梁智豪，陳智謙，陳 辰，周益帆，楊 驍，趙 杰

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院骨科，上海市骨科內(nèi)植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200011

椎間盤(pán)退行性變（intervertebral disc degeneration, IDD）是導(dǎo)致慢性下腰痛的主要病因之一[1]，給我國(guó)公共衛(wèi)生事業(yè)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。雖然目前IDD 的發(fā)生機(jī)制并未完全闡明，但普遍認(rèn)為IDD 與椎間盤(pán)（intervertebral disc, IVD）內(nèi)環(huán)境炎癥狀態(tài)的改變密切相關(guān)[3-4]。通過(guò)抑制炎癥通路延緩IDD 進(jìn)展，已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

人參皂苷Re 是人參皂苷的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化及抗癌等多種功效[5-7]。人參皂苷Re 通過(guò)抑制Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase, JNK）及核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）等炎癥通路發(fā)揮作用[8]，在治療心肌纖維化、心力衰竭[9]、腎功能衰竭[10]、酒精性肝損傷[11]等多種疾病中被證實(shí)有效。此外，研究[12]顯示，人參皂苷在抑制關(guān)節(jié)軟骨的降解中具有明顯的效果，可能具有治療軟組織炎癥的功效。

在本研究中，我們探究了人參皂苷Re 是否可以延緩IDD 進(jìn)展及其是否具有治療作用，通過(guò)可引起IVD 退變的炎癥因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的刺激，利用體外髓核（nucleus pulposus, NP）細(xì)胞和體內(nèi)大鼠尾椎針刺模型共同探究人參皂苷Re 的潛在作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 NP 細(xì)胞

大鼠NP 細(xì)胞由美國(guó)Rush 大學(xué)醫(yī)學(xué)中心骨科陳棣教授贈(zèng)送。細(xì)胞在添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的高糖培養(yǎng)基（DMEM）中培養(yǎng)(Gibco, Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))。

1.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)NP 細(xì)胞炎癥及代謝相關(guān)基因的表達(dá)

將NP 細(xì)胞以1×105/孔的密度種植在6 孔板24 h，按照12.5、25 和50 μmol/L 濃度加入人參皂苷Re，2 h 后加入10 ng/mL TNF-α；對(duì)照細(xì)胞只加入TNF-α。24 h 后，按照說(shuō)明書(shū)使用TRIzol 試劑（Thermo Fisher Scientific, 美國(guó)）從NP 細(xì)胞中提取RNA。使用cDNA 合成試劑盒（Takara Bio, 日本)從提取的RNA 中反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈互補(bǔ)DNA (cDNAs)。使用GoTaq 1-step RT-qPCR 系統(tǒng)（Promega, 美國(guó)）和瓊脂糖凝膠電泳（Bio-Rad Laboratory, 美國(guó)）測(cè)定基因基質(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3, Mmp 3）、血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin 5, Adamts 5）、聚集蛋白聚糖及Ⅱ型膠原a1（collagen type Ⅱ a1, Col2a1）的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。在Applied Biosystems QuantStudio 6 Flex 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific, 美國(guó)）中使用TB Green Premix Ex Taq 試劑盒（Takara Bio, 日本）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）。目標(biāo)基因的表達(dá)水平通過(guò)2－ΔΔCt方法測(cè)定，利用Gapdh 循環(huán)次數(shù)（cycle time, Ct）校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因。qPCR 引物序列見(jiàn)表1。

表1 qPCR 引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)NF-κB 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

