新疆褐牛與安格斯牛胴體及肉質(zhì)性狀及脂代謝相關基因表達差異比較

陳俐靜，陳卓，李娜，孫亞偉，李紅波，宋雯雯，張楊，姚剛

（1新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院, 烏魯木齊 830052；2新疆畜牧科學院畜牧研究所，烏魯木齊 830011）

0 引言

【研究意義】肉牛養(yǎng)殖業(yè)是新疆畜牧業(yè)主導產(chǎn)業(yè)，新疆褐牛及其雜交牛是新疆肉牛業(yè)主導品種之一。目前，新疆褐牛及其雜種后代總存欄數(shù)約為150萬頭，純種新疆褐牛占總數(shù)的 30%左右[1]。隨著人們生活質(zhì)量的提高，牛肉作為重要的肉食品，優(yōu)質(zhì)、高檔牛肉供不應求[2-3]。牛肉的食用品質(zhì)主要包括嫩度、多汁性和風味[4]。而影響畜肉品質(zhì)的因素有很多，其中肌內(nèi)脂肪（intramuscular fat，IMF），又稱為大理石花紋，其含量會影響牛肉的食用品質(zhì)[5-6]。高水平的 IMF含量很可能會增加油脂含量和肌紅蛋白的氧化[7]，進而影響肉色。適當?shù)靥岣?IMF含量，可以提高肌肉的嫩度、多汁性等食用品質(zhì)[8]。因此，調(diào)控IMF的沉積成為提高肉品質(zhì)的一個重要途徑[9]?！厩叭搜芯窟M展】瘦素（leptin，LEP）基因多態(tài)性已經(jīng)被作為肉牛的大理石紋、背膘厚度、嫩度、胴體重、牛肉質(zhì)量評價等性狀的候選基因[10]。SCHENKEL等[11]研究發(fā)現(xiàn)肉牛產(chǎn)肉率、背膘厚度和嫩度與 LEP基因顯著相關。說明 LEP可作為評定肉品質(zhì)及肉質(zhì)脂肪沉積的指標。脂肪酸合成酶（fatty acid synthesase，F(xiàn)AS）在脂肪代謝中主要作用是合成長鏈脂肪酸，而激素敏感酯酶（hormone-sensitive lipase，HSL）則是脂肪分解的關鍵限速酶[12]。FAS、HSL和脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）基因mRNA表達與皮下脂肪、IMF沉積存在密切相關[13-14]。HILLER等[13]研究發(fā)現(xiàn)FAS、LPL和HSL基因mRNA表達與皮下脂肪、IMF沉積存在密切相關。JEONG等[14]研究了韓國肉牛16個脂肪代謝相關基因，證明FAS、LPL和HSL基因表達與IMF代謝均呈顯著相關，其中LPL基因上調(diào)可增加脂肪細胞膜對脂肪酸的攝取，從而增加IMF沉積。脂肪酸結(jié)合蛋白 4（fatty acid-binding protein 4，F(xiàn)ABP4）是脂肪細胞型脂肪酸結(jié)合蛋白，能在脂肪細胞中沉積甘油三酯，增加IMF的含量。FABP4基因與肉牛IMF沉積、大理石紋形成密切相關[15-17]。【本研究切入點】由于新疆褐牛遺傳背景復雜，其IMF沉積能力、大理石紋含量、嫩度等與脂肪代謝相關的肉品質(zhì)形成機理等方面缺乏與國內(nèi)外優(yōu)良肉牛品種的比較研究?！緮M解決的關鍵問題】本試驗選取新疆褐牛與安格斯肉牛進行屠宰性狀、肉品質(zhì)及其脂代謝相關基因的比較研究，探明新疆褐牛與安格斯肉牛上述關鍵體脂代謝基因mRNA和蛋白表達的脂肪組織和品種差異性，為今后改善新疆褐牛的肉品質(zhì)性狀奠定科學基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究動物飼養(yǎng)試驗在新疆某集約化肉牛養(yǎng)殖場進行。2016年12月選取生長發(fā)育正常、健康，品種特征明顯的新疆褐牛（Xinjiang brown cattle，XBC）和純種安格斯牛（Angus beef cattle，ABC）3月齡斷奶公犢各7頭，單獨分欄組群，專人負責，按照該場統(tǒng)一飼養(yǎng)管理方式飼養(yǎng)，于2018年9月達到24月齡后進行屠宰。

