謝海平,喻佳俊,黃 清,黃木珍,廖凱儒,李緒鵬,黃澤彬,李佰通，劉 平，李 磊

(1.廣東省漁業(yè)技術(shù)推廣站，廣州 511455；2.暨南大學(xué)質(zhì)譜儀器與大氣環(huán)境研究所，廣州 510632；3.廣州禾信康源醫(yī)療科技有限公司，廣州 510530)

2020年3月初，廣州某水體養(yǎng)殖場的加州鱸(Micropterussalmoides)出現(xiàn)身體潰爛發(fā)病死亡情況，死亡率2%～3%，初步檢查主要癥狀為：反應(yīng)遲鈍、攝食量減少，直至拒食，鰓上黏液有增多現(xiàn)象，身體多處有潰爛斑，潰爛斑周圍發(fā)紅腫脹，肝臟有白色斑點。鏡檢鰓部和體表未發(fā)現(xiàn)寄生蟲。為快速明確疾病原，本研究利用自制的MALDI-TOF MS[9]對從患病加州鱸魚體上分離到的病原菌進行鑒定，并與自動微生物鑒定系統(tǒng)法進行了鑒定對比，以期確定MALDI-TOF MS是否能對水生動物病原菌進行快速鑒定，并為水生動物疾病治療或水體環(huán)境修復(fù)改善提供有效的策略和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

患病加州鱸取自廣州某養(yǎng)殖場，均重1 500 g/尾，體長為40～50 cm。

1.2 試劑與儀器

腦心浸液瓊脂(BHI)培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責任公司)、微生物革蘭氏染色檢測配套試劑(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、藥敏紙片(杭州天和微生物試劑有限公司)、大腸埃希菌ATCC 8739標準菌株蛋白提取液(廣州禾信康源醫(yī)療科技有限公司)、α-氰基-4-羥基肉桂酸、70 %甲酸、乙腈、三氟乙酸；自制的MALDI-TOF MS CMI-1600[9]，較國內(nèi)外同類型儀器相比，其采用近零斜影光路入射、雙脈沖寬質(zhì)量范圍聚焦創(chuàng)新技術(shù)以及高頻固體激光器，具有高分辨率、高靈敏度和高檢測速率等優(yōu)勢；LRH-250生化培養(yǎng)箱(韶關(guān)市明天環(huán)保儀器有限公司)；VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)(法國生物梅里埃)。

1.3 方法

1.3.1 病原菌分離培養(yǎng)

對患病的加州鱸進行解剖，用接種環(huán)分別在肝臟、腎臟、脾部、尾部的腫囊等部位取樣，并劃線接種于腦心浸液瓊脂(BHI)培養(yǎng)基中，置于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。

1.3.2 質(zhì)譜鑒定

MALDI-TOF MS對微生物鑒定基本流程分為樣品制備、質(zhì)譜檢測、譜圖鑒定三個步驟。

(1)樣品制備

采用兩種方法進行樣品制備。第一種為直接涂抹法：用1 μL的接種環(huán)挑取BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)出的單菌落，均勻涂抹在不銹鋼樣品靶上，利用覆蓋法點1 μL基質(zhì)。基質(zhì)溶液制備方法為將10 mg的CHCA基質(zhì)溶解在1 mL含有50%乙腈和2.5%TFA的溶液中，制備成過飽和的CHCA基質(zhì)溶液。第二種為甲酸破壁法：用1 μL的接種環(huán)挑取BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)出的單菌落，均勻涂抹在不銹鋼樣品靶上，而后覆蓋1 μL 70 %的甲酸，待甲酸自然晾干后，利用覆蓋法點1 μL基質(zhì)。在同一樣品靶點1 μL大腸埃希菌ATCC 8739蛋白提取液，覆蓋1 μL基質(zhì)。

(2)質(zhì)譜檢測

樣品制備完成后便可進行質(zhì)譜檢測，MALDI-TOF MS采用正離子模式，加速電壓為22 kV，質(zhì)量范圍設(shè)置為2 000～20 000 Da。采集模式為自動采集，激光能量根據(jù)質(zhì)譜信號強度和譜圖分辨率自動調(diào)諧，每個靶點采集400張有效單譜，而后累加成一張譜圖，累加后的譜圖通過平滑、降噪、峰提取等處理后用于鑒定。根據(jù)GB/T 33682-2017基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜鑒別微生物方法通則，利用大腸埃希菌ATCC 8739蛋白提取液進行譜圖校準。

(3)譜圖鑒定

得到的質(zhì)譜圖經(jīng)過平滑、基線處理等操作后，與數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)指紋圖譜進行對比分析，最終鑒定出微生物屬種。

1.3.3 生化法鑒定

從步驟(1)中培養(yǎng)好的平板上挑取純菌落，制備0.5麥氏單位濃度的菌懸液，利用VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)及其配套的GN鑒定板進行鑒定。

1.3.4 藥敏實驗

將少量細菌接于9‰滅菌后的生理鹽水，讓菌液的濃度達到0.5個麥氏濁度，將菌液涂到平板上，貼上藥敏紙片。將其置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2 結(jié)果

2.1 患病魚種

患病的加州鱸如圖1所示，魚身和鰓蓋有明顯的潰爛痕跡，有囊腫，并且口腔、鰭部有充血點。解剖后，可從魚肝表面發(fā)現(xiàn)被感染的白色小斑點。

圖1 被感染患病的加州鱸Fig.1 Infected Micropterus salmoides

2.2 細菌形態(tài)