將NP 細(xì)胞以1×105/孔的密度種植在6 孔板24 h后，加入人參皂苷Re（50 μmol/L）2 h 后加入TNF-α（10 ng/mL）；以?xún)H加入TNF-α 的NP 細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照，空白對(duì)照細(xì)胞不作處理。TNF-α 刺激10 min 后使用添加了蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的放射免疫沉淀法緩沖液（RIPA）提取細(xì)胞總蛋白（Roche, 瑞士）。使用10%或12.5%的聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠等量溶解提取好的蛋白（20～30 μg），將分離出的蛋白轉(zhuǎn)移至0.22 μm 聚偏二氟乙烯膜上。膜使用含5%牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽溶液（BSA-PBS）在室溫下封閉1 h，然后與一抗（在5% BSA-PBS 中以1:1 000 稀釋?zhuān)┰? ℃孵育過(guò)夜（至少16 h）。p-IKKα (Ser176/180)、IKKα (D3W6N)、p-NFκB p65 (Ser536)、NF-κB p65 (D14E12)、p-IκBα (Ser32)、IκBα (44D4) 及β-actin (13E5) 抗 體 均 購(gòu) 于Cell Signaling Technology（ 美 國(guó)）。 使 用Tris-buffered saline-Tween20 (TBST)洗膜，然后使用二抗室溫黑暗環(huán)境下孵育1 h。再次采用TBST 洗膜，并使用LI-COR Odyssey 熒光成像系統(tǒng)（美國(guó)）檢測(cè)蛋白質(zhì)免疫反應(yīng)性。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對(duì)蛋白免疫反應(yīng)條帶強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，并利用內(nèi)參β-actin 進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.4 動(dòng)物手術(shù)過(guò)程及影像學(xué)觀察

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)SH9H-2020-TK265-1）。12 只8 周齡雄性Sprague-Dawley 大鼠，購(gòu)于上海甲干生物科技有限公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2015-0005，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2013-0087。在26 ～28 ℃、50% ～65% 濕度、12 h 晝夜循環(huán)的無(wú)病原體條件下飼養(yǎng)。動(dòng)物以標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物食物飼養(yǎng)并可獲得淡水。手術(shù)前，通過(guò)腹腔注射苯巴比妥鈉（5 mg/100 g）麻醉大鼠。12 只大鼠尾部用碘化聚乙烯吡咯烷酮消毒，然后做背側(cè)縱向皮膚切口，顯露尾椎（Co）6 ～8 的IVD。Co6/7 的IVD 作為假手術(shù)對(duì)照節(jié)段，不進(jìn)行針刺；Co7/8 作為針刺節(jié)段，用20 號(hào)無(wú)菌針垂直于皮膚刺穿IVD 并旋轉(zhuǎn)退出，縫合切口。其中，6 只大鼠作為實(shí)驗(yàn)組，每周腹腔注射50 μmol/L 人參皂苷Re 3 次，每次100 μL；其余6 只大鼠作為對(duì)照組，每周腹腔注射等量PBS。1 個(gè)月后行X 線檢查，使用21 lp/mm 探測(cè)器在前后徑上對(duì)針刺后的IVD 進(jìn)行數(shù)字X 線成像（Faxitron VersaVision, Faxitron Bioptics LLC, 美國(guó)），以上下終板連線為IVD 高度指數(shù)進(jìn)行退變分析。

1.5 免疫熒光染色

1.5.1 檢測(cè)NP 細(xì)胞NF-κB p65 磷酸化情況 將NP 細(xì)胞玻片使用PBS 浸洗3 次，每次3 min；使用4%多聚甲醛溶液固定15 min；再次使用PBS 浸洗3 次，每次3 min；在室溫下使用封閉緩沖液封閉30 min。切片與一抗在4 ℃的濕箱中孵育過(guò)夜；一抗p-NF-κB p65 (Ser536)、DAPI（40835）購(gòu)于Cell Signaling Technology 公司（美國(guó)），按照1:1 000稀釋。第2 日，用PBS 洗滌玻片，然后與1:500 稀釋的Alexa Fluor 594 兔二抗（Cell Signaling Technology, 美國(guó)）在室溫黑暗環(huán)境中孵育50 min。最后用PBS 洗滌玻片、風(fēng)干，并使用熒光淬滅片封閉。在Leica DM4000B 熒光顯微鏡（Leica Microsystems, 德國(guó))下捕獲數(shù)字熒光圖像，并使用Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行積分光密度（integrated option density, IOD）測(cè)量。

