河北地區(qū)多中心臨床分離諾卡菌菌種分布

陳瑩，賈艷增，時東彥，宋文杰，史雨微(.河北醫(yī)科大學研究生學院，石家莊 05007；.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院檢驗科，石家莊 050000)

諾卡菌屬于需氧放線菌，廣泛分布于腐生土壤及水和灰塵中，可造成免疫低下人群感染，其感染病例報道呈上升趨勢[1]。隨著實驗室的診斷技術不斷提高，諾卡菌的分離率愈來愈高，但是國內關于諾卡菌的地區(qū)分布報道不多，且菌株數(shù)量也較少[2-3]。本研究收集2016—2019年河北地區(qū)10多家醫(yī)院分離的諾卡菌菌株，并對其進行統(tǒng)一鑒定，結合臨床資料探討其標本分布特征，以期為諾卡菌的臨床診斷提供幫助。

1 材料與方法

1.1菌株分離 收集2016—2019年河北地區(qū)10多家醫(yī)院(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院、河北省人民醫(yī)院、河北省中醫(yī)院、河北省胸科醫(yī)院、廊坊市人民醫(yī)院、滄州市中心醫(yī)院、滄州市中西醫(yī)結合醫(yī)院、哈勵遜國際和平醫(yī)院、邢臺市人民醫(yī)院、遵化市人民醫(yī)院、華北理工大學附屬醫(yī)院、承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院、保定市傳染病醫(yī)院、秦皇島市第三醫(yī)院、張家口市第一醫(yī)院等)臨床分離諾卡菌94株，均為非重復分離株，結合臨床癥狀和影像學檢查確定為致病菌[1,4]。94株諾卡菌分離自下呼吸道標本68株(72.3%)、分泌物標本20株(21.3%)、血液標本3株(3.2%)、肺膿腫標本1株(1.1%)、腦膿腫標本1株(1.1%)和腦脊液標本1株(1.1%)。分離菌株根據(jù)菌落形態(tài)和改良抗酸染色進行初步鑒定，并于-70 ℃保存。菌株分離患者中位年齡60歲，其中，男性52例，女性42例。

1.2主要試劑及儀器 去離子水(天根公司)，研磨小杵、2×Es Taq Master Mix(Dye)(北京康為世紀生物公司)；HX-20恒溫金屬浴(上海滬實業(yè)公司)，HC-2518高速離心機(安徽中科中佳科學儀器公司)，621BR50860 T100 Thermal Cycler、733BR0192 ChemiDoc Imaging System(Bio-Rad公司)，JY600C電泳儀(北京君意東方電泳設備公司)，Nano Drop 2000(超微量)分光光度計(Thermo Scientific公司)，ABI 3730XL DNA測序儀(Applied Biosystems公司)，Vitek MS分枝桿菌/諾卡菌試劑盒、Vitek MS質譜儀(法國生物梅里埃公司)。

1.3菌株DNA提取 取血平板上菌落，用研磨小杵使諾卡菌乳化分散于100 μL去離子水中，100 ℃煮沸10 min，10 625×g離心10 min，取上清液作為模板。用分光光度計評價DNA的純度和含量，A260 nm/A280 nm>1.8為合格。

1.4基因擴增及測序 參照文獻[5-6]合成16S rRNA和secA1基因擴增引物，引物序列見表1，由上海生工公司合成。PCR反應體系為50 μL，包括2×Es Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，DNA 4 μL，ddH2O 17 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察。PCR反應產物經純化送上海生工公司采用3730XL DNA測序儀進行Sanger雙向測序。序列與NCBI的基因庫進行BLAST比對，根據(jù)CLSI MM18-A[7]，若16S rRNA序列與模式菌相似度≥99.0%，且與其他種相似度之差大于0.8%，鑒定為種；若相似度<99.0%或相似度≥99.0%且與其他種相似度之差小于0.8%，則進行secA1序列分析與模式菌相似性達到≥99.0%鑒定到種。

表1 16S rRNA及secA1基因PCR擴增引物及產物大小

1.5基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)鑒定 取一環(huán)待測菌加入含0.5 mm玻璃珠和500 μL 70%乙醇的1.5 mL離心管中，震蕩5 min，室溫放置10 min，將菌懸液轉入2 mL離心管中，10 625×g離心2 min，棄上清液，向沉淀中加入10 μL 70%甲酸并室溫放置5 min，加入10 μL乙腈混勻，10 625×g離心2 min，取1 μL上清液涂于靶板，待干燥加入1 μL基質，干燥后進行MS分析。校準菌株：大腸埃希菌ATCC 8739。鑒定值99.9%則鑒定到種；無鑒定結果或鑒定值小于99.9%，則無法鑒定到種。

2 結果

2.1諾卡菌菌株鑒定結果 94株諾卡菌經基因測序全部鑒定到種，80株(85.1%)經MALDI-TOF MS成功鑒定到種，見表2。MALDI-TOF MS未鑒定到種的包括3株膿腫諾卡菌(無鑒定值)、4株亞洲諾卡菌(無鑒定值)、2株膿液諾卡菌(無鑒定值)、2株華萊士諾卡菌(無鑒定值)、1株新諾卡菌(50%鑒定值)、1株北京諾卡菌(無鑒定值)和1株南非諾卡菌(無鑒定值)。

