一例鴨傳染性漿膜炎病原的分離與鑒定

賈仰波

(山東省博興縣畜牧獸醫(yī)局山東濱州 256500)

鴨傳染性漿膜炎也被稱為鴨疫里默氏桿菌病，是由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）感染家鴨、野鴨而引起的一種急性、敗血性傳染病，該病以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎等為主要病理特征，感染鴨多出現(xiàn)食欲廢絕、精神不振、站立不穩(wěn)等神經(jīng)癥狀，嚴(yán)重阻礙病鴨的生長。鴨疫里默氏桿菌主要感染1～8 周齡雛鴨，其中尤以10～30 日齡的雛鴨最為易感，近年來隨著我國鴨飼養(yǎng)量的不斷增加，鴨傳染性漿膜炎發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)逐步上升的趨勢，有研究發(fā)現(xiàn)一旦感染鴨群發(fā)病率可高達(dá)70%，死亡率可高達(dá)80%，因此鴨傳染性漿膜炎是危害當(dāng)前養(yǎng)鴨業(yè)的主要細(xì)菌性傳染病之一。

1 發(fā)病情況

2018 年10 月-2019 年2 月，山東濱州某規(guī)模養(yǎng)鴨場飼養(yǎng)的雛鴨在28 日齡左右持續(xù)發(fā)病。大多數(shù)病鴨表現(xiàn)精神不振、采食量降低、頭頸震顫、排白綠色稀便、站立不穩(wěn)等臨床癥狀，每天死亡40只左右。

2 病理剖檢

隨機(jī)取50 只病死鴨進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)病死鴨大腦水腫出血、腦膜增厚，部分病死鴨出現(xiàn)纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎等，其他臟器沒有明顯的病變。根據(jù)臨床癥狀及病理剖檢初步懷疑為鴨傳染性漿膜炎，為進(jìn)一步確定病原菌，無菌條件下采集疑似鴨傳染性漿膜炎病死鴨的肝臟、心臟、腦等組織器官進(jìn)行病原菌分離。

3 病原分離及形態(tài)觀察

無菌條件下將分離的組織病料分別接種到含2%新生牛血清的TSA 培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上，TSA 培養(yǎng)基置于37℃恒溫5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，麥康凱培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況及形態(tài)。結(jié)果肝臟、心臟、腦等組織在含2%新生牛血清的TSA 培養(yǎng)基上均出現(xiàn)了圓形、邊緣整齊、透明的菌落，麥康凱培養(yǎng)基上均無菌落，將分離培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下用油鏡觀察分離菌的染色特性及形態(tài)，結(jié)果均為無芽孢、兩極濃染的革蘭氏陰性小桿菌，主要以單個(gè)桿菌形式存在，偶有長絲狀。

4 生化試驗(yàn)

將分離菌分別接種于微量生化發(fā)酵管，具體操作參考生化反應(yīng)管說明書，結(jié)果分離菌不發(fā)酵乳糖、半乳糖、葡萄糖、果糖，明膠試驗(yàn)結(jié)果為陽性，甲基紅試驗(yàn)、VP 試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、硝酸鹽還原和枸櫞酸鹽試驗(yàn)均為陰性。

5 PCR 鑒定

用已有的根據(jù)RA 16S rRNA 設(shè)計(jì)的通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物 序列 如 下，P1：5'-TTA CCGAC TGAAAATTGCCTT-3'，P2:5'-AGAGGAAGACCGAGGACATC-3'，擴(kuò)增片段為338bp；取純化的分離菌液5mL，5,000rpm 離心5min，棄去上清，再用100μL 無菌的ddH2O 懸浮沉淀后，沸水中水浴10min，5,000rpm離心5min，取上清液作為PCR 模板；PCR 體系為：PCR mix 10μL、上下游引物各0.5μL、模板1μL，補(bǔ)滅菌水至20μL，同時(shí)設(shè)立陰陽性對照，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，95℃變性45s，53℃退火30s，72℃延伸45s，共30 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠板電泳，電泳結(jié)束后，取出凝膠板用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析，結(jié)果與預(yù)期相符，由此可以確定該場雛鴨感染了鴨疫里默氏桿菌。

