萬曉春 章桂忠 鄧 湉 陳 倩

(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 生物醫(yī)藥與技術(shù)研究所 深圳 518055)

1 引 言

CD317(BST-2、HM1.24 或 Tetherin)由 BST-2 基因(Gene ID：684，定位于染色體 19p13.2 上)編碼[1]，是一個結(jié)構(gòu)獨特的 II 型跨膜糖蛋白[2]。該蛋白氮端和碳端各有一個膜結(jié)合位點，中間是一個比較大的胞外卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(Extracellular Coiled-coil Domain)，總體呈“橋式結(jié)構(gòu)”橫跨在細(xì)胞膜上[3-4]。氮端單次跨膜(Transmembrane Domain)，胞內(nèi)含有一個較短的胞質(zhì)尾區(qū)(Cytoplasmic Tail)。胞質(zhì)尾區(qū)可與 LRPPRC 或 MARCH8 結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞自噬過程[5-6]，或通過其上的 YxY 基序招募接頭蛋白，發(fā)揮信號激活[7-8]、介導(dǎo)內(nèi)吞[9]以及細(xì)胞骨架調(diào)控等功能[10]；胞外結(jié)構(gòu)域能夠與 ILT7 及一些未知蛋白結(jié)合，發(fā)揮免疫調(diào)控作用[11-14]。碳端通過糖基磷脂酰肌醇基序(Glycosylphosphatidylinositol Motif，GPI Motif)錨定到脂筏(Lipid Raft)上，調(diào)控脂筏動態(tài)及其上錨定蛋白的分布[15-16]。由于這種獨特的結(jié)構(gòu)，CD317 可以通過物理方式將人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)等囊膜病毒(Enveloped Viruses)[3,17]以及外泌體[18]束縛在細(xì)胞表面。切除或突變?nèi)魏我粋€膜結(jié)合位點均會導(dǎo)致 CD317 喪失束縛功能[17,19-21]。而被 CD317 束縛的病毒顆?；蝰v留在細(xì)胞表面，或被宿主細(xì)胞內(nèi)吞后通過泛素依賴途徑降解[22-23]，從而抑制病毒的擴散。此外，CD317 還可以通過激活 NF-κB[24]、增強自然殺傷細(xì)胞(Natural Killer Cell)介導(dǎo)的殺傷、抗體依賴的細(xì)胞毒作用(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity， ADCC)等[25-26]發(fā)揮抗病毒功能，或通過促進(jìn) MAVS 降解抑制 RLR 介導(dǎo)的干擾素產(chǎn)生，控制抗病毒免疫強度從而降低免疫紊亂的風(fēng)險[5]。近年來，越來越多的研究表明，CD317 不僅僅是一個抗病毒蛋白，而且在多種類型的腫瘤中表達(dá)上調(diào)并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，是腫瘤治療的一個潛在靶點[3,27-29]。因此，本文重點關(guān)注 CD317 在腫瘤方面的研究進(jìn)展，總結(jié) CD317 在腫瘤中的表達(dá)模式、作用機制以及靶向策略的相關(guān)研究，以期為腫瘤相關(guān)理論研究、治療策略開發(fā)提供新的思考和方向。

2 CD317 在多種腫瘤中高表達(dá)且與預(yù)后不良直接相關(guān)

1994 年，Goto 等[2]利用單克隆抗體發(fā)現(xiàn)了一個終末分化 B 細(xì)胞的限制性表面抗原，命名為 HM1.24，此即為 CD317。該抗原主要表達(dá)于人骨髓瘤細(xì)胞系、多發(fā)性骨髓瘤以及從多發(fā)性骨髓瘤、華氏巨球蛋白血癥(Waldenstr?m’s Macroglobulinemia)患者的骨髓或外周血中獲取的腫瘤漿細(xì)胞上，而在肝、脾、腎等健康組織中基本不表達(dá)或低表達(dá)。由于這種差異表達(dá)模式，CD317 被認(rèn)為是骨髓瘤治療的潛在靶點[30-31]，引起了領(lǐng)域內(nèi)眾多科學(xué)家的關(guān)注。此后，越來越多證據(jù)表明，CD317 過表達(dá)不僅僅局限在骨髓瘤中，其在子宮內(nèi)膜癌[32-33]、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[34]、乳腺癌[35-37]、胃癌[38-40]、結(jié)腸癌[39,41]、膠質(zhì)瘤[42-43]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[44]、腎細(xì)胞癌[45-46]、胰腺內(nèi)分泌腫瘤[47]、急性 B 淋巴細(xì)胞白血病[48]、以及肝癌[16]等惡性腫瘤中的表達(dá)也顯著上調(diào)，并且表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展、擴散程度或患者不良預(yù)后等指標(biāo)呈正相關(guān)[37,39-41,44-46,49]。不僅如此，在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，利用 siRNA 敲減 CD317 能夠顯著抑制癌細(xì)胞增殖、遷移或促進(jìn)藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，利用 shRNA 或單克隆抗體也能有效抑制小鼠移植瘤的發(fā)生發(fā)展，延長荷瘤小鼠生存期[16,29,39,43,50-53]?；谶@些研究，可以確定 CD317 促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，是一個潛在的治療靶點，因此，不少研究人員開始關(guān)注 CD317 在腫瘤中的表達(dá)調(diào)控及其分子機制，并嘗試開發(fā)靶向 CD317 的抗腫瘤策略。