2.2不同部位諾卡菌的分離情況 68份下呼吸道標本分離菌種分別為圣喬治教堂諾卡菌33株(48.5%)、皮疽諾卡菌11株(16.2%)、豚鼠耳炎諾卡菌8株(11.8%)、膿腫諾卡菌4株(5.9%)、亞洲諾卡菌4株(5.9%)、巴西諾卡菌2株(2.9%)、華萊士諾卡菌2株(2.9%)、膿液諾卡菌1株(1.5%)、南非諾卡菌1株(1.5%)、北京諾卡菌1株(1.5%)和新諾卡菌1株(1.5%)。20份分泌物標本分離菌種分別為巴西諾卡菌5株(25.0%)、皮疽諾卡菌5株(25.0%)、圣喬治教堂諾卡菌4株(20.0%)、膿腫諾卡菌3株(15.0%)、豚鼠耳炎諾卡菌2株(10.0%)和膿液諾卡菌1株(5.0%)。3份血液標本分離菌種分別為皮疽諾卡菌2株(66.7%)和圣喬治教堂諾卡菌1株(33.3%)。肺膿腫標本、腦膿腫標本和腦脊液標本分離菌種均為皮疽諾卡菌。

3 討論

諾卡菌生長緩慢，生化反應不活潑，其菌種鑒定效果不佳。質譜技術可解決部分諾卡菌的鑒定，但在某些種的鑒定上仍需依靠分子測序技術[8]。本研究94株臨床分離諾卡菌經質譜鑒定至種的占85.1%，膿液諾卡菌、亞洲諾卡菌、南非諾卡菌在本研究使用的質譜鑒定系統(tǒng)中缺乏鑒定數(shù)據(jù)庫；而對于膿腫諾卡菌嗜瓊脂生長特點，蛋白質提取時可能存在瓊脂的干擾而導致質譜圖譜分辨率降低；非洲諾卡菌和新諾卡菌屬于新諾卡菌群，華萊士諾卡菌和南非諾卡菌屬于南非菌群，質譜無法有效區(qū)分。94株臨床分離諾卡菌采用16S rRNA測序鑒定至種的占97.9%，有2株華萊士諾卡菌補充secA1序列后成功鑒定。16S rRNA基因序列中物種間多態(tài)性不夠，某些親緣關系較近物種可能無法進行區(qū)分，而對于南非諾卡菌復合群，secA1具有更多的物種間多態(tài)性，在識別南非諾卡菌和華萊士諾卡菌中可作為16S rRNA的補充鑒定[6]。

94株臨床分離諾卡菌包括11個諾卡菌種。圣喬治教堂諾卡菌分離率最高，其次為皮疽諾卡菌和豚鼠耳炎諾卡菌。美國臨床分離率最高菌種為新諾卡菌，其次皮疽諾卡菌和巴西諾卡菌[9]；加拿大最主要流行菌種是新諾卡菌，圣喬治教堂諾卡菌和皮疽諾卡菌較多[10]；澳大利亞主要分離菌種為新諾卡菌、圣喬治教堂諾卡菌、巴西諾卡菌和皮疽諾卡菌[11]；法國最常見分離菌種為皮疽諾卡菌、膿腫諾卡菌、新諾卡菌、圣喬治教堂諾卡菌[12]；而泰國，皮疽諾卡菌、北京諾卡菌和圣喬治教堂諾卡菌是主要分離諾卡菌種[13]。北京朝陽醫(yī)院圣喬治教堂諾卡菌臨床分離率最高，皮疽諾卡菌次之[2]。以上各個文獻表明，不同國家菌種分布有所不同，美國和澳大利亞最常見分離菌種為新諾卡菌，而法國和泰國最常見分離菌種為皮疽諾卡菌，而北京朝陽醫(yī)院和本研究報道以圣喬治教堂諾卡菌最常見。

本研究分離的諾卡菌中以呼吸道標本占比最高，達到72.3 %，其次為分泌物標本(21.3%)。而呼吸道標本分離率最高的是圣喬治教堂諾卡菌，其次為皮疽諾卡菌，第3位為豚鼠耳炎諾卡菌。分泌物標本中分離率最高的是皮疽諾卡菌和巴西諾卡菌，其次為圣喬治教堂諾卡菌。梅奧醫(yī)學中心分離率最高的部位是呼吸道，其中最常分離新諾卡菌、圣喬治教堂諾卡菌和皮疽諾卡菌[14]。西班牙臨床分離菌株中85.9%分離于呼吸道，以圣喬治教堂諾卡菌和新諾卡菌常見[15]。諾卡菌的臨床感染部位多數(shù)國家以肺部感染常見，皮膚感染次之；不同的標本類型菌種分布也不相同。了解諾卡菌的地區(qū)性分布及不同樣本來源菌種分布，對臨床經驗性用藥具有指導意義。