAAs。反應(yīng)型羰基的形成也有利于其他羰基的生成，為形成香味前體物質(zhì)提供物質(zhì)基礎(chǔ)[14]。同時(shí)適當(dāng)醛在含氨以及產(chǎn)生氨的化合物中會(huì)產(chǎn)生大量的吡啶、吡嗪類物質(zhì)，肌酸酐的存在一定程度上能夠提供生成吡啶、吡嗪類物質(zhì)所需的氨[15]。吡啶環(huán)、吡嗪環(huán)的形成是咪唑喹啉類（imidazoquinoline，IQ）和咪唑喹喔啉類（imidazoquinoxaline，IQx）HAAs的重要區(qū)別，美拉德反應(yīng)過程中α-二羰基化合物經(jīng)Strecker降解產(chǎn)生吡嗪環(huán)[16]，吡啶除在美拉德反應(yīng)中被檢測產(chǎn)生之外，脂質(zhì)衍生的羰基胺反應(yīng)中存在大量的活性羰基，此途徑也能夠形成吡啶，從而通過脂質(zhì)的環(huán)化和低聚產(chǎn)生HAAs[17]。目前，具體的羰基種類對應(yīng)形成的HAAs種類仍有待確定，但是充分了解食品中羰基的變化途徑也將為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)及抑制HAAs形成提供參考。喹啉和喹喔啉類HAAs形成的另一途徑是自由基途徑，因其完整的形成過程缺少步驟而存在一定的爭議性，尚未得到證實(shí)，大致形成途徑為美拉德反應(yīng)生成吡啶和吡嗪自由基，它們與肌酐、相應(yīng)醛可形成具有喹啉（IQ衍生物）或喹喔啉（IQx衍生物）結(jié)構(gòu)的HAAs[18]。

1.2 氨基咔啉類HAAs形成機(jī)理

肉制品中的熱解型HAAs可由游離氨基酸、蛋白質(zhì)等發(fā)生熱解作用形成。大部分的熱解型HAAs在溫度高于250 ℃條件下產(chǎn)生，β-咔啉類HAAs產(chǎn)生條件對于溫度的要求低于其他咔啉類HAAs（熱降解HAAs），常出現(xiàn)在溫度相對較低的肉類或肉制品加工過程中[7]，可以通過低溫長時(shí)間加工而大量產(chǎn)生。研究表明，醬鹵肉制品中含量最多的HAAs為β-咔啉類HAAs，高出其余HAAs數(shù)倍到數(shù)十倍，由于β-咔啉類HAAs在Ames實(shí)驗(yàn)中沒有表現(xiàn)出突出的致變性，雖然目前在食品行業(yè)未得到重視，但是仍具有間接致癌性[3]，被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列入2B類致癌物，β-咔啉類HAAs自身毒性不強(qiáng)，但是會(huì)作為輔助致突物，誘變增強(qiáng)其他有害物質(zhì)的毒性，還會(huì)對神經(jīng)組織造成一定毒性。

β-咔啉類HAAs包括9H-吡啶并[2，3-b]吲哚（9H-pyrido[4，3-b]indole，Norharman）、1-甲基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚（1-methyl-9H-pyrido[4，3-b]indole，Harman）2 種，其形成機(jī)制類似，目前Norharman的形成途徑較為明確（圖3），存在2 個(gè)主要形成途徑：1）色氨酸先經(jīng)過Amadori重排后脫水，其產(chǎn)物在環(huán)氧孤對電子存在的條件下發(fā)生β-消去反應(yīng)，進(jìn)而形成共軛的氧鎓離子，此反應(yīng)中間體可通過進(jìn)一步脫水和形成拓展的共軛體系穩(wěn)定自身或C-C鍵斷開后進(jìn)行分子取代反應(yīng)，最終形成β-咔啉類HAAs[6];2）β-咔啉可由色氨酸與乙醛或α-酮酸通過Pictet-Spengler反應(yīng)形成四氫化-β-咔啉（tetrahydro-β-carbolines，THβC），再經(jīng)進(jìn)一步的氧化/脫羧或其他加工過程形成[3]。

