高效硝化與反硝化功能菌株的分離篩選及其性能研究*

郭少鵬 江興龍 王澤旭 魏金生

高效硝化與反硝化功能菌株的分離篩選及其性能研究*

郭少鵬1, 2江興龍1, 2①王澤旭1, 2魏金生1, 2

(1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廈門 361021; 2. 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心 廈門 361021)

本研究利用選擇培養(yǎng)基從鰻鱺精養(yǎng)殖池和循環(huán)水水處理系統(tǒng)中分離篩選出二株脫氮細(xì)菌, 應(yīng)用16S rRNA分子生物學(xué)鑒定, 確定菌株的種屬。菌株NB-1屬于芽孢桿菌屬()、菌株DB-1是惡臭假單胞菌()。對(duì)菌株硝化及反硝化作用性能的研究結(jié)果表明: 菌株NB-1具有良好的亞硝化及硝化作用性能, 在投菌量為0.025%時(shí), 氨氮降解率為69.5%, 亞硝酸鹽氮降解率為99.2%。菌株DB-1在厭氧條件下表現(xiàn)出良好的反硝化作用性能, 最適投菌量為0.6%, 最佳C/N為12, 對(duì)硝酸鹽氮的降解率為94.6%, 對(duì)總氮的降解率為64.0%。因此本研究篩選出的二株脫氮細(xì)菌可以廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖水體水質(zhì)調(diào)控, 具有良好的市場應(yīng)用前景。

硝化作用; 反硝化作用; C/N; 功能菌株

本研究通過應(yīng)用選擇培養(yǎng)基的方法, 分別從鰻鱺精養(yǎng)殖水體的生物膜凈水柵和循環(huán)水水處理系統(tǒng)生物濾池生物填料的生物膜上, 分離篩選出具有高效硝化與反硝化功能的兩個(gè)菌株NB-1和DB-1, 對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定及硝化與反硝化性能的研究, 探索提高脫氮效率的方法, 為提高養(yǎng)殖水體水質(zhì)調(diào)控效果及水處理系統(tǒng)的脫氮效率提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本試驗(yàn)中的硝化細(xì)菌菌株NB-1、厭氧反硝化細(xì)菌菌株DB-1分別分離篩選于鰻鱺精養(yǎng)殖水體中設(shè)置的生物膜凈水柵及鰻鱺循環(huán)水水處理系統(tǒng)反硝化處理單元的生物填料。

1.1.2 培養(yǎng)基 應(yīng)用硝化細(xì)菌培養(yǎng)基(周鮮嬌等, 2016)篩選生物膜凈水柵生物膜上的硝化細(xì)菌。應(yīng)用厭氧反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基(蔣欣燃, 2017)篩選生物填料生物膜上的厭氧反硝化細(xì)菌。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選、分離與鑒定

1.2.1.1 硝化細(xì)菌的篩選分離與菌種鑒定 用無菌剪刀剪下10g生物膜凈水柵尼龍絲, 并裝入盛有100mL滅菌水的藍(lán)蓋瓶中, 超聲波震蕩30min后獲得菌懸液。參考類似研究方法(熊焰等, 2010; 李永芹等, 2013), 將菌懸液按10%比例接入已滅菌的亞硝酸鹽富集培養(yǎng)基中, 30°C, 180r/min恒溫振蕩培養(yǎng), 每天加入5%的亞硝酸鈉溶液2mL, 富集培養(yǎng)1周, 用平板稀釋法分離純化。取分離純化后得到的單菌落菌株置于裝有50mL普通肉湯培養(yǎng)基中, 80°C水浴加熱處理30min, 殺死微生物營養(yǎng)體細(xì)胞。然后30°C, 180r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24h, 將增殖培養(yǎng)液置于80°C水浴加熱30min, 再次殺死不形成芽孢的營養(yǎng)體細(xì)胞。取1mL處理液以梯度稀釋法分別稀釋到10–3, 10–4, 10–5等。分別取0.1mL菌液涂布于普通肉湯固體培養(yǎng)基上, 于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后, 挑選單菌落, 劃線接種至普通肉湯固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h, 并分離純化三次。接種至固體斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)并4°C保藏, 備用。