6 血清型鑒定

挑選單個(gè)菌落接種于含2%新生牛血清的TSA 培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫厭氧罐中靜置培養(yǎng)24 h 后，用8mlTSB 培養(yǎng)基洗下菌液，然后與保存的鴨疫I 型、II 型、10 型、11 型陽性血清進(jìn)行平板凝集，結(jié)果與鴨疫II 型血清出現(xiàn)明顯凝集，由此判定該分離株為II 型鴨疫里默氏桿菌。

7 藥敏試驗(yàn)

將分離菌均勻涂布在含2%牛血清的TSA 上，進(jìn)行常規(guī)藥物的藥敏試驗(yàn)，將強(qiáng)力霉素、大觀霉素、阿莫西林、新霉素、鏈霉素、林可霉素、紅霉素、氟苯尼考、多粘菌素B、頭孢唑肟、青霉素、氨芐西林共12 種藥敏片貼在接種分離菌的平板上，37℃5%CO2微需氧條件下培養(yǎng)24—48h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該分離菌株對大觀霉素、氟苯尼考高度敏感，對頭孢唑肟中度敏感，其余9 種均耐藥。

8 小結(jié)

近幾年隨著我國養(yǎng)鴨業(yè)的快速發(fā)展，鴨傳染性漿膜炎發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)上升的趨勢，大大影響了養(yǎng)鴨業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。在鴨傳染性漿膜炎臨床診斷治療過程中逐漸凸顯出一些問題，結(jié)合此次研究總結(jié)以下幾點(diǎn)：①常誤診斷為鴨大腸桿菌病，因鴨傳染性漿膜炎和鴨大腸桿菌病在臨床癥狀和病理剖檢上極為相似，但兩者的致病菌在培養(yǎng)特性、生化特性等方面差異較大，因此在實(shí)際診斷時(shí)應(yīng)進(jìn)行深入研究予以區(qū)別。本試驗(yàn)將疑似鴨傳染性漿膜炎的分離菌，通過培養(yǎng)特性、形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)、PCR 鑒定、分型鑒定等研究，鑒定分離菌株為II 型鴨疫里默氏桿菌；②實(shí)際養(yǎng)殖過程中鴨傳染性漿膜炎防控的關(guān)鍵措施還是疫苗免疫，但因鴨疫里默氏桿菌血清型眾多，且不同血清型之間缺乏有效的交叉保護(hù)，所以常導(dǎo)致免疫失敗的情況發(fā)生；③發(fā)病后主要依靠抗生素類藥物進(jìn)行治療，由于用藥不科學(xué)、不規(guī)范等眾多原因，使得養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的濫用現(xiàn)象極為嚴(yán)重，除造成藥物殘留外，還導(dǎo)致了大量耐藥菌株的出現(xiàn)，當(dāng)前鴨疫里默氏桿菌的耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，且多重耐藥情況也越來越普遍。因此，本研究在確定病原菌的同時(shí)，通過藥敏試驗(yàn)對該分離株敏感藥物進(jìn)行了篩選，確定大觀霉素、氟苯尼考應(yīng)作為該養(yǎng)鴨場防治的首選藥物，其他藥物可暫停使用，同時(shí)對整個(gè)鴨群開展針對II 型鴨疫里默氏桿菌的疫苗強(qiáng)化免疫，采取措施后，疫情得到有效控制，逐漸好轉(zhuǎn)；④由于養(yǎng)殖環(huán)境、管理模式等因素的不同，不同養(yǎng)殖場鴨傳染性漿膜炎發(fā)病率和死亡率有所差異，發(fā)病情況也有所不同，常發(fā)生鴨傳染性漿膜炎與其他疾病聯(lián)或多種血清型混合感染的情況，因此養(yǎng)殖過程中必須做好有效免疫、科學(xué)用藥等基礎(chǔ)功課，才能有針對性的預(yù)防疫病的發(fā)生。