2 醬鹵肉制品中HAAs形成的影響因素

2.1 原料肉的脂肪與水分含量

目前研究發(fā)現(xiàn)，脂肪含量對HAAs的作用機(jī)制存在以下3 種觀點(diǎn)：一是化學(xué)作用，脂肪氧化產(chǎn)生自由基參與美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生吡嗪、吡啶類物質(zhì)，促進(jìn)極性HAAs的形成[19];二是用物理因素來解釋，脂肪為熱傳遞介質(zhì)，會(huì)影響傳熱效率，從而導(dǎo)致HAAs的含量變化[20];三是脂肪可以稀釋前體物質(zhì)，減少其互相接觸的機(jī)會(huì)及面積，也可以影響HAAs的形成[21]。而水分的存在也能夠一定程度上稀釋前體物質(zhì)，減少其相互接觸機(jī)會(huì)，從而抑制HAAs形成[22]。

不同原料肉品種或同一原料肉品種不同部位的脂肪含量有所差別，郭海濤[19]通過對9 種HAAs含量進(jìn)行檢測得出結(jié)論：隨著脂肪含量在較小幅度內(nèi)增加（0%～15%），極性HAAs含量顯著提高，但當(dāng)脂肪含量增加到20%，除了PhIP外，其余極性HAAs含量的增加趨勢不顯著，但仍呈現(xiàn)增長趨勢，而非極性HAAs主要來自于氨基酸的熱降解作用，與脂肪含量不存在顯著相關(guān)性。原料肉的不同品種[23]、部位[24]、表面積和形狀[19]也對HAAs的產(chǎn)生有顯著影響。研究人員發(fā)現(xiàn)，對于不同烹飪加工手段制得的肉制品，水分含量越多，HAAs形成種類及含量越少，經(jīng)鹵汁熬制的醬鹵肉制品中存在的部分HAAs含量相比于直接暴露在高溫油炸條件下的肉制品有所減少[22]。

2.2 鹵煮時(shí)間及次數(shù)

鹵水煮制是加工醬鹵肉制品的關(guān)鍵步驟之一，是滋味來源的主要途徑，傳統(tǒng)的醬鹵肉制品要在鹵水中經(jīng)過長時(shí)間的煮制加工。鹵水又有新鹵、老鹵之分，新鹵經(jīng)過反復(fù)鹵煮就會(huì)變成老鹵，鹵水經(jīng)過反復(fù)的煮制加工會(huì)出現(xiàn)更多的滋味物質(zhì)，使得醬鹵肉制品味道更佳，但同時(shí)也導(dǎo)致有害致癌物質(zhì)的不斷產(chǎn)生和積累。鹵水的反復(fù)加工對肉品色澤、pH值、灰分、風(fēng)味物質(zhì)、游離氨基酸及核苷酸含量等均產(chǎn)生不同程度的影響，同時(shí)也對亞硝酸鹽蓄積及致癌致突變物質(zhì)產(chǎn)生具有一定促進(jìn)作用[25]。邵斌[26]發(fā)現(xiàn)，隨著鹵煮時(shí)間的延長，鹵煮燒雞的雞肉及雞皮中Horman、Norharman、3-氨基-1，4-二甲基-5H-吡啶并[4，3-b]吲哚（3-amino-1，4-dimethyl-5H-pyrido[4，3-b]indole，Trp-P-1）、3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4，3-b]吲哚（3-amino-1-methyl-5H-pyrido[4，3-b]indole，Trp-P-2）4 種HAAs含量均呈明顯的上升趨勢，且當(dāng)鹵煮次數(shù)達(dá)到20 次以上時(shí)，IQ和2-胺基-3，4，8-三甲基-3H-咪唑并[4，5-f]喹喔啉（2-amino-3，4，8-trimethyl-3H-imidazo[4，5-f]quinoxaline，4，8-DiMeIQx）2 種HAAs也被檢出。郭海濤[19]研究表明，當(dāng)鹵煮時(shí)間由1 h延長為6 h，醬鹵羊肉中的HAAs含量由51.07 ng/g升高至120.32 ng/g，且在醬鹵羊肉中共檢出5 種HAAs，其中包括IQ、4，8-DiMeIQx和2-氨基-3，8-二甲基-咪唑[4，5-f]喹惡啉（2-amino-3，8-dimethylimidazo[4，5-f]quinoxaline，MeIQx）3 種極性HAAs和Harman、Norharman 2 種非極性HAAs，且鹵煮時(shí)間的延長會(huì)導(dǎo)致大量Harman和Norharman的生成。

