姬 慧，馮廣朋，黃曉榮，耿 智，莊 平

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海長(zhǎng)江口漁業(yè)資源增殖和生態(tài)修復(fù)工程技術(shù)研究中心，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 200090)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)隸屬于甲殼綱絨螯蟹屬，是一種具有洄游習(xí)性的水生經(jīng)濟(jì)物種，主要在長(zhǎng)江流域等淡水水域棲息生長(zhǎng)，性成熟后洄游到長(zhǎng)江河口淺海水域完成交配產(chǎn)卵。由于環(huán)境污染、生境破壞、過(guò)度捕撈等原因，上世紀(jì)八十年代后中華絨螯蟹天然資源急劇衰退[1]。為了滿足群眾餐飲需要，九十年代以后中華絨螯蟹人工繁殖和池塘養(yǎng)殖逐步興起，目前我國(guó)中華絨螯蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)4×105t。繁殖期是動(dòng)物延續(xù)種群的重要生活史階段，產(chǎn)卵活動(dòng)不僅對(duì)動(dòng)物自身的能量需求較高，而且對(duì)其代謝生理亦有顯著影響。能量代謝是機(jī)體供能的根本途徑，相關(guān)酶活力降低以及代謝中間產(chǎn)物的缺失將阻斷新陳代謝通路，從而對(duì)生物體能量的供應(yīng)造成影響。因此，能量代謝酶可在一定程度上反映動(dòng)物體內(nèi)的能量代謝水平[2]。

目前有關(guān)中華絨螯蟹繁殖期的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[3]、遺傳育種[4]、產(chǎn)卵場(chǎng)分布[5]、食性[6]、增殖放流[7,8]等方面，而對(duì)繁殖期中華絨螯蟹能量代謝酶調(diào)節(jié)的研究較少。本研究以中華絨螯蟹天然群體和養(yǎng)殖群體為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，測(cè)定分析了抱卵前后中華絨螯蟹的性腺、肝胰腺、肌肉等組織中能量代謝酶[己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸脫氫酶(PK)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)、精氨酸激酶(AK)]活力的變化，旨在為探討中華絨螯蟹繁殖期能量代謝調(diào)節(jié)機(jī)制、提升人工養(yǎng)殖技術(shù)、促進(jìn)天然種群資源保護(hù)等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

中華絨螯蟹天然群體抱卵前雌蟹采自江蘇鎮(zhèn)江長(zhǎng)江干流水域(32.11°N，119.27°E，淡水)，抱卵后雌蟹采自長(zhǎng)江口橫沙淺灘水域(31.23°N，121.57°E，鹽度為15)；養(yǎng)殖群體抱卵前雌蟹來(lái)自于江蘇省太湖水域(淡水)，抱卵后雌蟹來(lái)自于江蘇省南通市人工繁殖群體(鹽度為16)。抱卵前雌蟹和抱卵后雌蟹的采集時(shí)間分別為2018年11月和2019年1月。

養(yǎng)殖群體抱卵前雌蟹平均體重為(100.43±8.64) g，平均殼長(zhǎng)為(54.63±1.31) mm，平均殼寬為(60.25±1.29) mm；抱卵后雌蟹(受精卵期)平均體重為(116.18±7.21) g,平均殼長(zhǎng)為(55.38±1.41) mm，平均殼寬為(61.87±2.10) mm。天然群體抱卵前雌蟹平均體重為(60.91±17.95) g，平均殼長(zhǎng)為(47.45±5.08) mm，平均殼寬為(52.45±5.45) mm；抱卵后雌蟹平均體重為(113.88±14.29) g，平均殼長(zhǎng)為(55.20±2.25) mm，平均殼寬為(61.40±2.36) mm。

1.2 樣品采集和測(cè)定

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組選出體重相近、個(gè)體健壯、附肢完整的個(gè)體各15只。在冰盤(pán)上對(duì)每只蟹進(jìn)行解剖，分別取出肝胰腺、肌肉、性腺等組織，迅速放入液氮中進(jìn)行冷凍，再放入-80 ℃冰箱保存待測(cè)。酶活性測(cè)定前取出肝胰腺、肌肉和性腺組織，每個(gè)組織分別測(cè)定HK、PFK、PK、SDH、MDH、AK等6種酶的活性，酶活性測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，測(cè)定方法按照試劑盒操作步驟進(jìn)行，抱卵前雌蟹測(cè)定的試劑盒批號(hào)均為20190112，抱卵后雌蟹測(cè)定的試劑盒批號(hào)均為20190215。

