VITEK MALDI-TOF MS技術(shù)在臨床分離諾卡菌快速鑒定中的簡(jiǎn)易流程優(yōu)化

王 鵬，隗 明，楊春霞，谷 麗

諾卡菌廣泛存在于環(huán)境當(dāng)中，在河流，土壤，灰塵，腐敗物和動(dòng)物糞便均可作為腐生菌被發(fā)現(xiàn)[1]。目前，有相當(dāng)一部分比例的諾卡菌種可以引起人類感染，尤其以免疫低下的病人為主[2-3]。肺諾卡菌病是人感染諾卡菌最常見的致病類型[1]。自從磺胺被引入到臨床治療諾卡菌感染以來(lái)，諾卡菌的致死率急劇下降，如腦膿腫、肺部感染及皮膚和軟組織感染治愈率分別達(dá)到50%、90%，和100%[4]。然而近年來(lái)諾卡菌病發(fā)生率為年0.47～2.02/10萬(wàn)[3, 5-6]和死亡率(31%～40%)、以及諾卡菌磺胺耐藥率(2%～43%)[7]逐步增加，因此諾卡菌感染成為一個(gè)不容忽視的問(wèn)題。

對(duì)于大多數(shù)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室而言，諾卡菌的藥敏試驗(yàn)不能常規(guī)開展，臨床醫(yī)生只能根據(jù)治療經(jīng)驗(yàn)用藥。然而據(jù)國(guó)外大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道，不同種的諾卡菌具有不同的藥敏模式[8-11]。所以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行諾卡菌菌種的鑒定，對(duì)臨床醫(yī)生準(zhǔn)確用藥具有非常重要的意義。

如今，經(jīng)典的生物化學(xué)鑒定方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且隨著諾卡菌菌種庫(kù)的不斷擴(kuò)大，分辨不同種的能力也受到了很大程度限制；16S rRNA測(cè)序方法雖然是菌種鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，但此方法工作量大且技術(shù)復(fù)雜，目前大多數(shù)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室不具備常規(guī)開展測(cè)序工作的資源和能力[12]，而且目前針對(duì)于諾卡菌鑒定的熒光定量PCR尚無(wú)商業(yè)化產(chǎn)品。基于以上幾點(diǎn)原因，在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展諾卡菌的菌種鑒定存在較大挑戰(zhàn)。近年來(lái)，MALDI-TOF MS由于其快速、準(zhǔn)確、靈敏、自動(dòng)化及高通量等特點(diǎn)，在微生物鑒定中的應(yīng)用發(fā)展迅猛。根據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，德國(guó)布魯克公司的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Bruker MALDI-TOF MS)在諾卡菌菌種鑒定中的應(yīng)用已占據(jù)一席之地[13-15]。而法國(guó)梅里埃公司的VITEK MALDI-TOF MS在該菌種鑒定上起步較晚，尚需進(jìn)一步對(duì)臨床分離諾卡菌進(jìn)行菌種鑒定能力的評(píng)估[16]。雖然兩家公司MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)于諾卡菌的菌種鑒定均已起步，但是其復(fù)雜的蛋白提取過(guò)程，以及昂貴的試劑耗材，都是阻礙其在微生物實(shí)驗(yàn)室廣泛開展的不利因素。在本研究中，我們?cè)谥Z卡菌鑒定通用流程基礎(chǔ)上，通過(guò)探索諾卡菌VITEK MALDI-TOF MS鑒定的影響因素和關(guān)鍵步驟，發(fā)展了一個(gè)快速、準(zhǔn)確并且廉價(jià)、操作簡(jiǎn)易的諾卡菌菌種鑒定方法，為其在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展提供了重要基礎(chǔ)保障。