3 CD317 在腫瘤中過表達(dá)的分子機制

CD317 編碼基因定位于染色體 19p13.2 上，啟動子區(qū)含有多個連續(xù)重復(fù)的 STAT3 結(jié)合位點、多個 AP2 結(jié)合位點以及 ISGF3、IRF1/2/7、CREB、SP1、GATA1、NF-AT 等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點[31,54-55]，因此可以被腫瘤壞死因子 α(TNF-α)、干擾素(INF-α/β、INF-γ)等細(xì)胞因子[56-57]以及 GATA1[54]、未活化的 STAT1[58]等轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)表達(dá)。在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，CD317 過表達(dá)的主要原因也是轉(zhuǎn)錄增強[16,32,34,37]，這可能是腫瘤微環(huán)境中的一些細(xì)胞因子激活了上述轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)致的。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞中的 CD317 表達(dá)水平與 TGF-β 有關(guān)，在惡性程度較低的乳腺癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子 AP2 被 TGF-β 激活并結(jié)合到 CD317 啟動子上從而抑制 CD317 表達(dá)；而在高惡性程度的乳腺癌細(xì)胞中存在 TGF-β 抵抗現(xiàn)象，導(dǎo)致 AP2 活化障礙，CD317 表達(dá)增強[37]。在骨髓瘤中，IL-6 是癌細(xì)胞自分泌/旁分泌的生長因子，能夠促進(jìn) STAT1 和 STAT3 的磷酸化，這可能是骨髓瘤中 CD317 過表達(dá)的主要原因[31]。盡管目前還沒有直接的證據(jù)，但這一猜想已在其他癌細(xì)胞中得到了驗證。Yi 等[59]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞中 CD317 的表達(dá)和啟動子活性都受控于 STAT3 的活化水平。有意思的是，在一些正常細(xì)胞(如人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 HUVEC[56]或外周血單核細(xì)胞 PBMC[60])中，單純的 IL-6 刺激雖然能夠激活 STAT3，但并不能引起 CD317 表達(dá)上調(diào)[60]。該現(xiàn)象提示 IL-6/STAT3 對 CD317 表達(dá)的調(diào)控作用可能具有細(xì)胞特異性，至少在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中存在較大差異，這可能是正常細(xì)胞和癌細(xì)胞基因甲基化程度不同造成的。研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤[42]、乳腺癌[61]以及宮頸癌[62]組織中，CD317 基因的甲基化水平遠(yuǎn)比正常組織低。這種低甲基化狀態(tài)可能使 STAT3 更容易接觸并結(jié)合到啟動子區(qū)，誘導(dǎo) CD317 表達(dá)。此外，腫瘤 CD317 高表達(dá)的另一個原因在于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控異常。研究發(fā)現(xiàn)，CD317 是 miR-451a 和 miR-760 的靶基因，正常情況下 CD317 的表達(dá)被這兩個 miRNA 嚴(yán)格控制。但在腫瘤細(xì)胞中，由于 miR-451a 和miR-760 表達(dá)下調(diào)，對 CD317 的抑制作用被削弱，導(dǎo)致 CD317 過表達(dá)[46,63]。綜上所述，CD317 在腫瘤中的表達(dá)受腫瘤微環(huán)境特異的細(xì)胞因子組成、表觀遺傳差異的影響，在表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄激活以及轉(zhuǎn)錄后等層面被精確調(diào)控。