1.2 儀器設備與試劑

儀器設備：背膘測定儀（Mylab Touch vet）；顯微鏡（NIKON）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9140A）；半自動切片機（LEICA CM3050 S）；Motic顯微成像系統(tǒng)（Advance 3.5軟件）；光學顯微鏡BA400（Motic實業(yè)集團有限公司）；離心機5415D（Eppendrof）；PCR儀PTC-225（Bio-Rad）；凝膠成像系統(tǒng)CBC/UVP I-D001（CapitalBio）；實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）；超聲波細胞破碎儀JY92-2D（寧波新芝生物科技股份有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-30KBS（上海申安醫(yī)療器械廠）；恒溫培養(yǎng)振蕩器TS-2102C（上海智城分析儀器制造有限公司）；酶標儀DG5031（上海齊欣有限公司）。

試劑：苦味酸購自臺山粵橋試劑有限公司；固體石蠟、蘇木素、尹紅、中性樹膠均購自中國上海標本模型廠；mirVana miRNA Isolation Kit、r-Taq 酶、cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix、Micro Amp Optical 96-well Reaction Plate、Micro Amp Optical Adhesive Covers 4311971均購自abm（Master Mix-EL）公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白變性緩沖液、SDS-PAGE凝膠試劑盒、化學發(fā)光顯色液均購自 Thermo Fisher公司；小鼠抗beta-actin單克隆抗體ab6276、小鼠抗LPL單克隆抗體ab21356、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠ab97240均購自Abcam公司；大鼠抗FAS單克隆抗體05-351購自 Merck Millipore公司；兔抗 HSL單克隆抗體NBP1-76735購自Novus公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗大鼠abs20031購自Absin公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔111-305-003購自Jackson公司。

1.3 方法

1.3.1 采樣 前述24月齡XBC和ABC各7頭試驗牛在屠宰前一天，采用背膘儀活體測定背膘厚度、眼肌面積和肌內(nèi)脂肪參數(shù)，并進行活體稱重，記錄耳標號。試驗牛經(jīng)待宰圈12 h禁食后，進入屠宰車間自動化屠宰，測定胴體及產(chǎn)肉性狀。并采集背最長肌和皮下脂肪等相關樣品液氮保存后于實驗室進行后續(xù)指標測定。

1.3.2 胴體性狀

胴體重：除去頭、皮、尾、蹄、內(nèi)臟所余體軀重量；

凈肉重：胴體除去骨胳之后的凈肉和脂肪的重量；

屠宰率=胴體重/活重×100%；

凈肉率=凈肉重/活重×100%；

肉骨比=胴體凈肉重/骨骼重×100%。

用背膘儀測量肌間脂肪、背膘厚度、眼肌面積。

1.3.3 肉品質(zhì)性狀 利用色度儀對每塊背最長肌測定肉色，分別記錄肉樣的亮度（L*）值、紅度（a*）值和黃度（b*）值；IMF根據(jù)《食品中脂肪的測定》（GB 5009.6—2016）測定；水分根據(jù)《食品中水分的測定》（GB 2019.3—2016）測定；灰分根據(jù)《食品中灰分的測定》（GB 5009.4—2016）測定；剪切力根據(jù)《肉嫩度的測定 剪切力測定法》（NY/T 1180—2006）測定。

1.3.4 肌肉及皮下脂肪形態(tài)學測定 肌肉及皮下脂肪制備常規(guī)石蠟切片，H.E染色[18]。利用 Motic Advanced 3.5顯微成像系統(tǒng)觀察并測量肌肉及皮下脂肪，借助FastStone Capture軟件[19]計算細胞單位面積及數(shù)量。