挑取菌株單菌落接種在LB 液體培養(yǎng)基中30°C條件下170r/min 振蕩培養(yǎng)12h后, 離心收集菌體, 利用細(xì)菌DNA提取試劑盒(天根生化, 北京)提取菌株的基因組DNA, 利用通用引物27F (5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGT TACGACTT-3′)進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增, PCR反應(yīng)條件為: 95°C預(yù)變性5min, 30個(gè)循環(huán)(95°C 1min, 53°C 1min, 72°C 1.5min), 72°C延伸10min。用膠回收試劑盒(天根生化, 北京)純化大約1.5kb的目的片段, 將純化后的PCR產(chǎn)物送至美吉生物進(jìn)行測序, 將所得序列經(jīng)NCBI網(wǎng)站的BLAST (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast)進(jìn)行在線比對(duì)分析, 利用MEGA X軟件中的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 確定菌株的種屬。

1.2.1.2 厭氧反硝化細(xì)菌的篩選分離與菌種鑒定 取10g鰻鱺循環(huán)水水處理系統(tǒng)生物濾池底部(環(huán)境溶解氧低于1.0mg/L)的生物填料, 加入裝有100mL富集培養(yǎng)液體培養(yǎng)基的滅菌藍(lán)蓋瓶中, 在低溫?fù)u床上20°C培養(yǎng)48h后取菌液, 每24h測定培養(yǎng)基中硝酸鹽氮濃度, 當(dāng)硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化達(dá)90%以上時(shí), 菌液用于細(xì)菌分離。通過系列稀釋法和平板劃線法從富集后的菌液中分離反硝化細(xì)菌, 并選取BTB培養(yǎng)基上菌落周圍出現(xiàn)藍(lán)色暈圈的菌株, 在分離純化培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離, 如此數(shù)次操作, 直到單菌落長出。

厭氧反硝化細(xì)菌的基因組DNA提取、基因組測序、菌種鑒定步驟同1.2.1.1。

1.2.2 菌株的硝化及反硝化性能研究

1.2.2.1 硝化細(xì)菌的硝化性能研究 挑取菌株NB-1單菌落接于滅菌LB液體培養(yǎng)基中, 30°C條件下170r/min振蕩培養(yǎng)24h。在1L養(yǎng)殖廢水中接種0.025% NB-1菌液, 另一組同時(shí)還添加紅糖, 定時(shí)采集水樣離心取上清液測定24h氨氮和CODMn濃度的變化情況。

按0.025%的接種量接種菌液于1L養(yǎng)殖廢水中后培養(yǎng)24h, 定時(shí)采集水樣離心取上清液測定亞硝酸鹽氮的降解率。

在1L養(yǎng)殖廢水中接種0.025% NB-1菌液, 并添加梯度濃度(800, 400, 200, 100, 10, 1, 0mg/L)的紅糖, 測定亞硝酸鹽氮降解率的變化情況。

1.2.2.2 厭氧反硝化細(xì)菌的反硝化性能研究 挑取菌株DB-1單菌落接于滅菌LB液體培養(yǎng)基中, 30°C條件下170r/min振蕩培養(yǎng)24h后, 按照1%的接種量接于1L養(yǎng)殖廢水中進(jìn)行厭氧培養(yǎng)24h, 定時(shí)采集水樣離心取上清液, 測定氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、總氮的濃度, 并測算降解率。以對(duì)菌株生長和脫氮影響比較顯著的接種量、C/N和硝酸鹽氮濃度為單因素變量, 對(duì)菌株DB-1的脫氮條件進(jìn)行優(yōu)化。接種量分別按照0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1%的比例添加菌液; C/N利用紅糖將1L試驗(yàn)水體的C/N調(diào)整為4、8、12、16、20; 硝酸鹽氮濃度則將1L試驗(yàn)水體的硝酸鹽氮濃度設(shè)置為5、10、15、20、25mg/L, 菌株DB-1的接種量為0.6%, 試驗(yàn)水體的本底養(yǎng)殖廢水C/N為12。脫氮優(yōu)化試驗(yàn)的測量指標(biāo)為硝酸鹽氮和總氮。

1.2.3 水質(zhì)檢測方法 氨氮的測定用納氏試劑光度法, 亞硝酸鹽氮的測定用分光光度法, 硝酸鹽氮的測定用紫外分光光度法, 總氮的測定用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法, CODMn測定用高錳酸鉀法(國家環(huán)境保護(hù)總局等, 2002)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