分離出的樣本經(jīng)過24 h培養(yǎng)后，在BHI培養(yǎng)基中生長出的細菌菌落呈現(xiàn)為橙黃色，圓形，邊緣整齊，濕潤，表面光滑，菌落凸起，單菌落直徑為2～3 mm。經(jīng)革蘭氏染色鑒定為革蘭氏陰性菌，形狀為短桿狀。

2.3 鑒定分析

利用自制的MALDI-TOF MS對分離培養(yǎng)出的細菌進行質(zhì)譜鑒定，所采集到的質(zhì)譜圖如圖2所示，由圖可知直接涂抹法和甲酸破壁法得到的譜圖質(zhì)譜峰信號清晰明了具有一致性，質(zhì)量范圍集中在2 000～10 000 Da內(nèi)，但甲酸破壁法得到的峰信號強度要優(yōu)于直接涂抹法，是由于甲酸破壁法能夠提取到更多的微生物核糖體蛋白，使得峰強度增加。

圖2 自制MALDI-TOF MS采集到的細菌質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of bacteria by MALDI-TOF MS9分以上表示結(jié)果高度可信，8分以上表示結(jié)果可信，6.4～8分表示結(jié)果可參考，6.4分以下表示無鑒定結(jié)果或結(jié)果不可信

通過將所得譜圖與數(shù)據(jù)庫中的指紋圖譜進行對比分析，質(zhì)控菌和樣品均被成功鑒定出。質(zhì)控菌鑒定結(jié)果為大腸埃希菌，分離培養(yǎng)出的待測菌鑒定結(jié)果為弗氏檸檬酸桿菌。兩種前處理方法對鑒定結(jié)果無區(qū)別，結(jié)果均高度可信，分值在9.2分以上。其中一個樣品的鑒定界面如圖3所示，為弗氏檸檬酸桿菌樣品質(zhì)譜峰與數(shù)據(jù)庫中的質(zhì)譜峰匹配情況，其鑒定結(jié)果通過質(zhì)譜峰的匹配情況算出。

利用基于生化法的全自動微生物鑒定儀對菌落進行確認鑒定。甘露醇、山梨醇、阿拉伯糖、鄰硝基苯-半乳糖苷、硫代硫酸鈉、脲素、KCN試驗結(jié)果為陽性。賴氨酸、色氨酸、明膠試驗結(jié)果為陰性。根據(jù)伯杰細菌鑒定手冊標準菌株的生理生化特征，分離菌株與弗氏檸檬酸桿菌生化表現(xiàn)一致，判讀該菌株為弗氏檸檬酸桿菌。

2.4 藥敏實驗

藥敏結(jié)果如表1所示，該株弗氏檸檬酸桿菌對新霉素、鏈霉素、氟苯尼考、諾氟沙星等藥物較敏感，對環(huán)丙沙星和大觀霉素低度敏感，對強力霉素、紅霉素等有耐藥性。根據(jù)藥敏實驗結(jié)果，對發(fā)病的加州鱸利用氟苯尼考進行治療，用藥后病情得到有效控制。

表1 藥敏試驗結(jié)果Tab.1 Results of drug sensitivity test

圖3 弗氏檸檬酸桿菌的樣品譜峰與數(shù)據(jù)庫中的譜峰匹配情況Fig.3 Match of sample peaks of Citrobacter Freundii with mass spectrum database樣本未匹配表示樣本質(zhì)譜峰信息與數(shù)據(jù)庫峰信息不一致；樣本匹配表示樣本質(zhì)譜峰與數(shù)據(jù)庫中的質(zhì)譜峰結(jié)果一致；結(jié)果匹配表示數(shù)據(jù)庫中的峰信息與樣本峰結(jié)果一致；結(jié)果未匹配表示數(shù)據(jù)庫中的峰信息與樣本峰信息不一致

3 討論

弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)屬于腸桿菌科檸檬酸桿菌屬，是一種革蘭氏陰性短桿菌,在自然界分布廣泛，是人和動物腸道中的正常菌種，但也具有致病性[10]。大量研究表明弗氏檸檬酸桿菌對水體中的魚類[11-14]、蝦蟹[15-21]、龜鱉[22,23]、大鯢[24-27]等動物具有致病性，可引起機體水腫，嚴重時致死。而這些研究采用的微生物鑒定方法為基于生化法的全自動微生物鑒定系統(tǒng)或16S rRNA測序法，鮮有利用MALDI-TOF MS對水產(chǎn)動物致病弗氏檸檬酸桿菌的研究案例。

本研究從患病加州鱸分離出的優(yōu)勢菌株經(jīng)MALDI-TOF MS和全自動微生物鑒定系統(tǒng)兩種方法進行鑒定，鑒定結(jié)果均為弗氏檸檬酸桿菌，兩種方法對比如表2所示，由表2可知生化法鑒定耗時大于6 h，而質(zhì)譜鑒定法耗時僅5 min。從耗材價格上看，生化鑒定法是質(zhì)譜法的20倍。質(zhì)譜法在鑒定耗時、價格和操作復(fù)雜性方面明顯優(yōu)于生化法。結(jié)果表明MALDI-TOF MS對水生動物致病細菌具有快速鑒定的能力，有助于對水產(chǎn)養(yǎng)殖病害進行快速有效地治療。

表2 質(zhì)譜鑒定法和生化鑒定法對比情況Tab.2 Comparison of mass spectrometry methods and biochemical methods