1.5.2 檢測(cè)尾椎組織TNF-α、MMP 3、聚集蛋白聚糖及COL2A1 蛋白的表達(dá) 處死所有大鼠，取出尾部，清理軟組織，并將尾椎使用4%多聚甲醛溶液固定。組織切片在二甲苯中脫蠟、乙醇溶液中復(fù)水，然后在37 ℃的抗原修復(fù)緩沖液（Roche, 瑞士）中孵育30 min。冷卻至室溫后，將切片浸泡于pH 值7.4 的PBS 中，洗滌3 次，每次5 min。加入自動(dòng)熒光淬滅劑5 min，然后在室溫下使用封閉緩沖液封閉30 min。切片與一抗在4 ℃的濕箱中孵育過(guò)夜。一抗p-NF-κB p65 (Ser536)、DAPI (40835)、TNF-α (D2D4)、MMP 3 (D7F5B) 購(gòu) 于Cell Signaling Technology公司（美國(guó)），聚集蛋白聚糖（EPR14664）及COL2A1（EPR12268）購(gòu)于艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，均按照1:1 000 稀釋。第2 日，用PBS 洗滌切片，然后與1:500稀釋的Alexa Fluor 594 兔二抗（Cell Signaling Technology，美國(guó)）在室溫黑暗環(huán)境中孵育50 min。最后用PBS 洗滌切片、風(fēng)干，并使用熒光淬滅片封閉。在Leica DM4000B熒光顯微鏡（Leica Microsystems, 德國(guó))下捕獲數(shù)字熒光圖像，并使用Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行IOD 測(cè)量。

1.6 番紅固綠及蘇木精-伊紅染色觀察IVD 形態(tài)變化及組織學(xué)評(píng)估

將固定好的IVD 組織標(biāo)本（5 μm 厚）包埋于石蠟切片內(nèi)。組織切片在二甲苯中脫蠟、乙醇溶液中復(fù)水，然后在37 ℃的抗原修復(fù)緩沖液（Roche）中孵育30 min。冷卻至室溫后，將切片浸泡于pH 值7.4 的PBS 中，洗滌3次，每次5 min。將切片分別進(jìn)行番紅固綠及蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, H-E）染色。在Olympus TH4-200顯微鏡（Olympus, 日本）下使用Olympus DP Controller 捕獲數(shù)字圖像。參考相關(guān)文獻(xiàn)[13]，通過(guò)評(píng)估數(shù)字圖像纖維環(huán)形態(tài)、纖維環(huán)和NP 之間的交界處形態(tài)、NP 細(xì)胞密度及正中矢狀面基質(zhì)狀態(tài)，對(duì)IDD 進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)（每項(xiàng)1 ～3 分，總分為4 ～12 分，4 分為健康，12 分為嚴(yán)重退變）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)或重復(fù)測(cè)量，數(shù)據(jù)以x±s 表示。符合正態(tài)分布的2 組間定量比較采用成組t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Re 體外對(duì)NP 細(xì)胞炎癥因子的作用

TNF-α 刺激24 h 后，NP 細(xì)胞炎癥相關(guān)基因Mmp 3 和Adamts 5 表達(dá)上升（P=0.000），而軟骨相關(guān)基因聚集蛋白聚糖和Col2a1 的表達(dá)則下降（P=0.000）。經(jīng)50 μmol/L 人參皂苷Re 作用后，與單用TNF-α 的細(xì)胞比較，Mmp 3 和Adamts 5 表達(dá)明顯下降，聚集蛋白聚糖、Col2a1 表達(dá)明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000），且此作用具有濃度依賴(lài)性（圖1）。

圖1 人參皂苷Re 對(duì)Mmp 3、Adamts 5、聚集蛋白聚糖、Col2a1 基因表達(dá)的影響Fig 1 Effect of ginsenoside Re on gene expressions of Mmp 3, Adamts 5, aggrecan and Col2a1