1 材料和方法

1.1標(biāo)本來(lái)源及實(shí)驗(yàn)流程 收集北京朝陽(yáng)醫(yī)院自2011年1月至2018年6月期間臨床分離的革蘭染色陽(yáng)性分枝狀串珠樣，并且弱抗酸染色陽(yáng)性的疑似諾卡菌46株，將其分純培養(yǎng)后分別進(jìn)行16S rRNA和gyrB兩個(gè)基因片段測(cè)序，而后與GenBank中的模式菌比對(duì)，將最佳匹配結(jié)果作為參考標(biāo)準(zhǔn)；將不同菌齡(早期菌落和典型菌落)菌株分別用兩種不同的樣本處理方法進(jìn)行VITEK MALDI-TOF MS鑒定，結(jié)果與參考標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比，實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。

早期菌落為僅一區(qū)有明顯生長(zhǎng)，不同菌種間略有差異，通常在48 h以內(nèi)；典型菌落為三區(qū)均有生長(zhǎng)，且第三區(qū)有單一菌落形態(tài)，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)在48 h以上。

*根據(jù)CLSI MM18對(duì)于16S rRNA基因序列鑒定細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)：待測(cè)菌序列與模式菌對(duì)比，相似度≥99.0%且與其他種相似度之差大于0.8%，才能鑒定到種，相似度≥99.0%與其他種相似度之差差值小于0.8%，只能鑒定到屬或多個(gè)種；相似度<99.0%，可能為新種[17]。圖1 VITEK MALDI-TOF MS對(duì)諾卡菌的鑒定性能研究及關(guān)鍵步驟探索流程圖Fig.1 Flow diagram of Nocardia identification ability and key steps exploration by Vitek MALDI-TOF MS

16S rRNA引物序列：

正向5′-GCTTAACACATGCAAGTCG-3′，

反向 5′-GAATTCCAGTCTCCCCTG-3′；

gyrB引物序列：

正向5′-CTTCGCCAACACCATCAACAC-3′，

反向5′-TGATGATCGACTGGACCTCG-3′。

使用Lasergene 7.1(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)中的SeqMan程序拼接序列。使用BLAST v.2.2.10，將每株諾卡菌的部分16S rRNA和gyrB序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的模式菌株序列進(jìn)行比較，以序列最大的相似性鑒定至菌種水平。

1.3VITEK MALDI-TOF MS質(zhì)譜鑒定 將待測(cè)菌分別接種到兩塊哥倫比亞血平板(天津金章)中，37 ℃恒溫恒濕溫箱孵育，早期菌落和典型菌落分別進(jìn)行如下操作，流程如圖2所示。

(A)提蛋白，(B) 直接涂布法，(C) 菌懸液涂布法圖2 諾卡菌鑒定流程Fig.2 Procedures of Nocardia identification by Vitek MALDI-TOF MS

提蛋白MS鑒定流程：在安全柜中用1 μL接種環(huán)取一環(huán)待測(cè)菌加入含500 μL70%乙醇(ThermoFisherScientific，美國(guó)，質(zhì)譜純)的磨菌瓶中(bioMérieux，法國(guó))(Eppendorf管中內(nèi)有0.5 mm玻璃珠)，水平震蕩儀震蕩5 min直到細(xì)菌均勻在酒精中，室溫放置10 min，將菌懸液轉(zhuǎn)入1.5 mL Eppendorf管中，10 625 g離心2 min，棄上清，向沉淀中加入10 μL 70%甲酸(bioMérieux，法國(guó))吹吸沉淀室溫放置5 min，加入10 μL乙腈(ThermoFisherScientific，美國(guó)，質(zhì)譜純)混勻，10 625 g離心2 min，取1 μL上清雙孔位涂于靶板，待完全干燥加入1 μL CHCA基質(zhì)(bioMérieux，法國(guó))，完全干燥后進(jìn)行VITEK MS分析。

直接涂布法MS鑒定流程：將易分散早期菌落直接雙孔位涂布于靶板上，加入1.5 μL CHCA基質(zhì)，完全干燥后進(jìn)行VITEK MS分析；

菌懸液涂布法MS鑒定流程：將不易分散的菌落用提蛋白MS鑒定流程中的方法分散后，將菌懸液涂布在靶板上，待完全干燥后做MS分析。

結(jié)果判讀：若雙孔位鑒定結(jié)果一致，直接報(bào)告鑒定結(jié)果(種、復(fù)合群)；若雙孔位結(jié)果不一致時(shí)，則重復(fù)鑒定3次，選取鑒定率>60%且至少出現(xiàn)3次的結(jié)果；如果無(wú)鑒定結(jié)果，則待測(cè)菌株無(wú)法鑒定。