=(0–1)/0×100%,

C/N=TC/TN

式中,為水質(zhì)因子(例如氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、總氮、高錳酸鹽指數(shù))的降解率(%);0為水質(zhì)因子起始濃度(mg/L);1為水質(zhì)因子終濃度(mg/L)。C/N為碳氮比;TC為高錳酸鹽指數(shù)濃度(CODMn) (mg/L);TN為總氮濃度(TN) (mg/L)。

采用Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 并作圖。應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析, 視情況對(duì)處理組與對(duì)照組的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著水平的單因素方法分析或-test檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 菌株的篩選及鑒定

2.1.1 菌株NB-1的篩選及鑒定 經(jīng)富集培養(yǎng)、平板初篩和搖瓶培養(yǎng)測定菌株脫氮效率的復(fù)篩, 最終確定一株硝化細(xì)菌菌株, 編號(hào)為NB-1。以菌株NB-1的基因組DNA為模板, 以16S rRNA基因的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后獲得1412bp的堿基序列, 將該序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST同源序列比對(duì), 菌株NB-1與相似性高達(dá)99.93%, 利用MEGA X構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹見圖1。

2.1.2 菌株DB-1的篩選及鑒定 經(jīng)富集培養(yǎng)、平板初篩和搖瓶培養(yǎng)測定菌株脫氮效率的復(fù)篩, 最終確定一株厭氧反硝化細(xì)菌菌株, 編號(hào)為DB-1。以菌株DB-1的基因組DNA為模板, 以16S rRNA基因的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后獲得1389bp的堿基序列, 將該序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST同源序列比對(duì), 菌株DB-1與JCM 13061相似性高達(dá)100%, 利用MEGA X構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹見圖2。

因此, 確定已篩選的菌株NB-1屬于芽孢桿菌屬(), 菌株DB-1()是惡臭假單胞菌。

2.2 菌株NB-1的硝化作用性能

圖1 菌株NB-1基于16S rRNA基因序列的的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖2 菌株DB-1基于16S rRNA基因序列的的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖3 24h氨氮降解情況

圖4 24h亞硝酸鹽氮降解情況

2.2.2 菌株NB-1的自養(yǎng)型特性 為確定菌株NB-1是自養(yǎng)菌或異養(yǎng)菌, 應(yīng)用菌株NB-1開展水體CODMn降解對(duì)照試驗(yàn), 按0.025%的接種量接種菌株NB-1到1L養(yǎng)殖廢水中(CODMn濃度為5.3mg/L, 低碳組), 另一組處理同時(shí)添加100mg/L紅糖為高碳組, 對(duì)照組不做處理。檢測24h的CODMn濃度的變化情況。結(jié)果見圖5, 高碳組的CODMn為32.00mg/L, 24h CODMn逐漸降低至18.09mg/L。而低碳組CODMn濃度無明顯變化, 終濃度仍為5.16mg/L, 對(duì)照組的CODMn和低碳組無顯著差異。表明菌株NB-1沒有利用有機(jī)物, 屬于自養(yǎng)菌。而在高碳組中, 高濃度的有機(jī)碳源導(dǎo)致水體中的異養(yǎng)菌數(shù)量迅速擴(kuò)增, 通過同化利用有機(jī)物而降低了CODMn濃度。綜上, 結(jié)果表明, 菌株NB-1屬自養(yǎng)菌, 進(jìn)行硝化反應(yīng)時(shí)不消耗水中的碳源。

