豬冷凍精液生產(chǎn)操作規(guī)程

文│倪和民 王相國（北京農(nóng)學(xué)院）

鄧曉彬 朱寬峰 蔣凡（北京田園奧瑞生物科技有限公司）

趙俊金（全國畜牧總站）

金通 吳承武 王文強（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)淮安研究院）

劉燊 劉建（江西正邦養(yǎng)殖有限公司）

一、范圍

本作業(yè)指導(dǎo)書確立了豬冷凍精液生產(chǎn)程序，規(guī)定了生產(chǎn)實驗室選擇、使用器械衛(wèi)生要求、稀釋液配制、采精、精液處理、精液冷凍、凍精解凍、質(zhì)量檢測、凍精包裝和凍精貯存等階段的操作指示，描述了過程記錄、標(biāo)記、試驗方法等追溯方法。

本作業(yè)指導(dǎo)書適用于豬冷凍精液生產(chǎn)及貯存。

二、規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 4143牛冷凍精液；GB/T25172豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)規(guī)范；GB/T 30396牛冷凍精液包裝、標(biāo)簽、貯存和運輸；GB/T 5458液氮生物容器；NY/T 2077種公豬站建設(shè)技術(shù)規(guī)范；NY/T 1167畜禽場環(huán)境質(zhì)量及衛(wèi)生控制質(zhì)量。

三、術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

1.冷凍精液（f r o z e n semen）。經(jīng)特殊方法處理精液超低溫冷凍后在液氮中（-196℃）長期保存。[GB 4143-2008，定義3.5]。

2.采精（semen collection）。采用人工手握公豬陰莖龜頭模擬似有自然交配感的操作，以獲得公豬精液。

3.原精液（e j a c u l a t e d semen）。采集后未經(jīng)稀釋的精液。[GB/T 23238-2009，定義3.1]。

4.精子活力（s p e r m motility）。在37℃環(huán)境下前進運動精子占總精子數(shù)的百分率。[GB/T 25172-2010，定義3.3]。

5.精子密度（s p e r m concentration）。單位體積精液中的精子數(shù)，單位為108個每毫升。［GB/T 25172-2010，定義3.4］。

四、豬冷凍精液生產(chǎn)程序的構(gòu)成

豬冷凍精液生產(chǎn)程序包括9個階段，其中精液處理階段分為5個步驟。

五、豬冷凍精液生產(chǎn)

1.生產(chǎn)實驗室。

（1）生產(chǎn)實驗室主要包括采精室、精液生產(chǎn)室和精液質(zhì)量檢測室。

（2）基礎(chǔ)設(shè)施能夠保證生產(chǎn)經(jīng)營的需要，其中采精室、精液生產(chǎn)室使用面積及條件應(yīng)分別符合NY/T 2077中7.3和7.4的規(guī)定，精液質(zhì)量檢測室可參照NY/T 2077中7.5的要求。周圍環(huán)境不準(zhǔn)許有影響種豬健康和凍精質(zhì)量的不良因素。

表1 凍精試劑成分組合

（3）環(huán)境條件應(yīng)符合NY/T 1167中的規(guī)定。

（4）配備的儀器設(shè)備，其性能、精度、量程應(yīng)能夠滿足冷凍精液生產(chǎn)與檢驗測試的需要，具體配置清單見附錄A。為了保證設(shè)備能夠正常的運轉(zhuǎn)和測試結(jié)果的準(zhǔn)確性，嚴(yán)格按照使用說明要求規(guī)范操作。對在用儀器設(shè)備應(yīng)給予正常的維護，完好率100%。涉及量值器具與設(shè)備（天平、溫度計、恒溫箱等）應(yīng)定期進行檢定和校準(zhǔn)。

（5）實驗室內(nèi)布局合理，在用儀器設(shè)備應(yīng)按使用的先后，順時針方向擺放。

2.器械衛(wèi)生要求。器械及器皿清洗方式方法，通常為手工清洗或使用超聲波清洗機。器具的消毒滅菌，應(yīng)按照不同材質(zhì)分別采用對應(yīng)的方式方法，玻璃器皿類清洗潔凈后，采用電熱恒溫干燥箱高溫滅菌消毒；對于一些不耐高溫材質(zhì)的，如橡膠、塑料制品，采用75%酒精擦拭消毒或紫外線燈照射、臭氧消毒。

