電針對2型糖尿病ZDF大鼠骨骼肌PI3K p85和GLUT4表達的影響*

金永祚，曹昺焱，李 瑞△，張婧怡，宋姍姍，金奉奎

(1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029； 2.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091)

糖尿病患病人數(shù)日趨增多，中國的2型糖尿病(T2DM)流行病學調查結果顯示，成人T2DM患病率為10.9%，40歲以下患病率高達5.9%，發(fā)病已有年輕化傾向[1]。T2DM是以高血糖癥為主要特征并伴胰島素抵抗(IR)或胰島素相對分泌障礙的慢性代謝性疾病。其中IR貫穿于T2DM病程的所有階段，在疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。IR的發(fā)生主要涉及骨骼肌、脂肪、肝臟組織。其中骨骼肌攝取約80%的葡萄糖，是維持恒定血糖平衡和利用葡萄糖的重要組織[2]，因此骨骼肌在IR中占有至關重要的地位。胰島素主要通過磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)信號途徑進行代謝調節(jié)，該途徑與IR相關的T2DM具有密切關系。因此從骨骼肌的PI3K信號途徑探究針刺改善胰島素抵抗的分子機制有重要意義。西醫(yī)對糖尿病的治療主要采用口服降血糖藥和注射胰島素，但使用劑量或用藥不當會出現(xiàn)低血糖，長期服用降血糖藥有損害肝腎功能的危險，難以避免副作用[3]。糖尿病是當前公共健康所面臨的重大問題，已被確定為代謝疾患重點疾病。針刺療法屬于非藥物療法的中醫(yī)學方法之一，其具有多方面優(yōu)勢而無副作用，并已大量實驗表明電針對IR有一定的改善作用[4]。故本實驗通過電針治療自發(fā)性2型糖尿病ZDF大鼠，觀察其對骨骼肌中PI3K之亞基p85和葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

實驗動物為7只體質量140～160 g(2月齡)的SPF級雄性ZL(fa/+)(Zucker Lean)大鼠以及14只同月齡SPF級雄性ZDF(fa/fa)(Zucker Diabetic Fatty)大鼠。全部動物購自北京維通利華公司。動物于23 ℃、空氣流通、相對濕度60%、12 h晝夜循環(huán)光照的條件下飼養(yǎng)。實驗于4周誘導飼養(yǎng)后開始進行，適應性飼養(yǎng)期間，如無特殊需要，動物自由飲食水。按北京維通利華公司建議，在誘導飼養(yǎng)及成模后干預期間，全部動物均以Purina #5008飼料喂養(yǎng)。

1.2 動物飼料

Purina #5008飼料(組成：粗蛋白≥23.0%，粗脂肪≥6.5%，粗纖維≤4.0%，粗灰分≤10%，水分≤11.0%，磷≥0.65%，鈣0.75%～1.25%；原料組成：玉米粉，脫殼大豆粉，小麥粉，魚粉，麥麩，啤酒酵母，蔗糖蜜，麥芽，甜菜粉，燕麥粉，大豆粉，脫水苜蓿草粉，大豆殼粉，礦物質和維生素)。

1.3 實驗耗材及試劑

羅氏ACCU-CHEK血糖儀(LOT 10129770，羅氏血糖健康醫(yī)護公司);羅氏血糖試紙(LOT 24685431，羅氏血糖健康醫(yī)護公司);大鼠[許可證號SCXK(京)2016-0006，北京維通利華實驗動物技術有限公司];中研太和牌針灸針0.13 mm×7 mm (212161123，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司);兔Anti-PI3K p85抗體(Cell Signaling);鼠Anti-GLUT4抗體(Cell signaling)。

2 試驗方法

2.1 動物分組

ZDF大鼠誘導飼養(yǎng)4周后，以空腹血糖(FBG)均>11.1 mmol/L為成模標準。成模的ZDF大鼠依空腹血糖排序隨機區(qū)組分為兩組：模型組，電針組。7只ZL對照大鼠作為對照組。