圖5 24h CODMn變化情況

2.2.3 補(bǔ)充碳源對(duì)硝化作用的影響 圖3的試驗(yàn)結(jié)果, NB-1菌液和紅糖組的氨氮降解率高于NB-1菌液組, 表明高濃度的有機(jī)碳源導(dǎo)致水體中的異養(yǎng)菌數(shù)量迅速擴(kuò)增, 異養(yǎng)菌同化利用氨氮而進(jìn)一步降低了氨氮濃度。應(yīng)用菌株NB-1開展16h水體亞硝酸鹽氮降解試驗(yàn), 在1L養(yǎng)殖廢水中, 添加菌株NB-1和梯度濃度的紅糖(紅糖濃度由高到低分別編號(hào)為A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8組, A8組為不添加菌液的對(duì)照組)。碳源紅糖濃度對(duì)亞硝酸鹽降解率的影響見表1及圖6, 8h亞硝酸鹽的降解率, A1、A2、A4組顯著高于A3組, A3組又顯著高于A5組, A5組又顯著高于A6組, A6組又顯著高于A7組, A7組又顯著高于A8組; 16h亞硝酸鹽的降解率, A1、A2、A3組均顯著高于A4、A5、A6、A7組, 它們又顯著高于A8組。結(jié)果表明, 補(bǔ)充碳源紅糖的投加, 促進(jìn)了亞硝酸鹽氮降解。由于菌株NB-1是自養(yǎng)型細(xì)菌, 碳源應(yīng)該是促進(jìn)了水中異養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量擴(kuò)增, 之后異養(yǎng)細(xì)菌同化利用了亞硝酸鹽氮; 當(dāng)補(bǔ)充碳源紅糖濃度在100mg/L以上時(shí), 對(duì)亞硝酸鹽氮的降解無顯著差異, 表明水體中的異養(yǎng)細(xì)菌對(duì)有機(jī)碳源的同化利用已達(dá)上限, 上限濃度是100mg/L。綜上, 結(jié)果表明添加有機(jī)碳源可以提高菌株NB-1在8h時(shí)對(duì)亞硝酸鹽氮的降解率。

表1 紅糖濃度對(duì)亞硝酸鹽氮降解率的影響

Tab.1 Effect of brown sugar concentration on nitrite nitrogen degradation rate

注: 同一列中不同上標(biāo)字母表示數(shù)值之間有顯著差異(<0.05), 相同上標(biāo)字母表示無顯著差異(0.05)

圖6 16h紅糖濃度和添加NB-1菌對(duì)亞硝酸鹽氮降解情況

2.3 DB-1菌株的厭氧反硝化性能

2.3.2 提高DB-1菌株反硝化能力的因素 應(yīng)用菌株DB-1開展水體硝酸鹽氮及總氮降解試驗(yàn), 按0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%(分別編號(hào)為B1、B2、B3、B4、B5組)的接種量在1L養(yǎng)殖廢水中接種菌株DB-1后進(jìn)行厭氧培養(yǎng)48h, 并調(diào)節(jié)試驗(yàn)水體的C/N為16。24h不同接種量硝酸鹽氮和總氮的降解效果見表3, B3、B4、B5組的硝酸鹽氮降解率顯著高于B1、B2組; B5組的總氮降解率顯著高于B3、B4組, 他們又顯著高于B2組, B2組又顯著高于B1組。48h不同接種量硝酸鹽氮和總氮的降解效果見表4, B5組的硝酸鹽氮降解率顯著高于B3組, B3又顯著高于B4組, B4又顯著高于B2組, B2組又顯著高于B1組; B5組的總氮降解率顯著高于B4組, B4又顯著高于B3組, B3又顯著高于B2組, B2組又顯著高于B1組。接種量在0.4%以下時(shí), 反硝化作用不明顯。接種量在0.6%時(shí), 硝酸鹽氮24h的降解率為83.9%, 提高接種量或者增加24h的反應(yīng)時(shí)間, 1%接種量對(duì)硝酸鹽氮的降解率提高到91.6%; 而總氮的降解率隨接種量的增多而升高, 在接種量為1%時(shí), 總氮48h時(shí)的降解率為56.1%。因此, 得出菌株DB-1降解硝酸鹽氮及總氮的適宜接種量為0.6%。

表2 24h水質(zhì)因子濃度變化情況

Tab.2 Variation in concentration of water quality factor in 24h

注: 處理組和對(duì)照組的硝酸鹽氮和總氮24h的降解率均有極顯著差異(<0.01)