4 CD317 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制

CD317 在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、凋亡抵抗等方面都有重要的作用(詳見表 1)，但其中的分子機制還不是很清楚。目前已知的受 CD317 調(diào)控的信號通路主要有 NF-κB 和 EGFR 等(圖 1)。2013 年，Tokarev 等[7]發(fā)現(xiàn)，除了束縛病毒，CD317 還具有激活 NF-κB 的功能。該功能的實現(xiàn)依賴于 CD317 胞質(zhì)尾區(qū)的 YxY 基序與 TAK1、TAB1 等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的結(jié)合。Gal?o 等[24]的研究成果進(jìn)一步證實了 CD317 對 NF-κB 的激活作用，不同的是，他們認(rèn)為 CD317 的胞質(zhì)尾區(qū)可能含有一個半免疫受體酪氨酸激活基序(Hemi-Immunoreceptor Tyrosine-Based Activation Motifs，hemITAMs)，

通過 hemITAMs 招募 Syk 從而激活 NF-κB。鑒于 NF-κB 信號在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用[70]，一些研究團隊開始關(guān)注 CD317/NF-κB 信號軸在腫瘤中的作用。2017 年，Kuang 等[68]發(fā)現(xiàn) CD317 在順鉑耐藥的鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，通過激活 NF-κB 信號促進(jìn) BCL-XL 及 Livin 等抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。該研究利用基因干擾技術(shù)敲減 CD317 顯著增強順鉑的抗腫瘤效果，臨床資料分析結(jié)果也顯示，CD317 高表達(dá)的局部進(jìn)展期鼻咽癌患者接受鉑類化療的預(yù)后比低表達(dá)患者差，進(jìn)一步證實了 CD317 介導(dǎo)鼻咽癌的鉑類耐藥。Liu 等[40]也發(fā)現(xiàn)，在體外利用 siRNA 敲減胃癌細(xì)胞 CD317 明顯降低 NF-κB 信號的活化水平，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。除了 NF-κB，EGFR 信號軸是另一條被證實且作用機制較為明確的 CD317 調(diào)控通路。Pham 等[45]發(fā)現(xiàn)，CD317 在腎細(xì)胞癌中過表達(dá)，且表達(dá)水平與腫瘤分期、病理分級以及生存期等相關(guān)，提示 CD317 在腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，敲減腎癌細(xì)胞 CD317 顯著降低 EGFR 及下游 ERK、AKT 活化水平，抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Mukai 等[39]也發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞系中敲減 CD317 能夠降低 EGFR-ERK/AKT 的活化水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。Zhang 等[16]的研究結(jié)果進(jìn)一步證實了 CD317 對 EGFR 信號的調(diào)控作用并較詳細(xì)地闡述了其中的分子機制：CD317 在肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn) EGFR 從脂筏到非脂筏細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位，從而激活 EGFR 及下游 ERK、STAT3 等信號通路，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖及腫瘤發(fā)展(圖 2(a))。此外，CD317 還可以直接激活 ERK 或其他信號通路幫助癌細(xì)胞抵抗環(huán)境壓力(營養(yǎng)缺乏、失巢等)，維持細(xì)胞生存。Mahauad-Fernandez 等[8]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，CD317 二聚體化后通過磷酸化修飾的方式激活，然后招募接頭蛋白 GRB2 促進(jìn) ERK 活化(圖 1)，后者進(jìn)一步將促凋亡蛋白 BIM 磷酸化使其被蛋白酶體降解，抑制腫瘤細(xì)胞失巢凋亡。Li 等[67]的研究發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)壓力下，CD317 可以抑制線粒體損傷及 AIF 釋放、核轉(zhuǎn)位等過程，維持細(xì)胞生存(圖 2(b))，但上游的分子機制尚不清楚。自噬在能量代償及清除受損細(xì)胞器(如線粒體)、維持細(xì)胞生存方面發(fā)揮重要的作用[71]。腫瘤發(fā)展過程中(尤其到了晚期)，癌細(xì)胞往往通過提高自噬水平促進(jìn)增殖或提高其在壓力下的生存能力[72-73]?？紤]到 CD317 具有激活自噬的作用[5-6]，Li 等[67]曾推測 CD317 可能通過自噬幫助癌細(xì)胞清除受損的線粒體，或為其提供能量及大分子前體，促進(jìn)癌細(xì)胞在營養(yǎng)壓力下的生存。但這一猜想在其實驗體系中并沒有得到證實，抑制自噬流對 CD317 維持癌細(xì)胞生存的作用基本沒有影響?？紤]到自噬流的復(fù)雜性以及條件依賴性[69]，目前尚無法確定 CD317 介導(dǎo)的自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