取剪碎的組織樣品約0.2 g，將其放入玻璃勻漿管中，首先加入1.8 mL 0.90%的生理鹽水，利用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿；然后用Allegra X-22R型冷凍離心機(jī)3000 r/min離心10 min；最后稀釋到10%組織勻漿進(jìn)行測(cè)定。HK、PK、PFK、MDH、SDH等酶活力測(cè)定使用UNICO-UV2000分光光度計(jì)，選用340 nm波長(zhǎng)，采用0.5 cm光徑石英比色皿；AK活力測(cè)定采用鉍鉬磷三元雜多酸體系定磷法。酶活性測(cè)定時(shí)使用華東電子DG5033A酶標(biāo)儀，選用450 nm波長(zhǎng)?？偟鞍缀坎捎每捡R斯亮藍(lán)比色法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用 MS Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 18.0軟件的配對(duì)樣本T檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)及單因素方差分析(one-way ANOVA)，分析養(yǎng)殖群體和天然群體抱卵前后中華絨螯蟹各個(gè)組織中不同酶活性的差異顯著性，差異顯著性用P<0.05表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抱卵前后雌蟹糖酵解酶活性變化

雌蟹抱卵前肝胰腺和肌肉組織中HK活性顯著高于抱卵后。抱卵前后肝胰腺和肌肉組織中PFK活性無(wú)顯著差異。雌蟹抱卵前肝胰腺組織中PK活性顯著高于抱卵后，而抱卵前肌肉組織中PK活性顯著低于抱卵后。在性腺組織中，野生群體抱卵前HK活性(7.30±30.06 U/mg)顯著高于養(yǎng)殖群體(1.89±0.35 U/mg)，但野生群體抱卵前PFK和PK活性均顯著低于養(yǎng)殖群體(表1)。

表1 天然和養(yǎng)殖群體糖酵解酶活性的變化Tab.1 Changes of glycolytic enzymes activity of wild-caught and pond-reared populations

2.2 抱卵前后雌蟹三羧酸循環(huán)酶活性變化

雌蟹抱卵前肝胰腺組織中SDH活性高于抱卵后，但差異不顯著；抱卵前肌肉組織中SDH活性顯著高于抱卵后。雌蟹抱卵前肝胰腺組織中MDH活性顯著高于抱卵后，而抱卵后肌肉組織中MDH活性顯著高于抱卵前。在性腺組織中，養(yǎng)殖群體抱卵前SDH與MDH活性顯著高于野生群體(表2)。

表2 天然和養(yǎng)殖群體三羧酸循環(huán)酶活性的變化Tab.2 Changes of tricarboxylic acid cycle enzymes activity of wild-caught and pond-reared populations

2.3 抱卵前后雌蟹AK活性變化

雌蟹抱卵前肝胰腺組織中AK活性顯著高于抱卵后，而抱卵后肌肉組織中AK活性顯著高于抱卵前。在性腺組織中，養(yǎng)殖群體抱卵前AK活性(0.14±0.01) U/mg,顯著高于養(yǎng)殖群體(0.12±0.01) U/mg(表3)。

表3 天然和養(yǎng)殖群體精氨酸激酶活性的變化Tab.3 Changes of the arginine kinase activity of wild-caught and pond-reared populations

3 討論

3.1 糖酵解酶活性抱卵前后的差異

糖酵解途徑的主要限速酶是HK、PFK和PK，其中HK催化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖[9]，PFK是衡量碳水化合物利用的重要代謝酶[10]，PK在糖酵解中催化磷酸烯醇式丙酮酸生成ATP[11]。本研究中華絨螯蟹天然群體肝胰腺和肌肉組織中，抱卵前雌蟹HK活性顯著高于抱卵蟹，而抱卵前后PFK活性無(wú)顯著差異，表明抱卵前雌蟹比抱卵后利用葡萄糖的能力更強(qiáng)。中華絨螯蟹在長(zhǎng)江口洄游過(guò)程中，需要適應(yīng)河口水域鹽度的變化。雌蟹在抱卵前通過(guò)促進(jìn)體內(nèi)葡萄糖代謝，可以為維持體內(nèi)滲透壓的平衡提供充足能量[12]。而當(dāng)雌蟹抱卵后，處于等滲點(diǎn)狀態(tài)時(shí)用于維持滲透壓平衡的能量會(huì)相對(duì)較少，體內(nèi)的酶活性會(huì)相應(yīng)降低[13]。肝胰腺和肌肉是甲殼動(dòng)物儲(chǔ)存肝糖原和肌糖原的重要組織[14-16]。本研究中天然群體抱卵前雌蟹肝胰腺組織中PK活性顯著高于抱卵蟹，而肌肉中PK活性與肝胰腺相反，表明抱卵前雌蟹以肝胰腺中糖酵解產(chǎn)生的能量供能，而抱卵后肌肉組織中糖酵解產(chǎn)生的能量供給增加。原因是抱卵后雌蟹使用螯足在腹部卵粒周圍持續(xù)撥動(dòng)水流，有利于胚胎快速發(fā)育[17]，從而導(dǎo)致肌肉中PK活性高于抱卵前雌蟹。本研究亦表明，養(yǎng)殖群體雌蟹抱卵前后肌肉中PK活性的變化規(guī)律與天然群體結(jié)果一致，兩個(gè)群體存在同樣的變化規(guī)律。