2.2 人參皂苷Re 對(duì)NF-κB 通路的抑制作用

蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2A、C）顯示：在TNF-α刺激10 min 后，NP 細(xì)胞NF-κB 通路上游高相對(duì)分子質(zhì)量IκB 激酶 IKK 復(fù)合體磷酸化，p-IKKα 蛋白表達(dá)升高；p-IκBα 蛋白和p-p65 蛋白表達(dá)顯著升高（均P=0.000）；加入50 μmol/L 人 參 皂 苷Re 后，p-IκBα 蛋 白 和p-p65 蛋 白與單純使用TNF-α 刺激的NP 細(xì)胞比較，表達(dá)量顯著降低（均P=0.000）。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：TNF-α 刺激可以促進(jìn)p65 蛋白磷酸化而人參皂苷Re 則可以抑制這個(gè)過(guò)程（圖2B、D）。

圖2 人參皂苷Re 對(duì)NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Effect of ginsenoside Re on expressions of NF-κB pathway-related proteins

2.3 人參皂苷Re 對(duì)大鼠IDD 程度的影響

術(shù)后1 個(gè)月X 線片檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組（腹腔注射PBS）Co7/8 針刺節(jié)段與Co6/7 假手術(shù)節(jié)段相比，椎間隙骨贅增生明顯，椎間隙塌陷；相反，實(shí)驗(yàn)組（腹腔注射50 μmol/L 人參皂苷Re）的大鼠尾椎間隙僅表現(xiàn)為輕度的骨贅增生，且具有良好的高度（圖3A）。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（圖3B）顯示：與相應(yīng)的假手術(shù)節(jié)段相比，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的針刺節(jié)段椎間隙高度均減?。≒=0.034，P=0.032）；但實(shí)驗(yàn)組針刺節(jié)段椎間隙高度大于對(duì)照組（P=0.004）。H-E 染色及番紅固綠染色結(jié)果（圖3C、D）顯示：對(duì)照組大鼠針刺節(jié)段IVD 相較于假手術(shù)節(jié)段退變嚴(yán)重，NP 水分丟失皺縮；而實(shí)驗(yàn)組針刺節(jié)段IVD 相較于假手術(shù)節(jié)段則退變較輕，NP 水分丟失較少，皺縮不明顯。與對(duì)照組針刺節(jié)段相比，實(shí)驗(yàn)組針刺節(jié)段的退變程度明顯改善，組織學(xué)分級(jí)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023，圖3E）。

2.4 人參皂苷Re 對(duì)大鼠IVD 細(xì)胞外基質(zhì)的影響

免疫熒光定量分析結(jié)果（圖4）顯示：在對(duì)照組中，與假手術(shù)節(jié)段相比，針刺節(jié)段的大鼠尾椎IVD 內(nèi)COL2A1及聚集蛋白聚糖含量明顯降低，而MMP 3 及TNF-α 的含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000）。同為針刺節(jié)段時(shí)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的大鼠尾椎IVD 內(nèi)炎癥相關(guān)蛋白MMP 3 及TNF-α 含量較低，而COL2A1及聚集蛋白聚糖含量較高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000）。

3 討論

圖3 人參皂苷Re 對(duì)大鼠IDD 的改善作用Fig 3 Improvement effect of ginsenoside Re on IDD of rats