2.2 治療

2.2.1 對照組及模型組 不干預。

2.2.2 電針組 將動物固定于可伸出四肢的棉布鼠套靜置5 min，以0.13 mm×7 mm針灸針(中研太和牌無菌針灸針)針刺雙側“后三里”“三陰交”“脾俞”“胃脘下俞”。后三里位于大鼠后肢膝關節(jié)外下方當膝骨小頭下5 mm；三陰交位于大鼠后肢內踝尖直上10 mm；胰俞位于第8胸椎棘突下旁開7 mm；脾俞位于第11胸椎棘突下旁開7 mm[5]。直刺深度4～6 mm。連通電針儀(電針一端連接于“胃脘下俞”，一端連接同側“后三里”，形成回路)，連續(xù)波，頻率15 Hz，電流輸出強度2 mA，以大鼠肌肉輕微抖動而不叫為宜，留針20 min，每周6次(周一至周六)，4周。以上各種干預操作均于每日13:00—18:00期間進行，連續(xù)干預4周。干預第4周周六晚20:00禁食，周日早8:00檢測空腹血糖。

2.3 樣本采集及指標檢測

所有動物于全部干預結束后，自由飲食水，于實驗結束當晚22:00禁食，次日早8:00以2%戊巴比妥鈉溶液按照45 mg/kg的藥量比腹腔注射麻醉，取部分大鼠股四頭肌，置于-80℃冰箱中保存，用于Western blot法檢測PI3K p85和GLUT4蛋白表達(所有組織均取自動物同一部位)。

2.4 Western blot法檢測骨骼肌中PI3K p85和GLUT4蛋白表達

依據(jù)末次干預后空腹血糖數(shù)據(jù)，每組隨機抽取3樣本，每樣本取100 mg骨骼肌，加入1 mL含蛋白磷酸酶抑制劑的裂解液于研磨器中勻漿后，冰上靜置30 min(期間每5 min渦旋振蕩1次)，4℃環(huán)境10 000 rpm離心15 min，提取上清液配平并煮沸(95℃，5 min)變性后，上樣，電泳(濃縮膠部分電泳條件80 V，30 min)；分離膠(濃度10%)部分電泳條件120 V，60 min。以80 V、70 min的條件將蛋白濕轉至0.45 μm孔徑的PVDF膜上，5%脫脂奶粉的TBST封閉，40 r/min室溫孵育1 h，加入一抗，40 r/min室溫孵育1 h后，于4℃環(huán)境下孵育16 h。此后經(jīng)洗膜，二抗孵育后，于暗室曝光。數(shù)據(jù)處理：以Image J軟件計算條帶IOD(Integrated option density，總灰度值)作為表達量。以GAPDH為內參，計算骨骼肌中PI3K p85和GLUT4相對表達。

2.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差的形式表示，應用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0進行分析，采用單變量統(tǒng)計檢驗方法比較不同組別樣本的差異。對于正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用 ANOVA(多組檢驗)和Student’s t-test(兩組檢驗)進行分析; 對于非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用Kruskal-Wallis H-test(多組檢驗)以及Mann-Whitney U test(兩組檢驗)進行分析。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠空腹血糖水平

予4周誘導高質高糖Purina #5008飼料喂養(yǎng)4周后與對照組對比，造模后模型組大鼠和電針組大鼠的FBG顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，模型組大鼠的FBG與電針組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明造模成功。

干預4周后與對照組比較，模型組和電針組血糖仍然顯著升高(P<0.05)，但電針組與模型組對比，明顯降低了FBG的數(shù)值，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

干預4周后與造模后組內對比，對照組無統(tǒng)計學意義;模型組的FBG較造模后FBG顯著升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，但電針組干預4周后的FBG與造模后對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 干預前與治療后各組大鼠FBG比較

3.2 各組大鼠骨骼肌中PI3K p85和GLUT4蛋白表達量比較

與對照組大鼠相比，模型組大鼠骨骼肌PI3K p85、GLUT4蛋白表達顯著降低(P<0.01)；與模型組大鼠比較，電針組大鼠骨骼肌PI3K p85、GLUT4蛋白表達顯著升高(P<0.01)，且差異有統(tǒng)計學意義。說明電針可調節(jié)胰島素信號通路上關鍵分子PI3K p85、GLUT4。 見圖1、表2。

注：A組.對照組；B組.模型組；C組.電針組。圖1 各組PI3K p85、GLUT4蛋白表達情況(Western blot法)

