林 瀚,王晶晶,黃華星,何碧珠,蘭思仁,馬曉開

(1.福建農(nóng)林大學海峽聯(lián)合研究院基因組與生物技術研究中心；2.福建農(nóng)林大學蘭科植物保護與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室；3.福建農(nóng)林大學園林學院；4.福建農(nóng)林大學園藝學院,福建 福州 350002)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii)，隸屬于蘭科(Orchidaceae)蘭亞科(Orchidoideae)開唇蘭屬(Anoectochilus)，是一種多年生草本植物，主要分布于中國、日本、斯里蘭卡、尼泊爾和印度等國，生于海拔50～1 600 m的常綠闊葉林下或溝谷陰濕處[1].金線蓮在我國作為傳統(tǒng)名貴藥材被人們廣泛種植，具有滋陰降火、清熱解毒、祛風除濕、消炎止痛等多種功效，且未發(fā)現(xiàn)毒副作用[2,3].在醫(yī)療上被應用于治療和預防高血壓、腫瘤、糖尿病、小兒發(fā)育不良、風濕病等癥[4].在民間富有“金草”、“藥王”等盛譽[5].從形態(tài)上來看，金線蓮植株小巧優(yōu)雅，金黃色的葉脈呈網(wǎng)狀排列[6]，具有較高的觀賞價值.此外，由于野生金線蓮結實率較低且種子萌發(fā)條件較為苛刻[7]，加上遭受人類活動的長期破壞，目前金線蓮野生資源已經(jīng)處于極其瀕危狀態(tài)，其遺傳保育研究工作刻不容緩.

基因組是一個生物物種所有遺傳信息的總和，基因組大小的測算對象是該物種單倍體核的DNA含量，稱為C值.其單位通常表述為堿基對的數(shù)目(bp)或質(zhì)量(pg)，是植物基本且重要的生物多樣性參數(shù)[8].在每個物種中，細胞的染色體數(shù)和DNA含量即C值是固定的，可用于評估生物體的生物學特征，為其基因組和轉(zhuǎn)錄組學的研究提供依據(jù)，是比較和進化基因組學研究的基礎，還在物種的鑒定、分類和進化等方面有重要意義.常用的基因組C值測算方法有孚爾根光密度測量法、脈沖場凝膠電泳、流式細胞術、實時熒光計量PCR法[9].流式細胞技術借助流式細胞儀和熒光染料，進行細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的定量研究.事先制備好的細胞核懸液，使用特定熒光染料進行染色后，于設定的壓強下進入流式細胞儀的流動室.細胞呈單列排序，經(jīng)由噴嘴噴出形成液流，細胞液流與入射激光束相交被激發(fā)出熒光，利用濾片收集各個細胞的熒光強度，測得的熒光強度即可換算出待測樣品的細胞核DNA含量[10].該技術操作簡便高效、結果精準，屬于目前基因組大小測定的主流方法.

目前，關于蘭科植物分子生物學、基因組學層面的研究才剛剛起步，一些重要類群的基因組基本信息仍舊缺乏，與遺傳育種相關的研究還相對滯后.作為藥用、保育及觀賞價值較高的蘭科物種，亟待對其細胞遺傳學和分子生物學等層面進行研究，探索其遺傳基礎和進化規(guī)律.對于開唇蘭屬植物的基因組DNA的C值含量和基因組大小的評估尚未開展.本研究建立基于流式細胞技術測定金線蓮基因組大小的測定方法和流程，估算了金線蓮的DNA含量，為后續(xù)金線蓮和開唇蘭屬植物的全基因組測序提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自福建農(nóng)林大學森林蘭苑的蘭科種質(zhì)資源圃保存的福建野生金線蓮，嫩葉為試驗待測對象,福建農(nóng)林大學海峽聯(lián)合研究院基因組與生物技術研究中心的雞紅細胞核(chicken erythocyte nuclei,CEN,DNA 2C含量為2.5 pg)作為內(nèi)標.

1.2 試劑、耗材和儀器設備

試驗所用到的主要試劑、耗材及儀器包括：LB01分離緩沖液[11]、Galbraith′s分離緩沖液[12]、WPB分離緩沖液[13]、碘化丙啶(propylene iodide,PI)熒光染色劑、雞紅細胞核(chicken erythocyte nuclei,CEN)、RNAase(美國，Sigma公司)、過濾膜(孔徑30 μm)、培養(yǎng)皿(直徑5 cm)、雙面刀片、試管(10 mL)、微量離心管(Eppendorf公司，1.5 mL)，及FACScalibur流式細胞測定儀(美國Becton-Dickinson,San Jose,CA公司)、Micro CL17型微量臺式離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司).