IVD 位于脊柱椎體的中間，主要由中心富含蛋白多糖呈凝膠狀的NP 組織，以及外周富含膠原的纖維軟骨組織的纖維環(huán)組成[14-15]。IDD 是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程。機(jī)械應(yīng)力因素、遺傳因素、環(huán)境因素、年齡老化以及IVD 炎癥因子如TNF-α[16]等在NP 組織中的浸潤(rùn)等多種原因都會(huì)導(dǎo)致IDD 的產(chǎn)生和加重。這些因素導(dǎo)致IDD 的主要原因是破壞了IVD 中NP 細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)的代謝平衡，使得分解代謝增加而合成代謝減弱。分解代謝的增加會(huì)導(dǎo)致NP細(xì)胞的MMP 和ADAMTS 表達(dá)增加，從而加速了細(xì)胞外基質(zhì)的降解[17]。合成代謝的減弱會(huì)導(dǎo)致NP 細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的減少。降解的細(xì)胞外基質(zhì)無(wú)法維持IVD 的含水量以及承擔(dān)相應(yīng)的應(yīng)力負(fù)荷。這個(gè)過(guò)程同時(shí)伴有NP 組織大量的炎癥因子浸潤(rùn)，而該過(guò)程起主要作用的炎癥因子是TNF-α[18-20]。過(guò)度表達(dá)的炎癥因子和細(xì)胞外基質(zhì)的失平衡互為因果、互相加重。

圖4 人參皂苷Re 對(duì)大鼠IVD 細(xì)胞外基質(zhì)的改善作用Fig 4 Improvement effect of ginsenoside Re on IVD extracellular matrix of rats

對(duì)于IDD 導(dǎo)致的腰痛，根據(jù)疾病的輕重常規(guī)采用從腰背肌鍛煉、口服止痛藥，再到微創(chuàng)或者開(kāi)放手術(shù)的階梯式治療方法[21]。緩解IDD 導(dǎo)致的腰痛，最常用的藥物是非甾體類(lèi)抗炎藥（如雙氯芬酸等）。這類(lèi)藥物可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子暫時(shí)起到緩解腰痛的作用，但是無(wú)法改變IDD的進(jìn)展，并且會(huì)帶來(lái)許多的不良反應(yīng)[22-23]。目前，多種植物來(lái)源的化合物由于其良好的抗炎作用及相對(duì)小的不良反應(yīng)而受到了越來(lái)越多的關(guān)注。人參皂苷Re 主要存在于人參屬藥材當(dāng)中，是一種固醇類(lèi)化合物，作為人參皂苷的主要活性成分，其抗炎和抗氧化等功效已在多種疾病中得到了證實(shí)[9,24-26]。在本研究中，我們探究了人參皂苷Re 在IDD 過(guò)程中所起的保護(hù)作用及其機(jī)制。在炎癥反應(yīng)中，由NF-κB 信號(hào)通路產(chǎn)生的炎癥因子TNF-α 等，加劇了細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖等蛋白的降解，促進(jìn)了MMP 和ADAMTS 等分解代謝蛋白的合成，對(duì)IDD起著重要的作用[27]。而TNF-α 與NP 細(xì)胞的TNF 受體結(jié)合，促進(jìn)了NF-κB 信號(hào)通路進(jìn)一步激活，形成了炎癥反應(yīng)正反饋環(huán)路，加劇了IVD 中的炎癥反應(yīng)。本研究以IDD 中的炎癥因子TNF-α 為核心，探究了人參皂苷Re 在IDD 中的作用。