楊瀟[27]針對不同鹵煮時(shí)間條件下HAAs的產(chǎn)生進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鹵煮2 h為加工關(guān)鍵點(diǎn)，鹵煮時(shí)間小于2 h時(shí)，HAAs含量的上升趨勢不顯著，而當(dāng)鹵煮時(shí)間大于2 h后，HAAs含量將呈現(xiàn)倍數(shù)增長趨勢。目前研究認(rèn)為，鹵煮次數(shù)和時(shí)間的增加導(dǎo)致HAAs種類及含量上升的原因可能是醬油等調(diào)味料在高溫下與肉的反復(fù)作用、氨基酸的熱降解作用、反復(fù)鹵煮使得鹵汁中出現(xiàn)了更多有利于HAAs形成的前體物質(zhì)等[26]。

2.3 前體物質(zhì)

HAAs的形成往往需要一定濃度的前體物質(zhì)及合適的物質(zhì)的量比，前體物質(zhì)含量在不同原料肉品種及同一原料肉品種不同部位間都存在巨大差異性。肌酸、肌酸酐、糖類和氨基酸等都可作為HAAs形成的前體物質(zhì)，目前主要通過構(gòu)建模擬體系來研究不同前體物質(zhì)對HAAs形成的影響。

肌酸、肌酸酐的存在對HAAs的產(chǎn)生有一定促進(jìn)作用[28]。而糖類在低含量時(shí)會(huì)促進(jìn)HAAs產(chǎn)生，高含量則會(huì)抑制HAAs產(chǎn)生，這一現(xiàn)象可能是美拉德反應(yīng)作用的結(jié)果，糖在低含量條件下會(huì)加速非酶褐變反應(yīng)，而在高含量條件下則會(huì)加快美拉德焦糖化反應(yīng)[29]。同時(shí)，氨基酸的存在種類及含量也會(huì)影響不同種類HAAs的形成。

潘晗[3]將羊肉作為醬鹵加工原料，添加不同含量的肌酸、葡萄糖、苯丙氨酸及色氨酸等前體物質(zhì)，探究其對醬鹵羊肉中β-咔啉類HAAs產(chǎn)生的影響，得出結(jié)論：隨著色氨酸含量增加，β-咔啉類HAAs含量出現(xiàn)同步增加;而隨著葡萄糖含量的不斷升高，醬鹵羊肉及肉湯中β-咔啉類HAAs含量則呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢;肌酸在低含量條件下會(huì)促進(jìn)醬鹵羊肉及肉湯中2 種HAAs的形成;苯丙氨酸添加量1.2 mmol/L時(shí)能顯著增加Norharman、Harman含量，其余添加量條件下對Norharman、Harman的形成無顯著影響。