表2 各組PI3K p85、GLUT4蛋白表達量比較

4 討論

T2DM屬于中醫(yī)學“消渴”“消癉”范疇，主要病機為脾腎虧虛、陰虛燥熱，據(jù)此確立健脾補腎、益氣養(yǎng)陰為治療原則。故采用李瑞老師豐富臨床經(jīng)驗而總結的穴組結合電針治療方法，穴組以足三里、三陰交、脾俞和胃脘下俞為主穴，《針灸甲乙經(jīng)·五氣溢發(fā)消渴黃疸第六》曰:“熱中，消谷善饑……足三里主之?！弊闳餅樽汴柮魑附?jīng)之合穴，足陽明之脈氣由此處合入，可補脾胃之氣，使氣津兩生，津液得以敷布而治療消渴。三陰交為肝脾腎之交會穴，疏調足三陰之經(jīng)氣，滋陰健脾、益氣補血、調補肝腎。脾俞和胃脘下俞皆屬于背俞穴，調整與其相應的臟腑功能，可疏通臟腑之氣，恢復其正常功能。胃脘下俞又稱為胰俞?！肚Ы鸱健吩?“消渴，咽喉干，灸胃脘下輸三穴各百壯?！倍^察電針不同穴位對2型糖尿病大鼠空腹血糖的影響，結果表明胃脘下俞較其他穴位降糖效果更優(yōu)[6]。因此該穴組共用，可標本兼治，有健脾益腎、益氣養(yǎng)陰之功效。

骨骼肌為維持機體糖代謝的核心組織，其主要機制為通過對葡萄糖的吸收及糖原分解來維持恒定的血糖水平，在生理情況下，胰島素與骨骼肌細胞膜上的胰島素受體(InR)的α亞基結合，使InR的β亞基發(fā)生自身磷酸化，而胰島素受體底物-1(IRS-1)發(fā)生酪氨酸磷酸化。其與PI3K的p85調節(jié)亞單位相結合后催化p110，激活PI3K，并生成3磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)。而其與PI3K依賴性激酶-1(PDK-1)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(AKT)的PH結構域結合，從而激活PDK-1，使AKT磷酸化被激活。AKT調節(jié)骨骼肌內的葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)轉位，可使胰島素的生物活性得到激活，從而正常進行葡萄糖的攝取，最終完成葡萄糖的轉運[7]。GLUT4在骨骼肌組織中廣泛表達，在細胞表面數(shù)量增多，得到葡萄糖的攝取能力增強。故其在調節(jié)胰島素刺激的骨骼肌組織的葡萄糖轉運中起著核心作用，是預防高血糖的關鍵性分子[8]。PI3K在緩解IR中調節(jié)機體對胰島素敏感性和糖脂代謝中起著重要作用[9]，有研究提示，在敲除機體的PI3K p85基因后會出現(xiàn)嚴重的糖脂代謝紊亂[10]。另外研究提示氧化應激引起PI3K表達量減少，從而阻礙胰島素信號傳遞[11]。故胰島素信號通路中出現(xiàn)障礙，骨骼肌對胰島素信號敏感性降低，而無法正常攝取及利用葡萄糖，最終引起血糖升高。因此該途徑在2型糖尿病發(fā)病中十分重要。

本研究采用了自發(fā)型T2DM模型ZDF大鼠，該模型值得較為完整的復制人類T2DM的發(fā)病過程，針對IR主要信號轉導PI3K途徑進行研究。

本實驗對ZDF模型大鼠電針干預4周，檢測FBG的水平，電針組干預前與干預后比較FBG的水平，差異無統(tǒng)計學意義，但干預后電針組較模型組均有明顯降低(P<0.05)，提示該穴組具有改善糖代謝作用。Western blot檢測各組間骨骼肌PI3K p85、GLUT4蛋白表達水平，模型組大鼠骨骼肌的PI3K p85、GLUT4蛋白表達均較對照組有明顯降低(P<0.01)，表明模型組大鼠骨骼肌內存在胰島素信號傳導障礙，但電針組干預可使其顯著上調(P<0.01)。PI3K、GLUT4為胰島素受體結合后的主要下游因子，通過PI3K通路導致一系列級聯(lián)反應的發(fā)生，故胰島素抵抗發(fā)生時PI3K通路活性會降低。由此結果提示電針能改善ZDF大鼠葡萄糖代謝及胰島素抵抗，是通過提高PI3K信號途徑中PI3K p85蛋白活化而激活PI3K，增加GLUT4蛋白表達和轉位，促進大鼠骨骼肌的葡萄糖吸收及利用。

綜上所述，李瑞老師經(jīng)驗穴組結合電針干預可有效控制ZDF大鼠血糖，改善骨骼肌細胞的胰島素抵抗，其機制可能是通過PI3K、GLUT4通路來實現(xiàn)。本研究有望作為電針干預與其通路作用的理論依據(jù)，但糖尿病是全身系統(tǒng)疾病，需要更多樣本對更多靶器官及與上游因子的關系進一步闡明。