圖7 24h氮營養(yǎng)鹽濃度變化情況

應(yīng)用菌株DB-1開展水體硝酸鹽氮及總氮降解試驗(yàn)，按0.6%的接種量在1L養(yǎng)殖廢水中接種菌株DB-1后進(jìn)行厭氧培養(yǎng)48h，并調(diào)節(jié)試驗(yàn)水體的C/N為4、8、12、16、20(分別編號(hào)為C1、C2、C3、C4、C5組)。不同C/N在24h對(duì)菌株DB-1降解硝酸鹽氮和總氮的影響見表5，C3組的硝酸鹽氮降解率顯著高于C5組，C5組又顯著高于C2、C4組, 它們又顯著高于C1組; C5組的總氮降解率顯著高于C3、C4組, 他們又顯著高于C1、C2組。不同C/N在48h對(duì)菌株DB-1降解硝酸鹽氮和總氮的影響見表6, C3、C5組的硝酸鹽氮降解率顯著高于C1、C4組, 他們又顯著高于C2組; C4、C5組的總氮降解率顯著高于C3組, C3組又顯著高于C1、C2組。在接種量為0.6%的條件下, C/N為12組在24h的硝酸鹽氮的降解率為93.4%, 總氮降解率為65.3%; 在48h時(shí), 硝酸鹽氮和總氮的降解率也僅提高為94.6%和65.2%。繼續(xù)提高C/N, C/N為20時(shí)48h硝酸鹽氮的降解率為95.8%, 總氮降解率為64.2%。而C/N為4和8時(shí), 硝酸鹽氮和總氮降解速率較慢, 且總氮的最終降解率也偏低。因此, 得出菌株DB-1降解硝酸鹽氮及總氮的適宜C/N為12。

表3 24h不同接種量硝酸鹽氮和總氮的降解效果

Tab.3 Degradation effects of nitrate nitrogen and total nitrogen in different inoculation amounts in 24h

注: 同一列中不同上標(biāo)字母表示數(shù)值之間有顯著差異(<0.05), 相同上標(biāo)字母表示無顯著差異(0.05)

表4 48h不同接種量硝酸鹽氮和總氮的降解效果

Tab.4 Degradation effects of nitrate nitrogen and total nitrogen in different inoculation amounts in 48h

注: 同一列中不同上標(biāo)字母表示數(shù)值之間有顯著差異(<0.05), 相同上標(biāo)字母表示無顯著差異(0.05)

表5 不同C/N對(duì)24h硝酸鹽氮和總氮降解率的影響

Tab.5 Effect of different C/N on nitrate nitrogen and total nitrogen degradation rate in 24h

注: 同一列中不同上標(biāo)字母表示數(shù)值之間有顯著差異(<0.05), 相同上標(biāo)字母表示無顯著差異(0.05)

表6 不同C/N對(duì)48h硝酸鹽氮和總氮降解率的影響

Tab.6 Effect of different C/N on nitrate nitrogen and total nitrogen degradation rate in 48h

注: 同一列中不同上標(biāo)字母表示數(shù)值之間有顯著差異(<0.05), 相同上標(biāo)字母表示無顯著差異(0.05)

應(yīng)用菌株DB-1開展水體硝酸鹽氮及總氮降解試驗(yàn), 按0.6%的接種量在1L養(yǎng)殖廢水中接種菌株DB-1, 調(diào)節(jié)水體的C/N為12后進(jìn)行厭氧培養(yǎng)24h, 并調(diào)節(jié)試驗(yàn)水體的硝酸鹽氮濃度為5、10、15、20、25mg/L(分別編號(hào)為D1、D2、D3、D4、D5組)。不同濃度的硝酸鹽及總氮的降解效果見表7。D3組的硝酸鹽氮降解率顯著高于D2組, D2組又顯著高于D5組, D5組又顯著高于D1組, D1組又顯著高于D4組; D3組的總氮降解率顯著高于D2組, D2組又顯著高于D4、D5組, 它們又顯著高于D1組。對(duì)15mg/L的硝酸鹽氮和總氮的降解率均為各處理組中最高。因此表明, 菌株DB-1對(duì)硝酸鹽氮及總氮均有良好的降解效果, 對(duì)硝酸鹽氮的降解率為73.3%—90.1%, 對(duì)總氮的降解率為56.8%—76.4%。

綜上, 試驗(yàn)結(jié)果表明菌株DB-1具有良好的厭氧反硝化作用功能, 降解硝酸鹽氮和總氮最適接種量為0.6%, 最適C/N為12, 且對(duì)硝酸鹽氮及總氮均有良好的降解效果, 對(duì)硝酸鹽氮的降解率為73.3%— 90.1%, 對(duì)總氮的降解率為56.8%—76.4%。

表7 不同濃度的硝酸鹽及總氮降解效果

Tab.7 Degradation effect of nitrate and total nitrogen at different concentrations