2.4 外源添加物

2.4.1 調(diào)味料

目前研究發(fā)現(xiàn)，通過添加各種調(diào)味料可以影響醬鹵肉制品中HAAs的產(chǎn)生。紅酒能夠抑制MeIQx和PhIP生成，但是會(huì)導(dǎo)致Harman形成增多[30]，而鹽、白砂糖、醬油[3]、料酒[26]等在不同添加量條件下會(huì)不同程度影響HAAs的產(chǎn)生種類及含量。潘晗[3]通過分析醬鹵羊肉中HAAs含量得出結(jié)論，醬油及醬肉中都存在大量非極性HAAs，其中Norharman和Harman 2 種HAAs含量最多，它們中約有50%來源于醬油，15%～23%來自于羊肉加工過程中自身發(fā)生的熱降解反應(yīng)，剩余27%～31%來自于醬油與羊肉之間發(fā)生的反應(yīng)。糖作為一種重要的調(diào)味料會(huì)對HAAs的形成產(chǎn)生影響，不同種類及添加量的糖會(huì)產(chǎn)生不同的作用效果，研究表明，添加低聚糖和菊粉可能是減少熟牛肉餅中雜環(huán)芳香烴形成的有效方法[31-32]。研究人員在針對烤肉中添加糖分影響HAAs生成的研究中發(fā)現(xiàn)，蔗糖、葡萄糖、果糖、蜂蜜均可以達(dá)到降低HAAs生成量的效果，其中蔗糖的抑制作用較其他3 種糖表現(xiàn)不夠理想;同時(shí)提出還原糖α-二羰基化合物的降解產(chǎn)物通過與PhIP及其主要前體反應(yīng)，在抑制PhIP的形成中起重要作用[33]。

2.4.2 香辛料

在醬鹵過程中加入一些天然香辛料不僅可以賦予肉制品特殊風(fēng)味，還能延長保質(zhì)期，抑制腐敗菌的生長。香辛料中化學(xué)成分復(fù)雜，含有多種活性成分及抗氧化劑，同種香辛料對于不同種類HAAs的作用效果不同，且同種香辛料在不同添加量時(shí)可能對HAAs的作用效果也不同。

香辛料中不同成分對HAAs的作用機(jī)理也有所區(qū)別。洋蔥、大蒜中含有豐富的含硫化合物，其含有的大蒜素、二烯丙基硫化物、二烯丙基二硫化物、二丙基二硫化物等物質(zhì)能參與到美拉德反應(yīng)中，抑制HAAs產(chǎn)生[34]。香辛料中含有的部分酚類物質(zhì)通常能夠捕獲反應(yīng)性HAAs形成所需的羰基、清除自由基，從而抑制HAAs形成[35]，也存在一部分酚類物質(zhì)能夠轉(zhuǎn)化為充當(dāng)反應(yīng)性羰基的醌[36]，促進(jìn)HAAs形成[37]。酚類物質(zhì)中的姜黃素、槲皮素和蘆丁主要通過抑制羰基化合物、3S-1，2，3，4-四氫-β-咔啉-3-羧酸形成以及清除β-咔啉類HAAs來抑制HAAs形成，而綠原酸主要通過清除β-咔啉類HAAs和氧氣來抑制HAAs形成[38]。一些辣椒、花椒、黑胡椒中存在的酰胺類物質(zhì)可以通過清除中間體抑制HAAs的形成[39]。部分香辛料對醬鹵肉制品中HAAs的作用效果如表1所示。

2.4.3 其他添加物

除上述添加物之外，天然抗氧化劑（如胡蘿卜素、維生素等[40]）、合成抗氧化劑（如丁基羥基茴香醚、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚、沒食子酸丙酯等[41]）、天然果蔬提取物、中草藥提取物等植物類提取物（如洋蔥水提物[42]、葡萄籽提取物[43]、蘋果皮提取物[44]、石榴籽提取物[45]、菊花提取物[46]、綠茶提取物等）以及橄欖油、葵花籽油及葡萄籽油等[47]富含多不飽和脂肪酸的食用油，均能夠有效抑制食品中發(fā)生的致突變作用，含有多種活性物質(zhì)，可在一定程度上清除自由基，從而減少HAAs的產(chǎn)生。除此之外，保水性物質(zhì)，如微晶纖維素、羧甲基纖維素[48]、殼聚糖等[49]，通過減少食品中水分的損失減少前體物質(zhì)隨水分遷移現(xiàn)象的發(fā)生，也能夠有效抑制HAAs的產(chǎn)生。

3 肉制品中HAAs的分離檢測技術(shù)

肉制品基質(zhì)復(fù)雜、存在大量干擾物質(zhì)以及HAAs自身的低檢出限等都給HAAs的分離檢測造成了困難，為了方便檢測，需要對HAAs進(jìn)行提取、純化和濃縮等前處理，從而保證檢測準(zhǔn)確性，目前HAAs的前處理和檢測方法較為復(fù)雜，一些具有針對性、高效率、高靈敏性的技術(shù)也在不斷出現(xiàn)。下面對現(xiàn)有的肉制品中HAAs分離及檢測方法進(jìn)行介紹。