3.凍精試劑。

（1）所用的凍精試劑應(yīng)選擇分析純；稀釋用水為雙重蒸餾水；提供新鮮卵黃的雞蛋應(yīng)是來源于無疫病雞場；添加使用的抗生素應(yīng)在有效期內(nèi)。

（2）試劑配制過程中應(yīng)嚴(yán)格按照配方要求、準(zhǔn)確稱量、先后順序、規(guī)范操作。配制完成后應(yīng)及時在試劑容器上明確標(biāo)記試劑的名稱、配制日期、保質(zhì)時間等。

（3）凍精試劑拆封后，應(yīng)先檢查試劑包裝標(biāo)識，所用試劑符合表1中各項試劑成分組合，并嚴(yán)格按照TYP-5豬凍精試劑使用方法說明書的要求操作。

表2 原精液質(zhì)量要求

（4）通常凍精生產(chǎn)前準(zhǔn)備好各種凍精試劑。預(yù)稀釋劑試劑A配制好，使用前水浴至37℃待用?；A(chǔ)營養(yǎng)液（Ⅰ液）試劑B加卵黃，使用前置于恒溫箱內(nèi)17℃保存、待用。冷凍保護劑（Ⅱ液）基礎(chǔ)營養(yǎng)液（Ⅰ液）加試劑C和試劑D，使用前置于平衡柜中4℃冷藏、待用。解凍劑試劑E配制好，使用前水浴至30℃（26～32℃）待用。

（5）不準(zhǔn)許使用過期或已變質(zhì)的稀釋液。

4.采精。

（1）采精公豬體質(zhì)健康，具有種用價值。

（2）采精操作，按照GB/T25172中4.1～4.3方法。根據(jù)公豬射精特點，應(yīng)舍去最初和最后部分精液，采集完成后立即送入精液處理室。

5.精液處理。

（1）工作準(zhǔn)備。精液處理室室內(nèi)控溫設(shè)備、恒溫水浴箱、顯微鏡恒溫載物臺、精子密度測定儀、電子天平、恒溫箱、低溫操作柜和恒溫操作間等均應(yīng)提前開機預(yù)冷（熱）待用。凡是接觸精液的器皿應(yīng)按使用要求分別放置于不同環(huán)境溫度中預(yù)冷（熱）待用。

（2）原精液質(zhì)量檢測。精液處理室及時記錄采精日期、品種、公豬號等有關(guān)信息。觀察精液的色澤，準(zhǔn)確進行采精量、精子活力、密度、畸形率的檢測，檢測方法見GB/T 25172中5.3.1～5.3.6。及時記錄檢測的時間、地點、檢測項目、結(jié)果及檢測人。只準(zhǔn)許檢測結(jié)果符合表2中質(zhì)量要求的精液方可進入精液處理階段。

（3）添加保護液。符合質(zhì)量要求的原精液，緩緩加入等量的預(yù)稀釋劑（1∶1），搖勻、標(biāo)記后，置于精液程控平衡儀，平衡儀初始溫度設(shè)置與預(yù)稀釋精液溫度一致，結(jié)束溫度為17℃，平衡時間設(shè)置為90～120分鐘。

（4）精液離心。離心前應(yīng)準(zhǔn)確稱量離心管凈重（克），做好標(biāo)記。降、恒溫后精液在17℃環(huán)境條件下800～900克離心10分鐘，舍去上清液。離心后及時稱量離心管加精子重（克）。精子體積按式（1）計算：v＝w1－w0

式中：v——精子體積，單位為毫升；w1——離心瓶加精子重，單位為克；w0——離心瓶重，單位為克。

（5）稀釋、平衡。計算總精子數(shù)（個）＝精液量（毫升）×精子密度（億/毫升）?？缮a(chǎn)數(shù)（支）＝總精子數(shù)（億）÷每支細管中精子數(shù)（億）。稀釋總量（毫升）＝可生產(chǎn)數(shù)（支）×每支細管灌裝量（毫升）。稀釋液添加量（毫升）＝稀釋總量（毫升）－精子體積（毫升）。注：每支細管實際灌裝量：微型≈0.20（毫升），中型≈0.45（毫升）。稀釋液添加量計算公式按式（2）計算：