注: 同一列中不同上標(biāo)字母表示數(shù)值之間有顯著差異(<0.05), 相同上標(biāo)字母表示無顯著差異(0.05)

3 討論

3.1 菌株NB-1的硝化性能分析

氨氮與亞硝酸鹽氮是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖水體水質(zhì)及養(yǎng)殖生物最嚴(yán)重的水質(zhì)理化因子, 濃度過高時(shí)容易導(dǎo)致魚蝦大批患病甚至死亡, 嚴(yán)重影響水質(zhì)和水產(chǎn)品安全(萬紅等, 2006; 張衛(wèi)強(qiáng)等, 2012)。很多水產(chǎn)養(yǎng)殖者都通過選擇采用微生態(tài)制劑來改善水體環(huán)境, 緩解水質(zhì)惡化產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)損失及環(huán)境污染。眾多研究也發(fā)現(xiàn), 從養(yǎng)殖廢水或養(yǎng)殖污泥中篩選出的土著微生物的脫氮性能更加高效。從養(yǎng)殖尾水中篩選的菌株, 按5%的接種量接種于亞硝酸鹽氮濃度為5mg/L的水體中進(jìn)行培養(yǎng)72h, 亞硝酸鹽氮的降解率為98.5% (周鮮嬌等, 2016)。從養(yǎng)殖水體中分離出一株巨大芽孢桿菌(), 將已活化的菌株接種到50mg/L的氨氮培養(yǎng)基中, 24h氨氮的降解率為97.7%(易弋等, 2011)。自養(yǎng)硝化與異養(yǎng)硝化的區(qū)別是其不需要任何有機(jī)營養(yǎng)物, 以無機(jī)碳(CO2)作為唯一碳源(鄭士民等, 1983)。本研究分離篩選出的NB-1菌株屬于自養(yǎng)型細(xì)菌。菌株NB-1在投菌量為0.025%時(shí), 24h對(duì)氨氮的降解率為69.5%。表明, NB-1具有良好的亞硝化功能, 而再增添100mg/L紅糖后, 氨氮的降解率提高為90.8%, 可能是試驗(yàn)水體中的異養(yǎng)細(xì)菌獲得碳源后迅速擴(kuò)增種群, 增加了吸收同化氨氮的量。傳統(tǒng)的亞硝化細(xì)菌一般都是營自養(yǎng)亞硝化的, 但目前已有一些研究從環(huán)境中分離出了異養(yǎng)亞硝化細(xì)菌(肖維偉等, 2008; 胡修貴等, 2013)。菌株NB-1在投菌量為0.025%時(shí), 24h對(duì)亞硝酸鹽氮的降解率為99.2%, 表明NB-1菌株具有良好的硝化作用功能。在試驗(yàn)水體中添加碳源(紅糖)可以加快亞硝酸鹽氮的降解速率, 原因可能是水體中的異養(yǎng)細(xì)菌吸收亞硝酸鹽氮, 促進(jìn)了亞硝酸鹽氮的降解(溫東輝等, 2003)。本試驗(yàn)水體中的亞硝酸鹽氮的降解率在一定范圍內(nèi)和碳源(紅糖)添加量成正比關(guān)系, 但碳源添加量大于100mg/L后, 亞硝酸鹽氮降解率沒有進(jìn)一步提高, 可能是在高碳源濃度條件下水體中的異養(yǎng)硝化細(xì)菌已擴(kuò)增至較大數(shù)量, 抑制了自養(yǎng)硝化細(xì)菌的種群擴(kuò)增, 抑制了硝化細(xì)菌的硝化作用。綜上, 本研究分離篩選出的菌株NB-1可同時(shí)營自養(yǎng)亞硝化及自養(yǎng)硝化, 且對(duì)氨氮和亞硝酸鹽氮的降解率都較高, 類似研究的報(bào)道較少。