3.1 肉制品中HAAs分離提取技術(shù)

3.1.1 液-液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）和固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）

LLE和SPE是比較經(jīng)典和傳統(tǒng)的前處理方法，LLE主要根據(jù)溶劑之間的溶解度或分配系數(shù)不同，采用無機(jī)、有機(jī)溶劑或2 類溶劑共同作用使得絕大部分HAAs從一種溶液中轉(zhuǎn)移到另外一種溶液中進(jìn)行萃取。SPE通常被認(rèn)為比LLE更具有優(yōu)勢，此方法分析的靈敏度和選擇性可以通過使用不同的吸附劑和洗脫劑來進(jìn)行優(yōu)化[2]。除一些常見的吸附劑，如硅藻土、人造絲、藍(lán)棉、丙基磺酸柱、強(qiáng)陽離子交換（strong cation exchange，SCX）柱、C18反相柱、Lichrolut EN（樹脂型吸附劑）等之外，目前磁性碳納米管[50]、石墨烯復(fù)合材料[51]等作為新型吸附劑，可進(jìn)一步優(yōu)化HAAs的提取效果。

3.1.2 固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）

為解決傳統(tǒng)LLE、SPE技術(shù)存在的局限性，近年來也出現(xiàn)了微萃取技術(shù)。SPME技術(shù)與SPE的區(qū)別在于沒有將待測物全部萃取，其原理是使樣品基質(zhì)在覆蓋熔融石英纖維的有機(jī)聚合物相與水相之間建立起吸附/溶解-解吸的平衡分配。因此，纖維涂層對于目標(biāo)分析物的提取非常重要。SPME是一種可忽略萃取溶劑的微萃取新技術(shù)，因其具備高度兼容性及可行性等特點(diǎn)越來越受到關(guān)注。Martín-Calero等[52]采用1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體作為解吸溶劑，使用CW-TPR商品涂層對試樣進(jìn)行富集，同時(shí)能夠降低有機(jī)溶劑的消耗量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)豬肉中Trp-p-1、Trp-p-2、AαC、2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚（2-amino-3-methyl-9H-pyrido[2，3-b]indol，MeAαC）、Harman和Norharman的分離和富集。但SPME技術(shù)目前商品化纖維涂層選擇性不高，因此，此技術(shù)還有待進(jìn)一步研究。Zhang Qianchun等[53]開發(fā)了一種在線SPME-高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）技術(shù)，用于食品中HAAs的痕量分析，該方法制備了乙烯基苯基硼酸-共聚乙二醇二甲基丙烯酸乙二醇酯聚合物整體填料，可進(jìn)行在線高效萃取，并采用大體積進(jìn)樣來提高檢測靈敏度，顯示出良好的滲透性、提取能力和選擇性，色譜柱的重現(xiàn)效果令人滿意，該方法作為新型SPME技術(shù)已成功應(yīng)用于烤牛肉和烤羊肉中HAAs的分析。

3.1.3 微波輔助萃取（microwave-assisted extraction，MAE）

MAE是將樣品在微波場中進(jìn)行加熱，通過加熱進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對物質(zhì)的分化提取，將樣品中存在的微波能轉(zhuǎn)化為熱能，實(shí)現(xiàn)對HAAs的分離萃取。目前MAE技術(shù)常與分散液-液微萃?。╠ispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）技術(shù)聯(lián)用，Aeenehvand等[54]在微波輔助條件下，用NaOH溶液、乙醇和丙酮混合溶液提取HAAs，去除蛋白質(zhì)并調(diào)節(jié)pH值后，立即將樣品溶液用于DLLME工藝，甲醇和1-辛醇分別用作分散溶劑和萃取溶劑。研究人員提出了一種MAE低密度溶劑微萃取法，與HPLC聯(lián)用，并采用中心復(fù)合設(shè)計(jì)[2]、響應(yīng)面設(shè)計(jì)[55]等手段對每個(gè)參數(shù)值進(jìn)行優(yōu)化，目前已經(jīng)成功應(yīng)用于燒烤及炸雞制品中HAAs的測定。

