快速檢測(cè)梅花鹿黏膜病病毒的免疫膠體金試紙條研究

崔鶴馨，田來明，李男，田鑫，付曉霞

（長春市農(nóng)業(yè)科學(xué)院長春 130111）

鹿黏膜?。―MD）是由黏膜病病毒（MDV）引起的幼鹿嚴(yán)重腹瀉、母鹿繁殖性障礙的疾病，不利于幼鹿的良性發(fā)育，降低成鹿的生育能力，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致鹿大量病死。既往有研究證實(shí)[1]，MDV 是導(dǎo)致牛發(fā)病的主要病原之一，也能造成羊、鹿等很多反芻動(dòng)物染病。當(dāng)下國內(nèi)很多地區(qū)的鹿群養(yǎng)殖階段有程度不一的MDV 感染情況，一經(jīng)感染，病原長時(shí)間無法清除，以致養(yǎng)鹿行業(yè)承受較重?fù)p失，不利于行業(yè)可持續(xù)的發(fā)展進(jìn)程，故而應(yīng)予以DMD 一定重視，加大快速檢測(cè)診斷方法的研究力度。

1 材料和方法

1.1 材料

1）試劑與耗材：膠體金試紙條材料套裝、氯金酸；

2）儀器：攪拌器、電子天平、干燥箱、高壓鍋以及電鏡等；

3）主要試劑類型：10%HAuCl4溶液、10%NaCl 溶液以及碳酸鉀0.2mol/L 等。把以上試劑整合至容積為10mL 的離心管內(nèi)，充分?jǐn)嚢韬笥谜麴s水定容到10mL，低溫（-20℃）條件下保存以備用。再把以上制備的試劑加進(jìn)500mL 燒杯中，加熱攪拌至完全溶解，自然冷卻后，將其pH 調(diào)節(jié)到8.3，定容到500mL。

1.2 方法

首先，制備20nm 膠體金溶液。提取兩個(gè)整體硅化的200mL 三角燒瓶，依次兌入50mL 四蒸水溶液，安置在攪拌器上加熱處理到沸騰。而后依次加入100μL 的10%的氯金酸、2.5mL 檸檬酸鈉溶液，使溶液最后顏色穩(wěn)定在酒紅色。針對(duì)制備好的膠體金溶液予以冷卻處理后，用0.21μm 予以過濾處理，借助透射電鏡觀測(cè)膠體金顆粒狀態(tài)。

其次，依照常規(guī)方法組裝膠體試紙條。即在滴加品滴加后，溶液會(huì)自行朝向吸水板方向流動(dòng)，于金標(biāo)墊位置，BVD/MDV 會(huì)和膠體金探針相整合，溶液持續(xù)朝向前方流動(dòng)，與BVD/MDV 相結(jié)合的金標(biāo)抗體于檢測(cè)線位置會(huì)結(jié)合一種抗BVD/MDV 的單抗（1B11），此時(shí)檢測(cè)線上就會(huì)形成膠體金溶液匯聚情況，進(jìn)而呈現(xiàn)出相應(yīng)顏色。

再者，確定試紙條的檢測(cè)線和質(zhì)控線的最適宜濃度。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，IgG、1F11 株單抗對(duì)應(yīng)的濃度依次是1 和1.5mg/mL，且被包裹在試紙條內(nèi)時(shí)，測(cè)線和質(zhì)控線形態(tài)優(yōu)良，色澤適中。

最后，采用免疫膠體金試紙條檢測(cè)DMD。在遼寧省某鹿場(chǎng)養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)收集30 份鹿糞等設(shè)為樣本，編號(hào)為1～30，各樣品均取用適量鹿糞，兌入適量PBS 溶液以使其呈懸浮狀態(tài)，量取180μL 溶液滴加到試紙條附帶的樣品墊上進(jìn)行檢測(cè)。針對(duì)樣品內(nèi)剩余溶液，取用適量，trizol 法捕獲RNA 并合成cDNA，用BVD/MDV 特異性引物PCR 擴(kuò)增。膠體金檢測(cè)與PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)階段均設(shè)置1 份陽性與陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 膠體金溶液制備

溶液呈酒紅色，清澈透亮。透射電鏡檢查階段測(cè)得金顆粒大小約為20nm，均勻分布。

2.2 免疫膠體金試紙條檢測(cè)DMD

PCR 擴(kuò)增結(jié)果提示，陽性檢出樣品8 份（26.7%），陰性為22 份（73.3%）。膠體金試紙條檢測(cè)結(jié)果和PCR 檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)一。

3 討論

現(xiàn)階段，國家相關(guān)部門已頒發(fā)了DMD/MDV 的防控計(jì)劃，并在畜群層面上取得一定成效，很多防控措施是多維性的，單純依靠疫苗接種等單一方面通常無法取而預(yù)期成效。為有效防控DMD/MDV，制定周全策略，最先做的工作便是了解病毒有關(guān)臨床表現(xiàn)及對(duì)畜牧業(yè)形成的影響。若想要從一個(gè)畜群內(nèi)徹底清除DMD/MDV 的目標(biāo)范疇，需突破的難點(diǎn)是防控病毒侵入為感染DMD/MDV 的牲畜，為達(dá)成以上目標(biāo)，通常會(huì)采用多樣化的診斷檢測(cè)、疫苗免疫及生物安全計(jì)劃等措施。故而應(yīng)從了解畜群DMD/MDV 感染狀況、現(xiàn)行管理辦法及后續(xù)階段可能新引進(jìn)的措施等方面做出判斷。

膠體金顆粒內(nèi)徑大小影響抗體標(biāo)記及后期試紙條檢測(cè)環(huán)節(jié)的精確度、敏感性。既往有報(bào)道指出，伴隨膠體金顆粒內(nèi)徑的擴(kuò)增過程，膠體金探針在溶液內(nèi)的安穩(wěn)性有跌落趨勢(shì)；但內(nèi)徑過小，也不利于維持金顆粒的均勻性、分散度，也會(huì)降低試紙條的穩(wěn)定性。故而，在制取膠體試紙條階段，推薦把顆粒調(diào)控為20nm，通常能取得較優(yōu)良的檢測(cè)結(jié)果。

本次試驗(yàn)研究階段，選用檸檬酸三鈉還原法制取了20nm 膠體金溶液，電鏡檢查提示顆粒呈圓形，直徑基本上均是20nm 左右，均勻分布，提示成功制取了膠體金溶液。選擇疑似MDV 感染的30 份臨床樣品加以檢測(cè)，結(jié)果提示試紙條與PCR 陽性檢出率一致，均為26.7%。并且經(jīng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)研究階段制備的試紙條特異性優(yōu)良。最低能檢測(cè)出103TCID50/mL 的病毒濃度，在MDV 感染檢測(cè)領(lǐng)域中有一定推廣價(jià)值。█