式中：v——稀釋液添加量，單位為毫升；v1——采精量，單位為毫升；c——精子密度，單位為個（108/毫升）；s——每支份含總精子數(shù)，單位為個（108/支份）；v2——每支份劑量值，單位為毫升；v3——精子體積，單位為毫升。

稀釋。一次稀釋。在精子體積中緩緩加入基礎(chǔ)營養(yǎng)液（Ⅰ液），至稀釋總量的一半，輕輕搖勻后將稀釋精液置于精液程控平衡儀，平衡儀初始溫度設(shè)置為17℃，結(jié)束溫度為4℃，平衡時間設(shè)置為60～90分鐘。

二次稀釋。平衡結(jié)束后，將冷凍保護劑（Ⅱ液）加入至稀釋總量，緩緩加液并輕輕搖動。

（6）灌裝。全自動凍精細管灌裝封口一體機開機測試，置于恒溫操作間或在低溫平衡柜中進行灌裝、封口，細管噴碼機進行細管標(biāo)記。不準(zhǔn)許精液封裝過程中發(fā)生溫度回升，精液灌裝環(huán)境溫度應(yīng)始終控制在3～5℃范圍內(nèi)。灌裝封口完成后及時將細管精液在冷凍架上碼放，操作時細管棉塞封口端靠近操作者，超聲波封口端遠離操作者。每架上放有標(biāo)記物，便于識別。如同一架上有不同公豬的細管精液，也要做好標(biāo)記，便于識別，以免混淆。

6.精液冷凍。

（1）選擇使用程控冷凍儀完成對細管精液的冷凍，調(diào)用豬凍精專用降溫曲線程序。

（2）精液冷凍前應(yīng)提前開機，對冷凍儀腔室實施降溫、預(yù)冷至4℃穩(wěn)定、待用。

（3）將已上架碼放好的細管精液迅速轉(zhuǎn)移至冷凍腔室內(nèi)。

（4）選擇豬精液冷凍程序，通過計算機軟件系統(tǒng)控制冷凍腔室內(nèi)降溫速度（曲線）。

（5）冷凍完成打開冷凍儀蓋板，迅速將細管精液取出，按照采精公豬號分別投入盛滿液氮的不同容器中。

（6）取放時，細管的封口端在上，棉塞端向下，不可倒置。不準(zhǔn)許精液脫氮。

7.精液解凍。將細管精液迅速放入在50℃溫水中輕輕擺動，解凍時間為15～16秒。取出，擦干水跡，剪去細管兩端，將精液移入指形管中，用26～35℃預(yù)熱后的解凍劑10倍稀釋，保存10分鐘后待檢。

8.凍精檢測。

（1）對解凍后精子活力、畸形率的檢測，方法見GB/T 25172中5.3.3、5.3.5。

（2）每批/頭細管的檢測，不少于3支。

9.凍精包裝、貯存。檢測合格定留存的精液裝入拇指管和紗布袋中做好生產(chǎn)日期和豬號標(biāo)記，轉(zhuǎn)入低溫容器液氮中貯存，貯存要求見GB/T 30396中7.1～7.4。

六、追溯方法

1.標(biāo)記方法。在豬冷凍精液生產(chǎn)的采精階段，標(biāo)記的內(nèi)容包括：標(biāo)記采精公豬所屬品種；標(biāo)記公豬編號或耳號；標(biāo)記公豬所在圈舍。

2.過程記錄。在執(zhí)行第五章各個階段的程序指示過程中，記錄并保持以下記錄內(nèi)容：執(zhí)行；執(zhí)行各個階段程序指示的人員姓名或代號；時間；地點；執(zhí)行的具體操作內(nèi)容；操作結(jié)果或觀察到的現(xiàn)象。

附錄A

豬冷凍精液生產(chǎn)儀器設(shè)備及用品配置見表A。

表A 豬冷凍精液生產(chǎn)儀器設(shè)備配置表