1.3.5 脂代謝相關基因的mRNA表達

（1）組織樣本總RNA提取

1）在液氮預冷砂漿中取30—50 mg最長的肌肉樣品，充分研磨成液氮，加入1 mL Trizol，混勻后冰上靜置5 min裂解并轉(zhuǎn)入新EP管。

2）加入0.2 mL預冷過的氯仿，混勻15—30 s，冰上靜置2—3 min。

3）4℃離心，12 000g×15 min，分層。

4）吸清液400—500 μL并加入0.5 mL異丙醇，將管中液體輕輕混勻，-80℃靜置30 min。

5）4℃離心，12 000g×15 min。

6）棄上清，加入75%乙醇（冰冷）1 mL，振搖，4℃離心，12 000g×5 min。

7）棄上清，短暫離心，棄剩余上清。

8）加入適量（20—30 μL）DEPC（Rnase Free）H2O溶解RNA，測濃度，儲存-80℃。

（2）基因組消化和反轉(zhuǎn)錄 基因組消化的反應體系：1 μg 總 RNA，2 μL 5×gDNA buffer，42℃、3 min。

反轉(zhuǎn)錄用cDNA第一條鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄1 μg總RNA成cDNA，反應體系：2 μL 10×Fast-RT Buffer，2 μL FQ-RT Primer Mix，1μL RT Enzyme Mix，5 μL RNase-Free Water，加入消化產(chǎn)物總體積20 μL，反應條件：42℃、15 min，95℃、3 min，-80℃保存。

（3）熒光定量PCR引物 使用DNAMAN軟件設計引物[20]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，信息見表1。

（4）檢測 LEP、FAS、FABP4、HSL、LPL基因轉(zhuǎn)錄水平測定 利用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒和Quant Studio Flex Real Time PCR system儀器進行相對定量。反應體系如表2。

表1 引物信息Table 1 Primer information

表2 熒光定量PCR反應體系Table 2 RT-PCR reaction system

反應條件：95℃預變性 10 min，95℃、15 s，95℃、1 min，40個循環(huán)。每個試驗組設定3個重復，擴增結(jié)束用ABI 7500 Fast軟件收集CT值并用2-△△CT分析目的基因表達水平，用內(nèi)參基因Beta-actin矯正。

（5）實時熒光定量PCR產(chǎn)物電泳檢測擴增特異性

取擴增產(chǎn)物 4 μL 與 4 μL 2×Loading buffer混勻，電泳條件為120 V，15 min。

1.3.6 肌肉與皮下脂肪組織Western blot測定

（1）提取總蛋白方法參照RIPA裂解液說明書進行。

（2）用酶標板法測定蛋白濃度，操作參照 BCA蛋白定量試劑說明書進行。

（3）制膠槽灌入分離膠，無水乙醇壓平膠平面，待分離膠凝固后加入濃縮膠。凝固后每孔加40 mg蛋白，電壓80 V，待蛋白跑過濃縮膠將電壓調(diào)成120 V，直到溴酚藍指示劑跑至分離膠底部。

（4）取電泳分離條帶，參照蛋白Marker切下目的基因和內(nèi)參條帶。按照濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙的順序，每層之間不能有氣泡。確保正負極連接正確，電壓120 V開始轉(zhuǎn)膜。

（5）將PVDF膜放入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。封閉后PVDF膜用TBST緩沖液浸洗3次，每次5 min，分別加入第一抗體（均按1﹕1 000稀釋）置于脫色搖床4℃孵育過夜。次日取出PVDF膜用TBST緩沖液浸洗5次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記的第二抗體（均按1﹕1 000稀釋），置于脫色搖床室溫孵育2 h。

（6）按照ECL顯色液說明書配制顯色液，避光顯色 1 min，用化學發(fā)光凝膠系統(tǒng)曝光后，確定最佳曝光條件、采集圖像。用Image J軟件處理目的條帶，計算灰度值，以 Beta-actin為管家基因計算目的條帶的相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用平均值±標準誤（Mean±SE）表示。采用GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software公司，美國圣地亞哥）統(tǒng)計軟件對兩品種間進行獨立樣本非配對 T檢驗統(tǒng)計分析并作圖。兩組間不同小寫字母表示P<0.05，不同大寫字母表示P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 XBC和ABC胴體性狀比較