2 結(jié) 果

2.116S rRNA和gyrB測(cè)序結(jié)果 將16S rRNA和gyrB序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的模式菌株序列進(jìn)行比較，46株菌均為諾卡菌屬，其中分離率最高的是蓋爾森基興諾卡菌(N.cyriacigeorgica)22株，占比47.8%，其次分別為鼻疽諾卡菌(N.farcinica)7株(15.2%)，膿腫諾卡菌(N.abscessus)5株(10.9%)，北京諾卡菌(N.beijingensis)4株(8.7%)，華萊士諾卡菌(N.wallacei)3株(6.5%)，豚鼠耳炎諾卡菌(N.otitidiscaviarum)3株(6.5%)，新星諾卡菌(N.nova)和亞洲諾卡菌(N.asiatica)各1株(2.2%)。

2.2VITEK MALDI-TOF MS諾卡菌鑒定結(jié)果 使用早期菌落做MS鑒定，成功鑒定到種43株(表1)，鑒定率均為99.9%，多于使用典型菌落鑒定到種的39株，區(qū)別在于cy01、cy02、cy34和cy35共4株菌，典型菌落鑒定均無(wú)結(jié)果，分別對(duì)應(yīng)2株北京諾卡菌和2株華萊士諾卡菌；編號(hào)cy45測(cè)序結(jié)果為新星諾卡菌，不同菌齡結(jié)果無(wú)差別，只能鑒定到復(fù)合群水平，與同為新星諾卡菌復(fù)合群的非洲諾卡菌鑒定率各占50%；編號(hào)cy46是一株亞洲諾卡菌， MS無(wú)鑒定結(jié)果。

提蛋白與菌落直接涂布兩種不同的前處理方法對(duì)早期菌落進(jìn)行MS鑒定時(shí)，結(jié)果完全一致，都能夠?qū)?6株菌中的43株菌成功鑒定到種，占所有分離菌的93.5%,包括全部鼻疽諾卡菌(7株)、蓋爾森基興諾卡菌(22株)、華萊士諾卡菌(3株)、膿腫諾卡菌(5株)和豚鼠耳炎諾卡菌(3株)，4株北京諾卡菌中的3株也成功鑒定到種，且每一株鑒定率均高達(dá)99.9%；編號(hào)cy03的北京諾卡菌雙孔位鑒定重復(fù)多次，鑒定率均≤50%，北京諾卡菌與膿腫諾卡菌二選一或者加上巴西諾卡菌三選一。

表1 不同前處理方法和不同時(shí)期菌落VITEK MALDI-TOF MS對(duì)諾卡菌的鑒定結(jié)果

Tab.1 Identification of Nocardia by VITEK MALDI-TOF MS with different pretreatment methods and in different growth stages