3.2 三羧酸循環(huán)酶活性抱卵前后的差異

SDH和MDH是三羧酸循環(huán)途徑中調(diào)控脫氫反應(yīng)的關(guān)鍵酶[18]，可在一定程度上反映水生生物的有氧代謝水平[19]。本研究表明，天然群體雌蟹抱卵前肌肉SDH活性和肝胰腺M(fèi)DH活性顯著大于抱卵后，表明抱卵前雌蟹肝胰腺組織有氧代謝比抱卵后更強(qiáng)，這可能是由于抱卵前雌蟹需要將體內(nèi)積累的大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氧化分解，從而釋放充足能量用于產(chǎn)卵繁殖活動(dòng)[20]。有研究亦表明，中華絨螯蟹雌性親蟹在生殖洄游過(guò)程中主要以脂肪作為供能物質(zhì)，代謝率與能量消耗逐漸降低[21]。與肝胰腺組織不同，天然群體雌蟹抱卵后肌肉組織MDH活性顯著高于抱卵前，這是因?yàn)榇菩繁押笫褂抿阍诟共柯蚜Ｖ車掷m(xù)撥動(dòng)水流，有利于胚胎發(fā)育，從而增強(qiáng)了肌肉的有氧代謝，使能量代謝水平升高。本研究結(jié)果表明，養(yǎng)殖群體雌蟹在抱卵前后的肝胰腺和肌肉的SDH與MDH活性變化趨勢(shì)與天然群體一致，這也說(shuō)明了雌蟹抱卵前肝胰腺組織有氧代謝高于抱卵后，抱卵后肌肉組織有氧代謝高于抱卵前。

3.3 精氨酸激酶活性抱卵前后的差異

AK是無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)調(diào)節(jié)能量代謝的重要酶之一[22]，可為調(diào)節(jié)滲透壓平衡提供能量[23]。本研究中天然群體雌蟹抱卵前肝胰腺組織AK活性顯著高于抱卵后，這是因?yàn)楸亚按菩飞钤诘?，而抱卵后雌蟹生活在咸水水域，雌蟹在向長(zhǎng)江口生殖洄游過(guò)程中，需要產(chǎn)生和提供更多能量來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓平衡，這與Serrano等[24]和Kinsey等[25]關(guān)于藍(lán)蟹(Callinectessapidus)的研究結(jié)果一致；另一方面，天然群體抱卵蟹肌肉組織中AK活性顯著高于抱卵前雌蟹，是因?yàn)楸研吩诟共颗咛タ焖侔l(fā)育時(shí)，需要加強(qiáng)螯足在胚胎周圍水流的撥動(dòng)從而，增加了肌肉的能量消耗。Grieshaber等[26]研究表明，AK活性與肌肉細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的能量持續(xù)產(chǎn)生密切有關(guān)，雌蟹肌肉組織的持續(xù)運(yùn)動(dòng)，需要提高AK酶的活性促進(jìn)新陳代謝和能量物質(zhì)分解。本研究中，養(yǎng)殖群體雌蟹抱卵前后肌肉組織中AK活性與天然群體雌蟹的變化趨勢(shì)一致，兩個(gè)群體存在同樣的變化規(guī)律。

4 結(jié)論

在肝胰腺組織中，天然群體和養(yǎng)殖群體抱卵前雌蟹都通過(guò)提高糖酵解酶、三羧酸循環(huán)酶和精氨酸激酶活性，提升體內(nèi)能量的供應(yīng)水平，用于產(chǎn)卵繁殖等機(jī)體活動(dòng)的需要；而在肌肉組織中，兩個(gè)群體抱卵后雌蟹都通過(guò)提高糖酵解酶、三羧酸循環(huán)酶和精氨酸激酶活性水平，用于胚胎孵化、撥動(dòng)水流等機(jī)體活動(dòng)的需要。兩個(gè)群體雌蟹抱卵前都通過(guò)促進(jìn)葡萄糖的利用和增加能量的供應(yīng)，來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體自身的滲透平衡。HK、PFK、PK、SDH、MDH和AK活性都呈現(xiàn)出組織差異性，在能量代謝中發(fā)揮特定作用。因此，在人工養(yǎng)殖和增殖放流中華絨螯蟹時(shí)，可增加優(yōu)質(zhì)餌料供應(yīng)，強(qiáng)化親蟹體內(nèi)脂類、蛋白質(zhì)[27,28]等積累，促進(jìn)其性腺發(fā)育和提升增養(yǎng)殖綜合效益。