表 1 CD317 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制Table 1 The role of CD317 in tumor development

圖 1 CD317 結(jié)構(gòu)及相關(guān)功能示意圖Fig. 1 Illustration of CD317’s topology and functions

除了影響癌細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程外，CD317 可能還具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的功能。2018年，Yang 等[49]發(fā)現(xiàn) CD317 在頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)中表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)水平與患者預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CD317 表達(dá)水平與組織學(xué)分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理指標(biāo)沒有相關(guān)性，而與免疫檢查點分子 PD-L1、B7-H3、B7-H4 及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(CD68、CD163)高度相關(guān)，提示 CD317 在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中可能通過免疫調(diào)控促進(jìn)癌細(xì)胞的免疫逃逸。此外，CD317 能夠與類漿樹突狀細(xì)胞(pDCs)上的 ILT7 結(jié)合，抑制其活化[12-13]。鑒于在多數(shù)實體腫瘤中，pDCs 以非激活狀態(tài)存在，并參與構(gòu)成免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境[74]，因此猜測 CD317 與 ILT7 的相互作用可能是通過影響腫瘤微環(huán)境中 pDCs 的活性，從而促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸[59-60]。近幾年，本文作者團隊也開展了 CD317 在腫瘤免疫方面的作用研究，發(fā)現(xiàn) CD317 介導(dǎo)了一種新的腫瘤免疫逃逸機制，即通過調(diào)控癌細(xì)胞骨架抵抗免疫殺傷。利用 siRNA 敲減 CD317 后，腫瘤細(xì)胞骨架相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平降低，對穿孔素介導(dǎo)的透膜效應(yīng)及免疫殺傷也更為敏感(圖 2(c)，待發(fā)表)。因此，靶向 CD317 能夠增強腫瘤免疫治療效果。綜上所述，CD317 可以通過影響癌細(xì)胞生物學(xué)行為(細(xì)胞增殖、凋亡等)或免疫調(diào)控，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，是腫瘤治療的一個潛在靶點。

圖 2 CD317 影響腫瘤細(xì)胞增殖、生存及免疫逃逸的機制Fig. 2 Mechanisms of CD317-mediated tumor cell proliferation, survival and immune escape

5 靶向 CD317 治療腫瘤研究進(jìn)展

CD317 是一個腫瘤相關(guān)的膜蛋白，因此是抗體或免疫細(xì)胞治療的潛在靶點之一。目前在研的多數(shù) CD317 靶向策略都是基于抗體、細(xì)胞毒 T 細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocytes，CTL)等開展的，涉及的腫瘤以骨髓瘤居多，涵蓋了肺癌、腎細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌等實體瘤(詳見表 2)。總體研究進(jìn)展緩慢，多數(shù)處于臨床前研究階段，主要的障礙可能有兩個方面：靶點特異性和腫瘤微環(huán)境。CD317 在多種正常組織中有不同程度的表達(dá)[75]，故抗體和 CTL 治療時可能會損傷健康組織，限制了其臨床應(yīng)用。因此，后續(xù)應(yīng)該進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中 CD317 表達(dá)調(diào)控的分子機制差異，并開發(fā)特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞 CD317 表達(dá)的藥物，通過聯(lián)合應(yīng)用的方式增強抗體或 CTL 的抗腫瘤效果，盡可能降低脫靶毒性。另一方面，實體瘤往往建立了很復(fù)雜的抑制性微環(huán)境，這對抗體和 CTL 等介導(dǎo)的腫瘤免疫治療都是極為不利的[89-90]。pDCs 是腫瘤微環(huán)境的重要組成細(xì)胞[74,91-92]，利用 CD317 抗體清除 pDCs 細(xì)胞能夠增強機體抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展[88]。因此，可以考慮將 CD317 抗體與 CTL 聯(lián)用，利用 CD317 抗體清除 pDCs 以打破免疫耐受，增強 CTL 的抗腫瘤效果。此外，CD317 在 pDCs 上高表達(dá)，利用抗體將抗原靶向遞送到 pDCs 上，增強免疫應(yīng)答[93-94]，可能是一種極具潛力的腫瘤治療性疫苗設(shè)計方案。