編號(hào)參考標(biāo)準(zhǔn)早期菌落(<48 h)MS鑒定結(jié)果典型菌落(>48 h)MS鑒定結(jié)果提蛋白直接涂布提蛋白菌懸液涂布cy01N. beijingensisN. beijingensisN. beijingensisno idno idcy02N. beijingensisN. beijingensisN. beijingensisno idno idcy03N. beijingensisN. beijingensis/ N. abscessus or N. beijingensis/ N. abscessus/ N. brasiliensisN. beijingensis/ N. abscessus or N. beijingensis/ N. abscessus/ N. brasiliensisno idno idcy04N. beijingensisN. beijingensisN. beijingensisN. beijingensisno idcy05N. farcinicaN. farcinicaN. farcinicaN. farcinicaN. farcinicacy06N. farcinicaN. farcinicaN. farcinicaN. farcinicaN. farcinicacy07N. farcinicaN. farcinicaN. farcinicaN. farcinicaN. farcinica表1(續(xù))編號(hào)參考標(biāo)準(zhǔn)早期菌落(<48 h)MS鑒定結(jié)果典型菌落(>48 h)MS鑒定結(jié)果提蛋白直接涂布提蛋白菌懸液涂布cy08N. farcinicaN. farcinicaN. farcinicaN. farcinicaN. farcinicacy09N. farcinicaN. farcinicaN. farcinicaN. farcinicaN. farcinicacy10N. farcinicaN. farcinicaN. farcinicaN. farcinicaN. farcinicacy11N. farcinicaN. farcinicaN. farcinicaN. farcinicaN. farcinicacy12N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy13N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy14N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy15N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy16N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy17N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy18N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy19N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy20N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy21N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy22N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy23N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy24N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy25N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy26N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy27N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy28N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy29N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy30N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy31N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy32N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy33N. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicaN. cyriacigeorgicacy34N. wallaceiN. wallaceiN. wallaceino idno idcy35N.wallaceiN. wallaceiN. wallaceino idno idcy36N. wallaceiN. wallaceiN. wallaceiN. wallaceiN. wallaceicy37N. abscessusN. abscessusN. abscessusN. abscessusN. abscessus

cy38N. abscessusN. abscessusN. abscessusN. abscessusN. abscessuscy39N. abscessusN. abscessusN. abscessusN. abscessusN. abscessuscy40N. abscessusN. abscessusN. abscessusN. abscessusN. abscessuscy41N. abscessusN. abscessusN. abscessusN. abscessusN. abscessuscy42N. otitidiscaviarumN. otitidiscaviarumN. otitidiscaviarumN. otitidiscaviarumN. otitidiscaviarumcy43N. otitidiscaviarumN. otitidiscaviarumN. otitidiscaviarumN. otitidiscaviarumN. otitidiscaviarumcy44N. otitidiscaviarumN. otitidiscaviarumN. otitidiscaviarumN. otitidiscaviarumN. otitidiscaviarumcy45N. novaN. nova/ N. africanaN. nova/ N. africanaN. nova/ N. africanaN. nova/ N. africanacy46N. asiaticano idno idno idno id

N.cyriacigeorgica, 蓋爾森基興諾卡菌；N.farcinica, 鼻疽諾卡菌；N.abscessus, 膿腫諾卡菌；N.beijingensis, 北京諾卡菌；N.wallacei, 華萊士諾卡菌；N.otitidiscaviarum, 豚鼠耳炎諾卡菌；N.nova, 新星諾卡菌；N.asiatica, 亞洲諾卡菌；N.brasiliensis, 巴西諾卡菌；no id, 無(wú)鑒定結(jié)果

3 討 論

與臨床致病相關(guān)的諾卡菌菌種水平鑒定雖然具有挑戰(zhàn)性，但不同諾卡菌種有不同的藥敏模式[8-11]，鑒定至菌種水平顯得尤為重要。為探索Vitek MALDI-TOF MS鑒定諾卡菌方法是否可靠，我們收集了46株臨床分離株驗(yàn)證其鑒定性能。首先我們將典型的細(xì)菌菌落(分純培養(yǎng)3 d后)按照梅里埃公司提供的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序(SOP)要求，使用甲酸和乙腈提取蛋白后進(jìn)行MS分析，得到84.8%(36/43)的菌種水平鑒定率。通過(guò)與參考標(biāo)準(zhǔn)方法比較我們發(fā)現(xiàn)該方法對(duì)于北京諾卡菌和華萊士諾卡菌鑒定性能較差。大多數(shù)諾卡菌都是干燥不易分散的，尤其北京諾卡菌和華萊士諾卡菌還有噬瓊脂現(xiàn)象，這更增加了制備菌懸液提取蛋白的難度。在分純培養(yǎng)的過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)早期的菌落容易從培養(yǎng)基上刮下，所以我們采用標(biāo)準(zhǔn)的甲酸、乙腈提取蛋白制備方法采用“年輕”(培養(yǎng)時(shí)間<48 h)菌落制備樣品進(jìn)行鑒定。相較于典型菌落(培養(yǎng)時(shí)間>48 h)，菌種水平鑒定率從84.8%提高到93.5%(43/46)。該結(jié)果標(biāo)明，菌齡小于48 h的鑒定結(jié)果顯著優(yōu)于菌齡大于48 h的菌種鑒定結(jié)果。所以菌齡是諾卡菌鑒定中的關(guān)鍵因素之一，其與Khot等和McTaggart 等的研究結(jié)果一致[13,18]，具體的機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