3.1.4 DLLME

DLLME是將包含分散性（水-有機(jī)混溶溶劑）和萃取性（有機(jī)溶劑）溶劑的混合物快速添加到含有目標(biāo)分析物的水溶液中，會(huì)促進(jìn)混濁溶液的形成。由于兩相之間形成的表面積非常大，因此被分析物可以快速、有效地富集在萃取溶劑中[11]。Vichapong等[56]采用表面活性劑輔助DLLME與HPLC技術(shù)，對肉制品中的2-氨基-3，4-二甲基咪唑并[4，5-f]喹啉（2-amino-3，4-dimethylimidazo[4，5-f]quinoline，MeIQ）、4，8-DiMeIQx、PhIP、Harman 4 種HAAs進(jìn)行分析檢測，將十二烷基硫酸鈉用作離子選擇及分散劑，以1-辛醇為萃取溶劑，發(fā)現(xiàn)該方法對所有化合物的檢出限均為0.01 μg/kg。研究人員開發(fā)了離子液體輔助DLLME技術(shù)，可用于測定8-MeIQx，此方法將銀納米顆粒（AgNP）修飾的絲網(wǎng)印刷碳納米纖維作為電極，利用電化學(xué)方法進(jìn)行檢測，檢出限為5 μg/L[57]。

3.1.5 其他分離提取方法

除上述幾種較為常見的分離方法外，在線串聯(lián)LLE-SPE、超臨界流體萃?。╯upercritical fluid extraction，SFE）、加壓液體萃取[58]、加速溶劑萃取[59]、微固相萃?。╩icro-SPE）[60-61]及QuEChERS[62]、電膜萃取[63]也被用來提取HAAs。Vichapong等[64]使用新一代濁點(diǎn)萃取程序——空氣攪拌濁點(diǎn)萃?。╝ir-agitated cloud-point extraction，AACPE），用于萃取和預(yù)濃縮4 種HAAs（MeIQ、4，8-DiMeIQx、PhIP、Harman），此方法已成功應(yīng)用于高預(yù)濃縮因子分析物的分析。微波輔助鹽酸法從乳糖中合成了短碳點(diǎn)的熒光水溶性碳納米顆粒，是新出現(xiàn)的一種納米技術(shù)，其可替代色譜分析前的優(yōu)化萃取過程，合成納米顆粒成本廉價(jià)、具有熒光特性，通過對碳點(diǎn)熒光的猝滅作用以及存在HAAs時(shí)碳點(diǎn)的壽命進(jìn)行進(jìn)一步測定，此方法同樣也是目前研究HAAs定量的先進(jìn)手段[65]。部分可用于分離提取肉制品中HAAs的技術(shù)條件及其優(yōu)缺點(diǎn)如表2所示。

3.2 肉制品中HAAs檢測技術(shù)

3.2.1 LC及LC-質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）聯(lián)用法

HPLC是一種較為理想的HAAs測定方法，但是其靈敏度主要取決于組合的檢測設(shè)備，HPLC是將不同比例的混合溶劑或極性不同的單一溶劑、緩沖液等流動(dòng)相裝入固定相色譜柱，同時(shí)采用高壓輸液系統(tǒng)，采用一定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量及定性分析。