3.2 菌株DB-1的厭氧反硝化性能分析

3.3 高效硝化和反硝化細(xì)菌在水體原位修復(fù)中的應(yīng)用前景

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 最初所使用的微生態(tài)制劑成分大多數(shù)僅為光合細(xì)菌、乳酸菌和芽孢桿菌中的一種或多種, 品種較為單一(張?jiān)? 2018)。有研究發(fā)現(xiàn), 將具有硝化和反硝化功能的不同菌種按照合理的比例配比復(fù)合后使用, 對(duì)無機(jī)氮的降解效果十分顯著。當(dāng)光合細(xì)菌、枯草芽孢桿菌和反硝化細(xì)菌按菌液體積比為1 : 2 : 1進(jìn)行復(fù)配利于水中溶解氧的提高和COD、氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮的降解(謝鳳行等, 2012)。推測其原因, 可能是生物特性的互補(bǔ)(施大林等, 2009)。本研究分離篩選的硝化細(xì)菌NB-1同時(shí)具有自營亞硝化和自營硝化的功能, 在投菌量0.025%時(shí), 24h對(duì)氨氮的降解率為69.5%, 對(duì)亞硝酸鹽氮的降解率為99.2%, 具有投菌比例低, 可大幅度降解氨氮和亞硝酸鹽氮的優(yōu)點(diǎn)。厭氧反硝化菌株DB-1具有營異養(yǎng)反硝化作用的功能, 在投菌量為0.6%, C/N為12時(shí), 對(duì)硝酸鹽氮和總氮的降解率為94.6%和65.3%。具有投菌量低、補(bǔ)充碳源量低、降低使用成本的優(yōu)點(diǎn)。水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中存在著低溶氧區(qū)域(陳仲晗等, 2016)。因此, 它們都可以廣泛應(yīng)用于池塘和工廠化養(yǎng)殖水體的原位水質(zhì)調(diào)控。也可應(yīng)用于養(yǎng)殖水的水處理系統(tǒng)的硝化單元和反硝化單元中, 提高相應(yīng)的水處理能力, 具有廣泛的市場應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本研究分離篩選出的菌株NB-1和DB-1, 經(jīng)16S rRNA基因的序列分析和鑒定分別屬于芽孢桿菌屬()和惡臭假單胞菌()。

菌株NB-1屬自養(yǎng)型細(xì)菌, 可同時(shí)營自養(yǎng)亞硝化和自養(yǎng)硝化, 在投菌量為0.025%時(shí)對(duì)氨氮的降解率為69.5%, 對(duì)亞硝酸鹽氮的降解率為99.2%。

菌株DB-1屬異養(yǎng)厭氧反硝化細(xì)菌, 營異養(yǎng)反硝化, 最適投菌量為0.6%, 最適C/N為12, 對(duì)硝酸鹽氮和總氮的降解率分別為94.6%和65.3%。

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ISOLATION AND SCREENING OF HIGH-EFFICIENCY NITRIFICATION AND DENITRIFICATION FUNCTIONAL STRAINS AND EFFECT EVALUATION

GUO Shao-Peng1, 2, JIANG Xing-Long1, 2, WANG Ze-Xu1, 2, WEI Jin-Sheng1, 2

(1. Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Engineering Research Center of the Modern Technology for Eel Industry, Ministry of Education, Xiamen 361021, China)

Two strains of nitrification and denitrification functional strains were isolated and screened from eel culture ponds and recirculating water treatment system by selective medium, and the selected strains were determined by 16S rRNA molecular biological identification. NB-1 strain was belonged to the genus, DB-1strain belonged to the genus. The results show that NB-1 strain had good nitrosation and nitrification performance, and the degradation rate of ammonia nitrogen and nitrite were 69.5% and 99.2% respectively, where the ratio of NB-1 strain was 0.025%. DB-1 strain showed good denitrification performance under anaerobic condition. The optimal dosage ratio of DB-1 strain was 0.6%, and the optimal C/N ratio was 12, where the degradation rate of nitrate was 94.6% and that of total nitrogen was 64.0%. Therefore, the two strains would be widely used in aquaculture to improve water quality and have good application potential.

nitrification; denitrification; functional strains; C/N

* 國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“池塘尾水生態(tài)治理技術(shù)及工程設(shè)施研發(fā)”項(xiàng)目, 2019YFD0900302號(hào); 福建省科技廳區(qū)域發(fā)展項(xiàng)目, 2016N3002號(hào)。郭少鵬, 碩士研究生, E-mail: 736890393@qq.com

江興龍, 博士, 教授, E-mail: xinlongjiang@jmu.edu.cn

2020-04-02,

2020-04-29

S949; S955

10.11693/hyhz20200400106