本研究通過(guò)探究不同濃度人參皂苷Re 對(duì)NP 細(xì)胞增殖的影響，確定了合適的刺激濃度。既往文獻(xiàn)[28-29]報(bào)道，在TNF-α 激活NF-κB 后，引起IKKα 磷酸化，使IκBα 激酶被激活，進(jìn)而導(dǎo)致IκBα 磷酸化，最后IκBα 蛋白被降解，隨后NF-κB 從IκBα 復(fù)合體中分離出來(lái)，NF-κB p65亞單位磷酸化后從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控下游炎癥因子的合成。本研究中的蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示人參皂苷Re 抑制了由炎癥因子TNF-α 引起的NP 細(xì)胞的IKKα、IκBα、p65 的磷酸化，抑制了由TNF-α 引起的IκBα 的降解；免疫熒光結(jié)果表明人參皂苷Re 抑制了由TNF-α 引起的NP 細(xì)胞p65 的核轉(zhuǎn)位。這表明人參皂苷Re 對(duì)NF-κB信號(hào)具有較好的抑制作用。既往許多研究表明，MMP 和ADAMTS 破壞了IDD 患者細(xì)胞外基質(zhì)合成代謝和分解代謝之間的平衡。本研究中，IVD 組織番紅固綠染色結(jié)果顯示人參皂苷Re 對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)具有保護(hù)作用，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示COL2A1、聚集蛋白聚糖表達(dá)降低而MMP 3 表達(dá)升高；說(shuō)明人參皂苷Re 可以部分逆轉(zhuǎn)由TNF-α 刺激導(dǎo)致的分解代謝的增加以及合成代謝的減弱，使得細(xì)胞外基質(zhì)得到較好的保護(hù)。結(jié)合以上結(jié)果，說(shuō)明人參皂苷Re 有效地抑制了IDD 的發(fā)展過(guò)程。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明人參皂苷Re 可以通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路，抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，改善細(xì)胞外基質(zhì)的合成、分解代謝的失平衡，從而延緩IDD 的進(jìn)程。人參皂苷Re 在NP 細(xì)胞中的抗炎作用表明其可以作為IDD 治療的潛在藥物。

參·考·文·獻(xiàn)

[1] Dowdell J, Erwin M, Choma T, et al. Intervertebral disk degeneration and repair[J]. Neurosurgery, 2017, 80(3S): S46-S54.

[2] Zhou MG, Wang HD, Zeng XY, et al. Mortality, morbidity, and risk factors in China and its provinces, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017[J]. Lancet, 2019, 394(10204): 1145-1158.

[3] le Maitre CL, Hoyland JA, Freemont AJ. Catabolic cytokine expression in degenerate and herniated human intervertebral discs: IL-1β and TNFα expression profile[J]. Arthritis Res Ther, 2007, 9(4): 1-11.

[4] Zhang CH, Gullbrand SE, Schaer TP, et al. Inflammatory cytokine and catabolic enzyme expression in a goat model of intervertebral disc degeneration[J]. J Orthop Res, 2020, 38(11): 2521-2531.

[5] Gao Y, Gao CY, Zhu P, et al. Ginsenoside Re inhibits vascular neointimal hyperplasia in balloon-injured carotid arteries through activating the ENOS/NO/cGMP pathway in rats[J]. Biomed Pharmacother, 2018, 106: 1091-1097.

[6] Gao Y, Zhu P, Xu SF, et al. Ginsenoside Re inhibits PDGF-BB-induced VSMC proliferation via the ENOS/NO/cGMP pathway[J]. Biomed Pharmacother, 2019, 115: 108934.

[7] Yao H, Li J, Song YB, et al. Synthesis of ginsenoside Re-based carbon dots applied for bioimaging and effective inhibition of cancer cells[J]. Int J Nanomed, 2018, 13: 6249-6264.

[8] Zhang ZG, Li XY, Lv W, et al. Ginsenoside Re reduces insulin resistance through inhibition of c-Jun NH2-Terminal kinase and nuclear factor-κB[J]. Mol Endocrinol, 2008, 22(1): 186-195.

[9] Wang QW, Yu XF, Xu HL, et al. Ginsenoside Re improves isoproterenol-induced myocardial fibrosis and heart failure in rats[J]. Evid - Based Complementary Altern Med, 2019, 2019: 1-9.

[10] Bikbov B, Perico N, Remuzzi G, et al. Disparities in chronic kidney disease prevalence among males and females in 195 countries: analysis of the global burden of disease 2016 study[J]. Nephron, 2018, 139(4): 313-318.

[11] Lee DY, Kim MJ, Yoon D, et al. Ginseng berry prevents alcohol-induced liver damage by improving the anti-inflammatory system damage in mice and quality control of active compounds[J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(14): 3522.