1.3 緩沖解離液和熒光染料的制備

分別選用LB01分離緩沖液、Galbraith′s分離緩沖液、WPB分離緩沖液(表1)，對金線蓮的新鮮嫩葉進行裂解測試，從中篩選最適合的金線蓮細胞測定的解離液.碘化丙啶(PI)具有非特異性標記作用，可作為細胞核熒光染料，進行基因組的絕對值測量[14]，使用的終濃度為50 μg·mL-1，存放于4 ℃冰箱中備用.在檢測核DNA含量前，需排除RNA干擾.因此在上機測定前需提前添加RNAase(工作液濃度50～150 μg·mL-1，貯存液1 mg·mL-1，-20 ℃保存)以降解RNA.

表1 3種細胞核裂解液的配方[11-13]Table 1 Components of 3 nuclear lysis buffers[11-13]

1.4 細胞核懸液制備與DNA特異性染色

細胞核懸液的制備與細胞核染色參照Dolezel et al[14]的方法進行.取金線蓮的新鮮嫩葉4份，每份約0.5 g.用于放置的培養(yǎng)皿提前預冷，分別置入1 mL預冷的LB01、Galbraith′s、WPB分離緩沖液，使金線蓮葉片完全沒入液體中.用鋒利雙面刀片垂直迅速切碎并輕輕抽打，使得細胞核游離出細胞，過程中盡量避免小氣泡產(chǎn)生.吸取培養(yǎng)皿中含有細胞核的解離液于孔徑30 μm濾膜，進行過濾，后收集濾液至1.5 mL微量離心管管中.通過冷凍離心機800 r·min-1離心5 min，棄掉上清，倒置于紙上將殘存液體瀝干，收集沉淀的細胞，再加入150 μL預冷解離液.將待測樣品與對照標樣CEN進行混合制樣(等比例混勻)，吸取250 μL混合液，逐次加入RNAase和0.5 μL預冷的PI染料(終濃度100 μg·mL-1)，進行熒光染色.輕輕晃動后置于4 ℃冰箱，避光孵育染色30 min，即可上機檢測.

1.5 流式細胞儀檢測和基因組大小估算

通過流式細胞測定染色的細胞核懸浮液的熒光強度，所用儀器為美國BD公司產(chǎn)FACScalibur流式細胞儀.儀器提前預熱30 min，上機前樣品再手動振蕩 5～10 s，設置參數(shù),PI激發(fā)波長為488 nm.通過掃描PI染色的1 000個懸浮的細胞核，收集FL2通道的熒光(FL2-A)，每個樣品重復4次，測得其熒光強度.PI染色劑嵌入DNA堿基對中，嵌入量信息反饋在熒光強度上，并和DNA含量形成正相關[15].每次檢測結束之后，用清洗液和去離子水充分清潔.有研究表明[16]，CEN的DNA 2C含量為2.5 pg，選擇CEN為內(nèi)標作對照，固定其橫坐標，與待測樣品金線蓮充分混勻后進行檢測，即可根據(jù)峰的位置，參考已知基因組大小的CEN進行比對，從而測得金線蓮基因組大小.隨后根據(jù)流式細胞儀測得的圖像和1 000個細胞核的測算數(shù)據(jù)，使用儀器自帶的CellQuest軟件進行處理分析，獲得金線蓮測定樣本及內(nèi)標的G0/G1期的峰值.最后按照下列公式，計算出金線蓮的基因組DNA含量：

2 結果與分析

2.1 分離緩沖液和參考標準的篩選

流式細胞技術簡便高效，上機結果直觀明晰.但在此之前，對細胞核懸浮液的選擇有較高的要求.不同的分離緩沖液對待測材料的解離效果具有差異，本研究需要找到更適合金線蓮的解離液.結合前人研究，本研究選取3種常用解離液(LB01分離緩沖液、Galbraith′s分離緩沖液、WPB分離緩沖液)進行比較，由于植物細胞有細胞壁及眾多細胞器，蘭科植物更是富含高濃度的淀粉和多糖、多酚等物質(zhì)，這對核懸液提出了更高要求.針對這些特點進行嘗試選用，結果發(fā)現(xiàn)Galbraith′s分離緩沖液對金線蓮幼嫩葉片的解離效果更好，較為完整地釋放了細胞核，且細胞碎片較少，干擾熒光少；而LB01、WPB分離緩沖液的解離效果一般.結合變異系數(shù)(CV值)，最后得出Galbraith′s分離緩沖液最優(yōu)；用CEN作為參照標準(內(nèi)標)與金線蓮嫩葉樣品混合后進行流式細胞測定，發(fā)現(xiàn)測試樣品與內(nèi)標粒子的區(qū)分明確、清晰，且出峰穩(wěn)定，無重疊峰，峰型集中.因此使用CEN作為內(nèi)標測定金線蓮基因組大小方法合理，結果可靠.