由表 3可見，XBC凈肉率極顯著高于 ABC（P<0.01），而背膘厚度顯著低于 ABC（P<0.05）。XBC與ABC體重、胴體重、凈肉重、骨重、屠宰率、肉骨比、肌間脂肪等胴體性狀品種間無顯著差異（P>0.05）。

2.2 XBC和ABC肉品質(zhì)性狀比較

由表 4可見，XBC肉色亮度 L*顯著低于 ABC（P<0.05），XBC肉色澤偏暗，其余肉色a*、b*均差異不顯著（P>0.05）。XBC與ABC水分、灰分、IMF、嫩度均差異不顯著（P>0.05）。

2.3 XBC和ABC背最長肌及皮下脂肪組織形態(tài)比較

由表5、圖1所示，XBC肌纖維直徑和單根肌纖維橫截面積均顯著大于ABC（P<0.05），而肌纖維密度無明顯差異（P>0.05）。由表6、圖2所示，XBC皮下脂肪單位面積脂肪細胞個數(shù)極顯著多于 ABC（P<0.01），而皮下脂肪細胞面積兩品種牛之間差異不顯著（P>0.05）。

表3 XBC和ABC胴體性狀比較Table 3 Comparison of carcass traits between XBC and ABC

表4 XBC和ABC部分肉品質(zhì)性狀比較Table 4 Comparison of meat quality traits between XBC and ABC

圖1 XBC與ABC背最長肌斷面，H.E染色（10×20）Fig. 1 Slice of longissimus dorsi in XBC and ABC, H.E stain(10×20)

2.4 XBC和ABC背最長肌和皮下脂肪組織中脂代謝相關基因的mRNA表達

由圖3可知，XBC與ABC背最長肌和皮下脂肪5個基因mRNA表達量差異不顯著（P>0.05）。

圖2 XBC與ABC皮下脂肪切片，H.E染色（10×20）Fig. 2 Slice of the subcutaneous fats in XBC and ABC, H.E stain (10×20)

2.5 XBC和ABC FAS、HSL、LPL蛋白在背最長肌和皮下脂肪組織中的表達差異

如圖4所示，利用Western blot檢測XBC與ABC背最長肌和皮下脂肪組織中LEP、FABP4、HSL、LPL、FAS蛋白表達水平，只檢測到FAS、HSL、LPL蛋白表達，與預期條帶一致。由圖5可知，XBC背最長肌組織中FAS的蛋白表達量極顯著低于ABC（P<0.01），HSL蛋白表達量也顯著低于ABC（P<0.05）；而皮下脂肪組織中只有 HSL蛋白表達量顯著低于 ABC（P<0.05）。

表5 XBC和ABC背最長肌肌纖維組織學測量Table 5 Histological measurement results of longissimus dorsi in XBC and ABC

表6 XBC和ABC皮下脂肪組織細胞面積和數(shù)量比較Table 6 Comparison of the cell area and the quantity of adipose tissue between XBC and ABC

圖3 兩品種牛背最長肌與皮下脂肪中LEP、HSL、LPL、FAS、FABP4基因mRNA相對表達量Fig. 3 The mRNA expression levels of LEP, HSL, LPL, FAS and FABP4 gene in longissimus dorsi and subcutaneous fat between XBC and ABC

圖4 Western blot檢測FAS、HSL、LPL蛋白的表達水平Fig. 4 The expression level of FAS, HSL and LPL proteins detected by Western blot

3 討論

3.1 XBC和ABC胴體性狀比較

胴體性狀是評價肉牛產(chǎn)肉性能的重要指標。張明[21]比較了安西雜牛（黑安格斯?！廖鏖T塔爾牛）與西門塔爾牛凈肉率和背膘厚度，結(jié)果顯示安西雜牛的凈肉率和背膘厚度顯著高于西門塔爾牛，并且表明安西雜牛產(chǎn)肉性能較好。本研究發(fā)現(xiàn) XBC凈肉率極顯著高于 ABC，而背膘厚度顯著低于 ABC。說明不同品種牛之間胴體性狀確實存在差異，XBC產(chǎn)肉性能較好。