HPLC-MS是目前檢驗(yàn)手段中發(fā)展較為迅速的一種，其結(jié)合了LC技術(shù)對熱不穩(wěn)定性、高沸點(diǎn)物質(zhì)的高效分離能力以及MS技術(shù)對復(fù)雜組分的分析能力，是一種分析復(fù)雜有機(jī)混合物的有效手段，同時(shí)MS的應(yīng)用也能夠進(jìn)一步避免假陽性、假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。Lee等[66]采用HPLC-MS/MS法對7 種不同食品基質(zhì)中HAAs進(jìn)行分析檢測，用6 種同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，使用Chem Elut和Oasis親水親脂平衡盒進(jìn)行樣品制備，以消除干擾。Kwak[67]將同位素稀釋液LC-MS/MS法用于分析及定量檢測魚基質(zhì)中存在的HAAs。Toribio等[68]采用低耗時(shí)的固相萃取程序純化樣品，并使用LC-MS/MS和離子阱質(zhì)量分析儀作為測定技術(shù)，分析測定烤牛排中的15 種HAAs含量。Linghu等[69]使用EMR-脂質(zhì)吸附劑和鹽析分配進(jìn)行快速分散固相萃取，體積分?jǐn)?shù)分別為1%和2%的乙腈-甲酸可從不同肉類基質(zhì)中有效提取HAAs，并且結(jié)合HPLC-MS技術(shù)定量及定性分析HAAs。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS）是在傳統(tǒng)HPLC的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)，采用1～2 μm的細(xì)粒徑填料和細(xì)內(nèi)徑色譜柱，可以獲得很高的柱效。目前MS[70]、電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）[71]、大氣壓化學(xué)電離（atmospheric-pressure chemical ionization，APCI）[72]等技術(shù)可以輔助UPLC進(jìn)行HAAs檢驗(yàn)分析，提高其靈敏性和準(zhǔn)確度。Manful等[73]使用甲醇作為溶劑的加壓加速溶劑萃取劑萃取HAAs，然后添加內(nèi)標(biāo)并通過UPLC-高分辨率質(zhì)譜定量檢測HAAs，該方法與傳統(tǒng)檢測技術(shù)相比更加快速、準(zhǔn)確、可重現(xiàn)，且不需要復(fù)雜的預(yù)處理步驟。Yan Yan等[74]提出采用乙腈法提取肉制品中的HAAs，并通過一步式Oasis MCX Cartridge固相萃取柱對樣品進(jìn)行純化，結(jié)合UPLC-MS法可實(shí)現(xiàn)17 種HAAs的同步提取，乙腈法的回收率可由傳統(tǒng)法的32.7%～78.5%提高到42.5%～99.0%，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于傳統(tǒng)法，由此得出乙腈法具備更高的回收率和更好的重復(fù)性。

3.2.2 氣相色譜（gas chromatography-based methods，GC）及GC-MS法

GC法多用于分析低極性或非極性HAAs，由于HAAs多屬極性、難揮發(fā)類物質(zhì)，通常需要經(jīng)過衍生處理增加HAAs的揮發(fā)性，才能達(dá)到較易吸收的效果，由此提出了?；?、烷基化、硅烷化等衍生化技術(shù)手段，應(yīng)用于HAAs檢測的前處理優(yōu)化。由于GC儀無法有效檢測到低含量HAAs，衍生化過程耗時(shí)且只有少部分HAAs經(jīng)過衍生處理后能采用GC方法檢測，所以使用范圍較小，不是一種常用的HAAs分析方法。

GC-MS法充分結(jié)合了GC技術(shù)對復(fù)雜物質(zhì)的高效分離能力以及MS技術(shù)的定性、定量、高效分析鑒定能力。研究發(fā)現(xiàn)，耐壓多樣品微量衍生反應(yīng)裝置可用于GC-MS中，分析極性HAAs[75]，采用N-（叔丁基二甲基硅烷基）-N-甲基三氟乙酰胺（含1%叔丁基二甲基氯硅烷）硅烷化試劑，在高溫條件下衍生極性HAAs，此方法既能夠?qū)崿F(xiàn)多個(gè)樣品同時(shí)衍生的需求，又能夠在高于試劑沸點(diǎn)溫度下實(shí)現(xiàn)衍生反應(yīng)。GC-MS相比于LC-MS還需衍生步驟，較為繁瑣，操作難度較大，近些年不太用于HAAs的檢測。

3.2.3 毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillary zone electrophoresis，CZE）法