2.2 基因組C值和大小的測定結果

以CEN為內(nèi)標測定4組金線蓮樣品(圖1).其中二維散點圖中FSC-H通過前向角散射信號強度揭示細胞大小；直方圖中FL2-A顯示染色后熒光信號的相對強度，Counts值表示計數(shù).本研究根據(jù)混合樣品中CEN和待測金線蓮樣品的PI發(fā)射熒光強度的差異和峰值之間的相對關系，可計算得到：金線蓮基因組的2C DNA含量為(6.83±0.067 )pg(表2).為確保結果的可靠性，共進行4次生物學重復測量，觀測浮動值，以確保測量的穩(wěn)定性.另外，通過核DNA的含量換算(1 pg=0.978 Gb)可得金線蓮的基因組為(3.34±0.033) Gb.

3 討論

1983年，Galbraith et al[12]首次建立流式細胞術測定植物DNA C值的方法.如今，隨著高通量測序技術的高速發(fā)展，越來越多的人們開始對不同物種進行基因組測序研究.因此需要更便捷高效的方法對植物基因組大小進行前期估算、探索基因組特征.流式細胞技術經(jīng)過不斷改進，已成為測定植物基因組大小的標準方法[17].流式細胞技術也在植物遺傳及育種研究中取得了廣泛的應用，不僅可以對基因組大小進行測定，而且可以對植物的倍性和生殖途徑進行鑒定和分析[18].通過流式細胞技術測基因組大小，操作簡便高速，能得到準確直觀的結果，可重復性強，是一種高通量技術手段.但用流式細胞技術測定植物基因組大小時，也出現(xiàn)過相同物種的測定結果間有所差異的案例[14,19]，這與多方面因素有關.測定具有核內(nèi)多倍性的植物以及具有漸進式局部核內(nèi)再復制(progressively partial endoreplication)的植物(如蘭科)基因組大小時,技術上的挑戰(zhàn)更大[20].因此在試驗中應當充分考慮樣品制備、細胞裂解方法和參標選擇、混樣染色等問題，盡可能減小誤差.

圖1 金線蓮和雞紅細胞混合樣品流式細胞檢測結果Fig.1 FCM detection images for the mixed samples of A.roxburghii and chicken erythocyte nuclei

表2 金線蓮的DNA 2C含量測定結果Table 2 Results of the 2C values for A.roxburghii

首先，在測定前，選擇新鮮的金線蓮幼嫩葉片作為試驗材料.使用幼嫩的植物組織可以有效避免組織成熟、老化后帶來的更高濃度的淀粉、多糖、多酚或其他代謝產(chǎn)物，減小誤差.樣品的制備和保存需要多加注意.

其次，裂解液(分離緩沖液)的選取也是相當重要的，適當?shù)牧呀庖耗芤种坪怂崦?、維持細胞核的完整性并能提供核酸染料染色最佳條件，使測定結果更加準確.目前國際上還沒有通用的植物細胞核裂解液，不同種屬、植物的不同部位所需要的裂解液也各不相同[21].因此本試驗中，結合前人研究，選取3種裂解液進行嘗試.試驗中發(fā)現(xiàn)Galbraith′s分離緩沖液的裂解效果最好，WPB分離緩沖液、LB01分離緩沖液效果相對一般.可以推測可能和Galbraith′s分離緩沖液中含有MgCl2有關，MgCl2可作為染色質(zhì)穩(wěn)定劑，保持細胞核的穩(wěn)定，并且其含有檸檬酸鈉和TritonX-100等物質(zhì)，能進行通透處理，有效清洗，減少金線蓮中富含的糖類、多酚等黏性雜質(zhì)，防止其與細胞核黏連[22]，降低了測定時信號的干擾，且其化學性質(zhì)比較溫和，也保障了細胞核的穩(wěn)定[23].WPB分離緩沖液雖然也含有MgCl2，但是裂解后細胞碎片較多，CV值較高，WPB還是更適用于木本植物細胞核的裂解.如經(jīng)多次嘗試發(fā)現(xiàn)結果仍不理想，應考慮對現(xiàn)有分離緩沖液的配方進行改進，尋找其他成分以期獲得更佳的細胞核裂解效果.