和大多數(shù)諾卡菌不同，鼻疽諾卡菌濕潤(rùn)易分散，直接用接種環(huán)就能將其均勻涂布在靶板上，和其他常見菌一樣，直接加CHCA基質(zhì)，6株鼻疽諾卡菌全部鑒定到種。受鼻疽諾卡菌啟發(fā)，我們將不同菌齡的諾卡菌采用非提蛋白-即直接將菌或菌懸液涂于靶板做MS鑒定，結(jié)果如表1所示：<48 h直接涂布鑒定結(jié)果與提蛋白鑒定結(jié)果完全一致；>48 h菌懸液涂板鑒定和提蛋白鑒定結(jié)果相比，僅有一株北京諾卡菌無(wú)鑒定結(jié)果，該結(jié)果是否提蛋白并不是諾卡菌鑒定的關(guān)鍵步驟，所以諾卡菌VITEK MALDI-TOF MS鑒定中提取蛋白過(guò)程可以省略。基于采用早期菌落和省略提取蛋白過(guò)程，使諾卡菌鑒定通用流程發(fā)展成為一個(gè)更加簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速的鑒定流程。選取早期菌落直接涂布法，省去了機(jī)械分散破碎的過(guò)程，節(jié)約了甲酸、乙腈提取蛋白的成本，更重要的是減少培養(yǎng)時(shí)間，更早地為臨床提供病原學(xué)結(jié)果。

該研究結(jié)果顯示，采用本文鑒定流程，諾卡菌菌種鑒定率為93.5%，與先前的報(bào)道略有提高。有報(bào)道稱，在商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上結(jié)合其內(nèi)部相關(guān)數(shù)據(jù)，可以獲得更高的鑒定率[19]。目前，我們使用的VITEK MALDI-TOF MS V3.0的鑒定庫(kù)包含15種諾卡菌，亞洲諾卡菌不在其中，后期隨著我們分離的諾卡菌菌種和數(shù)量的增多，建立本中心的諾卡菌數(shù)據(jù)庫(kù)具有重要意義。相較于測(cè)序方法，VITEK MALDI-TOF MS操作方法簡(jiǎn)單，數(shù)據(jù)分析采用自動(dòng)化方案(所測(cè)峰圖與數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)菌株峰圖比對(duì))，菌種鑒定所需時(shí)間短(20～30 min)；但數(shù)據(jù)庫(kù)中僅有常見致病菌種數(shù)據(jù)，所以對(duì)于不常見諾卡菌致病菌種，還需要借助于測(cè)序方法進(jìn)行鑒定。

目前VITEK MALDI-TOF MS采用提取蛋白鑒定流程還廣泛應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌、其他需氧放線菌以及絲狀真菌等不易分散的干燥菌落，均采用標(biāo)準(zhǔn)鑒定流程[20-22]，是否可以忽略提取蛋白步驟尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

VITEK MALDI-TOF MS技術(shù)在諾卡菌快速鑒定中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)然，未來(lái)只有進(jìn)一步優(yōu)化相關(guān)樣品處理方法，完善鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)，才能使VITEK MALDI-TOF MS技術(shù)更廣泛的應(yīng)用于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室，更好地服務(wù)于醫(yī)生進(jìn)行疾病診斷。

致謝：感謝北京朝陽(yáng)醫(yī)院感染和臨床微生物科全體同事對(duì)諾卡菌分離做出的貢獻(xiàn)。

利益沖突：無(wú)