表 2 靶向 CD317 的腫瘤治療潛在策略Table 2 Potential strategies for tumor treatment targeting CD317

除了抗體，一些調(diào)控 CD317 表達(dá)的藥物或方法也是腫瘤治療的潛在選擇。比如，白藜蘆醇[37]、小 RNA(miR-451a[46]與 miR-760[63])以及人工設(shè)計的 siRNA 等，它們都能降低腫瘤細(xì)胞中 CD317 表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移或促進(jìn)藥物誘導(dǎo)的凋亡。盡管如此，由于這些策略都是通過降低蛋白表達(dá)水平發(fā)揮作用，對 CD317 功能的抑制是全覆蓋式的，因此還需考慮安全性的問題。目前我們對 CD317 生理功能的了解還不夠全面，這種全面打擊的方法是否會引起嚴(yán)重的副作用尚不明確。從這個角度看，基于結(jié)構(gòu)和功能認(rèn)識，開發(fā)選擇性的抑制劑可能是更好的選擇。一些研究團隊已經(jīng)成功開發(fā)出 B49[86]、B18[87]等小肽類抑制劑。其中，B49 是一種人工設(shè)計的細(xì)胞穿透肽，進(jìn)入細(xì)胞后可以干擾 CD317 二聚體的形成，從而抑制乳腺癌細(xì)胞粘附、增殖等過程，發(fā)揮抗腫瘤作用[86]。更重要的是，B49 在小鼠模型中沒有明顯的毒副作用[86]。B18 是 B49 的改良版，是通過構(gòu)效關(guān)系(Structure-Activity Relationship)研究設(shè)計的結(jié)構(gòu)更小的 CD317 抑制肽，在體外實驗中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性[87]。此外，CD317 胞內(nèi)胞質(zhì)區(qū)可以招募 Syk[24]或 GRB2[8]，激活下游 NF-κB 或 ERK 信號，因此，后續(xù)也可以針對它們的結(jié)合位點設(shè)計小分子抑制劑，為 CD317 驅(qū)動型腫瘤治療提供更多選擇。

6 結(jié)論與展望

歷經(jīng)手術(shù)、放化療、分子靶向治療以及正在興起的免疫治療這一發(fā)展歷程后，我們在腫瘤治療方面的選擇越來越多，但總體治療水平仍有待提高。腫瘤發(fā)病機制研究和治療策略開發(fā)依然任重道遠(yuǎn)。新靶點的發(fā)現(xiàn)、開發(fā)利用不僅能為患者提供更多的選擇，也是臨床上提高療效、解決耐藥等問題的強大助力。CD317 在多種腫瘤中過表達(dá)，與疾病進(jìn)展、患者預(yù)后等指標(biāo)相關(guān)，是一個潛在的腫瘤診斷、治療靶點?；谂R床前的研究結(jié)果，CD317 也體現(xiàn)了其在腫瘤診療方面的應(yīng)用潛力。再者，CD317 的結(jié)構(gòu)獨一無二，其發(fā)揮功能的機制也必然與眾不同，潛藏其下的可能是一種全新的作用模式。因此，后續(xù)應(yīng)該進(jìn)一步加強對 CD317 的理論和應(yīng)用研究，發(fā)現(xiàn)更多的功能和更深入的分子機制，推動理論進(jìn)步以及相關(guān)靶向治療策略的開發(fā)利用。

目前已知的 CD317 功能，包括束縛病毒、激活 NF-κB、EGFR 或 ERK 等信號，都依賴于其獨特的結(jié)構(gòu)。因此，B49 等干擾 CD317 結(jié)構(gòu)形成的小分子肽可能是目前已知的、在疾病治療中較有潛力的方法，但其安全性還需進(jìn)一步的驗證。盡管 CD317 敲除不影響小鼠生殖發(fā)育，但目前尚不明確長期的 CD317 功能缺陷是否存在其他安全隱患。后續(xù)還應(yīng)進(jìn)一步研究 CD317 的生理、病理功能，尤其是區(qū)分單體、二聚體在生理和病理狀態(tài)下的功能差異，為進(jìn)一步優(yōu)化靶向 CD317 的疾病治療策略提供理論基礎(chǔ)。