分離緩沖液制備后,選擇PI作染料進行熒光染色.PI染色劑可嵌入金線蓮細胞核的DNA，充分激發(fā)出熒光，供給流式細胞儀檢測.PI染料也是目前DNA流式細胞術的常規(guī)染料.近年來，有毒性較低、分辨率更高的新染料出現(xiàn)，值得進行更多試驗和推廣[17].

在選擇內(nèi)標時，本研究使用CEN作為內(nèi)標來測定金線蓮的C值，所用內(nèi)標均采用同一批標準樣本.測定結果表明，CEN與待測樣品無重疊峰，區(qū)分度較好，用其作為內(nèi)標估算金線蓮基因組大小，準確可靠.同時，為了降低試驗誤差，測試材料均為活體植株新長出的幼小葉片.如具備更好試驗條件，內(nèi)標選擇已知基因組大小的植物,會更為適合.盡量保證內(nèi)標物與待測樣品的基因組大小相近,但又不宜太近,防止混樣后測得的熒光峰重合.Dole?el et al[14]在所著文中提及的標準包含8種DNA含量在1.10～34.89 pg的植物，已經(jīng)穩(wěn)定用于植物基因組大小的測定.其研究機構——捷克共和國實驗植物學研究所分子細胞實驗室，以種子的形式向全球科研者免費提供這些標準植物樣本.這些植物的細胞學性質(zhì)穩(wěn)定，少有次級代謝產(chǎn)物，且種類常見，是很好的參照材料.汪琛穎等[24]使用流式細胞術，以鐵皮石斛為參標，以Galbraith′s緩沖液為解離液，測出蘭科蘭屬的蕙蘭(Cymbidiumfaberi)基因組DNA 2C含量為8.98 pg.該試驗也指出Galbraith′s緩沖液裂解對參標鐵皮石斛和待測材料蕙蘭的解離效果均最優(yōu).這與本試驗對蘭科金線蓮的測定相類似，可互為佐證.

目前，蘭科植物的細胞遺傳學、分子生物學和組學的研究多集中于傳統(tǒng)熱帶蘭品種，如蝴蝶蘭屬(Phalaenopsisssp.)和文心蘭屬(Oncidiumssp.)[25]，而對開唇蘭屬的研究極少.已有研究主要集中在對其生理生化指標(如成分含量)等進行評價[26-28].作為開唇蘭屬最為珍稀瀕危的金線蓮，其藥用、觀賞和保育價值非常顯著，因此應該加強對其相關領域的研究.2009年首個蘭科植物的全基因組草圖公布后[29]，經(jīng)過數(shù)年各方努力，科學家們克服了蘭科植物基因高雜合度的技術難題，陸續(xù)完成了4種蘭科植物的全基因組序列的組裝和分析，包括小蘭嶼蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris)[30]、鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)[31-32]、深圳擬蘭(Apostasiashenzhenica)[33]、天麻(Gastrodiaelata)[34]等，獲得了高精度的基因組序列圖譜和大量的基因信息.作為被子植物第二大科[33]，蘭科植物在適應環(huán)境，不斷進化中形成了極高的豐富度，成為科學家們研究的熱點，各類群全基因組序列的破譯及進化基因組學的研究將為揭示蘭科植物的起源、進化及重要創(chuàng)新性狀的遺傳基礎及其分子機理提供強大的基因工具包.本研究利用流式細胞術，對金線蓮基因組大小的測算方法進行探索，最后成功估測金線蓮的C值和基因組大小.由于不同于模式植物，蘭科開唇蘭屬在研究和試驗上的參照數(shù)據(jù)有限，對金線蓮基因組基本特征的研究可為其進一步的分子生物研究、種質(zhì)保育、基因挖掘等提供依據(jù).隨著測序成本的大幅下降，對開唇蘭屬植物進行全基因組測序已可提上日程.通過對金線蓮的基因組大小的測定，可提前預估測序成本，并為其測序方法、組裝策略的選擇等提供依據(jù)，也為將來開唇蘭屬植物的細胞遺傳學、分子生物學、基因組和轉(zhuǎn)錄組學等研究提供依據(jù).