圖5 XBC和ABC背最長肌與皮下脂肪中FAS、HSL、LPL蛋白相對表達量比較Fig. 5 The differential expression level of FAS, HSL and LPL proteins in longissimus dorsi and subcutaneous fat between XBC and ABC

王國富等[22]比較了36月齡ABC、海福特牛和中國西門塔爾牛3個品種牛的胴體性狀，結(jié)果顯示ABC和海福特牛背膘厚度極顯著高于中國西門塔爾牛，并說明 ABC和海福特牛脂肪沉積能力可能比中國西門塔爾品種牛強。本研究發(fā)現(xiàn) XBC背膘厚度顯著低于ABC，說明ABC的脂肪沉積能力可能較強。

3.2 XBC和ABC肉品質(zhì)性狀

肉品質(zhì)是涉及肉品的表觀、質(zhì)地、風味的綜合性狀，主要衡量指標包括肉色、風味物質(zhì)、大理石花紋、嫩度、硬度、多汁性以及pH、系水力、肌肉纖維結(jié)構(gòu)等[23-25]。胡猛等[26]比較了荷斯坦公牛與西門塔爾牛、XBC及新疆土種牛的肉色，結(jié)果顯示荷斯坦奶公牛的肉色 L*顯著高于西門塔爾牛、XBC和新疆土種牛。閆向民等[27]比較了不同月齡 XBC的肉色，發(fā)現(xiàn)高月齡組肉色L*顯著小于低月齡組，且高月齡組肉色優(yōu)于低月齡組。本研究發(fā)現(xiàn) XBC肉色指標 L*顯著低于ABC，說明XBC肉色優(yōu)于ABC。

肌纖維特性影響肉的嫩度，肌纖維直徑越小，纖維密度越大，則肉的嫩度越好。曹芝等[28]研究了草原紅牛及夏洛萊牛、西門塔爾牛、紅安格斯牛的高代雜種牛背最長肌纖維組織學結(jié)構(gòu)的差異及與嫩度的關系，結(jié)果顯示紅安格斯雜交牛的肌纖維直徑最小，肌節(jié)長度最長，說明其嫩度最好。本研究結(jié)果顯示XBC肌纖維直徑和單根肌纖維橫截面積均顯著大于ABC，提示與XBC相比，ABC嫩度較好。

脂肪組織的形成和在不同部位的沉積直接影響肉品質(zhì)和產(chǎn)肉性能，細胞大小與大理石花紋密切相關[29]。ALBRECHT等[30]研究表明11月齡以后牛的脂肪細胞數(shù)量相對穩(wěn)定，脂肪細胞的沉積主要是由于脂肪細胞體積的增大。本結(jié)果顯示XBC與ABC皮下脂肪組織細胞面積無顯著差異，可 XBC皮下脂肪組織中單位面積脂肪細胞個數(shù)極顯著多于ABC，提示XBC脂肪組織細膩程度高于ABC，這可能與XBC背膘厚度顯著低于ABC有關。