[12] Lee JH, Lim H, Shehzad O, et al. Ginsenosides from Korean red ginseng inhibit matrix metalloproteinase-13 expression in articular chondrocytes and prevent cartilage degradation[J]. Eur J Pharmacol, 2014, 724: 145-151.

[13] Masuda K, Aota Y, Muehleman C, et al. A novel rabbit model of mild, reproducible disc degeneration by an anulus needle puncture: correlation between the degree of disc injury and radiological and histological appearances of disc degeneration[J]. Spine, 2005, 30(1): 5-14.

[14] Smith LJ, Nerurkar NL, Choi KS, et al. Degeneration and regeneration of the intervertebral disc: lessons from development[J]. Dis Model Mech, 2011, 4(1): 31-41.

[15] Walter BA, Purmessur D, Likhitpanichkul M, et al. Inflammatory kinetics and efficacy of anti-inflammatory treatments on human nucleus pulposus cells[J]. Spine, 2015, 40(13): 955-963.

[16] Wang C, Yu XH, Yan YG, et al. Tumor necrosis factor-α: a key contributor to intervertebral disc degeneration[J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2017, 49(1): 1-13.

[17] Wang WJ, Yu XH, Wang C, et al. MMPs and ADAMTSs in intervertebral disc degeneration[J]. Clin Chimica Acta, 2015, 448: 238-246.

[18] Yang W, Yu XH, Wang C, et al. Interleukin-1β in intervertebral disk degeneration[J]. Clin Chimica Acta, 2015, 450: 262-272.

[19] Risbud MV, Shapiro IM. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content[J]. Nat Rev Rheumatol, 2014, 10(1): 44-56.

[20] Johnson ZI, Schoepflin ZR, Choi H, et al. Disc in flames: roles of TNF-α and IL-1β in intervertebral disc degeneration[J]. Eur Cell Mater, 2015, 30: 104-116.

[21] Barrey CY, Le Huec JC. Chronic low back pain: relevance of a new classification based on the injury pattern[J]. Orthop Traumatol: Surg Res, 2019, 105(2): 339-346.

[22] Rasmussen-Barr E, Held U, Grooten WJA, et al. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs for sciatica[J]. Spine, 2017, 42(8): 586-594.

[23] Madigan L, Vaccaro AR, Spector LR, et al. Management of symptomatic lumbar degenerative disk disease[J]. J Am Acad Orthop Surg, 2009, 17(2): 102-111.

[24] Nam Y, Wie MB, Shin EJ, et al. Ginsenoside Re protects methamphetamineinduced mitochondrial burdens and proapoptosis via genetic inhibition of protein kinase C δ in human neuroblastoma dopaminergic SH-SY5Y cell lines[J]. J Appl Toxicol, 2015, 35(8): 927-944.

[25] Jang HJ, Han IH, Kim YJ, et al. Anticarcinogenic effects of products of heatprocessed ginsenoside Re, a major constituent of ginseng berry, on human gastric cancer cells[J]. J Agric Food Chem, 2014, 62(13): 2830-2836.

[26] Liu MC, Bai XY, Yu ST, et al. Ginsenoside Re inhibits ROS/ASK-1 dependent mitochondrial apoptosis pathway and activation of Nrf2-antioxidant response in β-amyloid-challenged SH-SY5Y cells[J]. Molecules, 2019, 24(15): 2687.

[27] Wuertz K, Vo N, Kletsas D, et al. Inflammatory and catabolic signalling in intervertebral discs: the roles of NF-κB and MAP kinases[J]. Eur Cell Mater, 2012, 23:103-119.

[28] Ghosh S, Dass JFP. Study of pathway cross-talk interactions with NF-κB leading to its activation via ubiquitination or phosphorylation: a brief review[J]. Gene, 2016, 584(1): 97-109.

[29] Mitchell S, Vargas J, Hoffmann A. Signaling via the NFκB system[J]. WIREs Syst Biol Med, 2016, 8(3): 227-241.