CZE法是以毛細(xì)管為通道、高壓電場為主要?jiǎng)恿Φ囊环N液相分離分析技術(shù)，其發(fā)展使得分析儀器更加便攜化、集成化與微型化。Fei Xiaoqing等[76]使用CZE方法分析肉基質(zhì)中的8 種HAAs，得到HAAs的最佳分離條件：以pH值為2.20的5 mmol/L甲酸-甲酸銨溶液作為運(yùn)行電解質(zhì)，施加18 kV電壓，采用固體萃取操作進(jìn)行凈化處理，紫外（ultraviolet，UV）-二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）檢測，檢測波長214 nm。CZE-MS技術(shù)將MS技術(shù)的高選擇性和高靈敏度優(yōu)勢與CZE的高效檢測分離優(yōu)勢相結(jié)合[77]，針對食品中存在的微量復(fù)雜HAAs進(jìn)行分離檢測，具備獨(dú)特優(yōu)勢，十分具有發(fā)展前景。此外研究人員將毛細(xì)管高效液相色譜（CHPLC）與DAD[78]、MS[79]聯(lián)用，分析食品中的Harman、Norharman和MeIQx等HAAs。

3.2.4 酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法

ELISA是一種基于免疫學(xué)反應(yīng)、可通過抗原抗體結(jié)合進(jìn)行檢測的高靈敏性技術(shù)，目前可應(yīng)用于分析檢驗(yàn)加工肉制品中的HAAs，可分為間接競爭ELISA法和直接競爭ELISA法。Sheng Wei等[80]采用直接競爭ELISA法對HAAs進(jìn)行檢測，將牛特異性多克隆抗體血清白蛋白作為免疫原，測定半數(shù)最大抑制濃度（IC50）和檢出限，發(fā)現(xiàn)對IQ類HAAs具有很強(qiáng)的特異性。王靜等[81]通過ELISA法實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)物4，8-DiMeIQx的高效檢測，未來仍可進(jìn)一步開發(fā)此方法在檢測HAAs中的應(yīng)用，為加工肉制品中的HAAs測定提供一種簡便、快速的方法。

3.2.5 高效薄層色譜（high-performance thin-layer chromatography，HPTLC）法

除了上面幾種常用的檢驗(yàn)HAAs的方法，HPTLC法也可用于檢驗(yàn)HAAs，其采用粒度分布很窄的微粒硅劑（5～10 μm）制備高效薄層板，用程序多級展開或圓形展開技術(shù)使薄層色譜的靈敏度和分辨率大大提高，分析成本低、干擾小、操作簡單，但是準(zhǔn)確度較HPLC低，且存在費(fèi)時(shí)、對目標(biāo)物造成污染等風(fēng)險(xiǎn)，所以現(xiàn)階段測定肉制品中的HAAs較少使用此方法[82]。表3總結(jié)了一些可用于檢測肉制品中HAAs的技術(shù)手段及其優(yōu)缺點(diǎn)。

綜上所述，每種分離提取和檢驗(yàn)方法都存在其相應(yīng)優(yōu)勢、局限性及適用對象，應(yīng)根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)對象、實(shí)驗(yàn)條件及在檢出限要求下選擇合適的方法，才能準(zhǔn)確、高效得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為今后的實(shí)驗(yàn)提供科學(xué)的理論支撐。

4 結(jié) 語

基于醬鹵肉制品中存在的痕量HAAs物質(zhì)對人體造成的遠(yuǎn)期危害性，本文對其形成機(jī)理、影響因素進(jìn)行總結(jié)。但目前國內(nèi)外缺乏醬鹵肉制品中HAAs的相關(guān)研究，醬鹵肉制品中許多HAAs形成機(jī)制尚未完全明確，其安全問題并未得到重視，且我國對于HAAs在各類食品中的含量標(biāo)準(zhǔn)未作明確限制要求。同時(shí)本文針對目前用于分離檢測肉制品中HAAs的技術(shù)進(jìn)行分析及評估，但HAAs的痕量水平及食品基質(zhì)的高度復(fù)雜性仍給HAAs研究帶來了巨大困難，且我國的分離檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)展相對緩慢和固定化。今后，應(yīng)在進(jìn)一步探究HAAs形成機(jī)理的同時(shí)開發(fā)適宜的分離檢驗(yàn)技術(shù)，從而采取合適的抑制手段，提高食品的安全性。

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