3.3 XBC和ABC 5種脂肪代謝調(diào)控相關基因及其產(chǎn)物的表達

大量研究表明，LEP可以促進甘油三酯轉(zhuǎn)化，抑制脂肪酸從頭合成、刺激脂肪酸氧化來抑制脂質(zhì)在脂肪細胞中積累，因此LEP與肌內(nèi)脂肪的沉積有關。BONNET等[10]比較了 ABC、利木贊牛、日本和牛與安格斯雜交牛3個品種肌內(nèi)脂肪LEP基因mRNA表達水平，結(jié)果表明3個品種皮下脂肪組織中LEP基因mRNA表達差異不顯著。而FABP4也是影響牛肉和肌內(nèi)脂肪含量的候選基因之一[31]。魏勝娟等[32]研究FABP4對牛脂肪細胞分化影響時發(fā)現(xiàn)FABP4正向調(diào)控脂質(zhì)代謝。ALBRECHT等[30]連續(xù)檢測了10—22月齡日本和牛與荷斯坦牛皮下脂肪組織中FABP4mRNA表達水平，結(jié)果表明這一階段這兩個品種牛皮下脂肪組織中FABP4表達沒有變化。FAS作為甘油三酯合成過程的關鍵酶，F(xiàn)AS基因表達水平的高低對肌內(nèi)脂肪的沉積會產(chǎn)生一定的影響。曲桂娟等[33]比較了3種雜交牛背最長肌FASmRNA表達量，發(fā)現(xiàn)在3個品種間FASmRNA表達差異不顯著。本試驗測定結(jié)果顯示 XBC與 ABC皮下脂肪與背最長肌中LEPmRNA、FABP4mRNA和FASmRNA表達均無品種間顯著差異，這可能與本試驗測定的XBC和ABC肌內(nèi)脂肪含量無顯著差異有關。但戢爽[34]在比較延邊黃牛和延黃牛FASmRNA表達中發(fā)現(xiàn)延黃牛顯著高于延邊黃牛的結(jié)果與前述研究者和筆者的結(jié)果不一致，可能是因為品種差異所致。

脂肪沉積是一個合成與分解動態(tài)平衡過程，HSL基因和 LPL基因在脂肪分解過程起關鍵作用。REN等[35]報道在荷斯坦與夏洛來牛網(wǎng)膜脂肪和皮下脂肪組織中LPLmRNA表達差異不顯著，但未研究肌肉中的LPLmRNA表達。本結(jié)果表明XBC與ABC皮下脂肪中LPLmRNA表達差異不顯著，與上述結(jié)果相似。

3.4 XBC和ABC 5種脂肪代謝調(diào)控相關蛋白表達

趙稱赫[36]研究表明蒙古牛肌內(nèi) FAS的活性相對較強。其實驗結(jié)果表明蒙古牛背最長肌FAS表達量顯著高于西門塔爾，F(xiàn)AS表達量與肌內(nèi)脂肪含量存在正相關。本結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。本試驗發(fā)現(xiàn)XBC背最長肌組織中FAS蛋白表達量極顯著低于ABC，可能與XBC背膘厚度顯著低于ABC有關，其相關性有待進一步研究。

HSL是動物脂肪代謝過程中的關鍵酶。有研究表明HSL與肌內(nèi)脂肪含量存在正相關，并且會促進肌內(nèi)脂肪的沉積[37]。本結(jié)果表明XBC皮下脂肪組織中HSL蛋白表達量顯著低于ABC，背最長肌組織中HSL蛋白表達量顯著低于安格斯牛，說明 ABC脂肪沉積能力高于XBC。

LPL在脂蛋白的運輸過程和能量代謝方面發(fā)揮著重要作用。BONNET等[10]報道利木贊牛皮下脂肪中LPL表達水平顯著高于安格斯，指出LPL表達可能存在種間差異性。王剛等[38]也驗證豬肌肉組織中LPL表達與肌內(nèi)脂肪含量顯著正相關，且品種不同其LPL與肌內(nèi)脂肪含量相關程度不同。本結(jié)果表明XBC與ABC LPL在皮下脂肪和背最長肌表達差異不顯著。

FAS和 HSL分別為胴體脂肪合成代謝與分解代謝過程中的限速酶。在本試驗中 ABC在皮下脂肪和背最長肌中FAS、HSL蛋白表達均顯著高于XBC。說明ABC脂肪沉積能力強。

4 結(jié)論

本研究比較發(fā)現(xiàn)新疆褐牛產(chǎn)肉性能較好；但純種安格斯牛肉色較亮，且嫩度較好。純種安格斯牛脂肪沉積能力強。兩品種間脂代謝相關基因產(chǎn)物、脂肪酸合成酶和激素敏感酯酶蛋白差異可能與純種安格斯牛背膘厚度差異有關。