窄分布三元醇聚酯的酶催化合成和鏈增長(zhǎng)機(jī)理研究

石阿鵬, 饒子昆, 郝建原

(電子科技大學(xué) 材料與能源學(xué)院，四川 成都 610054)

納米材料經(jīng)常被用來(lái)改善諸如藥物、蛋白、基因等醫(yī)療制劑的物理化學(xué)和生物性能，以達(dá)到增強(qiáng)藥物的水溶性，增加藥物的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間和改善藥物的靶向能力等目的[1-3]。目前的納米材料領(lǐng)域，擁有完美三維對(duì)稱結(jié)構(gòu)的dendrimer或者規(guī)整度高、分布窄的樹(shù)枝狀聚合

物越來(lái)越受到廣泛地關(guān)注[4-5]，支化結(jié)構(gòu)能夠天然地提供隨支鏈數(shù)量成倍增長(zhǎng)的功能性末端基團(tuán)。通常地，通過(guò)迭代耦合法(不論是發(fā)散迭代耦合還是收斂迭代耦合)，可以合成出化學(xué)結(jié)構(gòu)嚴(yán)格可控的產(chǎn)品[6-7]。然而，為達(dá)到較高的分子量和規(guī)整的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，耗時(shí)而復(fù)雜的保護(hù)-脫保護(hù)過(guò)程必不可少[8-9]。因此，對(duì)于大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，目前的方法太過(guò)復(fù)雜且成本較高。最近，一種表面為羥基的2,2-雙羥基丙酸(bis-MPA)規(guī)則樹(shù)枝狀聚合物被報(bào)道出能夠通過(guò)一種簡(jiǎn)單高效的方法合成出來(lái)，并且其提純過(guò)程也簡(jiǎn)潔可行。但是，聚合期間所用的氟化銫催化劑所帶來(lái)的催化劑殘留將嚴(yán)重影響產(chǎn)物的生物相容性和生物安全性[10]。

因此，探索一種無(wú)毒可規(guī)?；a(chǎn)的方式合成結(jié)構(gòu)規(guī)整的窄分布樹(shù)枝狀聚酯依舊是一個(gè)難題。將多元醇引入到非多糖結(jié)構(gòu)中是一種得到高官能度“智能”材料的有效方法。傳統(tǒng)的化學(xué)方法已經(jīng)成功地用于得到結(jié)構(gòu)明確的多元醇聚酯，然而不論是“一鍋法”中的嚴(yán)重交聯(lián)現(xiàn)象[11]，還是多步反應(yīng)中繁瑣的保護(hù)與-脫保護(hù)程序[12-15]，無(wú)不說(shuō)明了化學(xué)催化區(qū)域選擇性弱的問(wèn)題。相對(duì)而言，脂肪酶由于其出色的空間、結(jié)構(gòu)選擇性以及溫和的反應(yīng)溫度，已經(jīng)逐漸成為一種被廣泛研究的綠色催化劑，可以合成多種功能性聚酯[16]。而且，酶催化對(duì)于支化度有著出色的控制力，從而避免了在聚合過(guò)程中發(fā)生交聯(lián)[17]。因此，酶催化聚合在制備支化度可控的樹(shù)枝狀聚合物方面前景廣闊。由于脂肪酶主要作用于酯鍵，許多化學(xué)敏感的基團(tuán)(如巰基、二硫鍵、疊氮鍵等)在酶催化聚合過(guò)程中能夠完好無(wú)損地保留下來(lái)[18-20]。目前，丙三醇和其他糖類(如山梨糖醇、甘露醇、乳糖)同二酸/二酯共聚，尤其是同二乙烯基二酯在極性溶劑中的共聚，可以得到較高分子量的多元醇聚酯。在多糖中，山梨糖醇由于在聚合活性上的絕的優(yōu)勢(shì)而得到了更為廣泛的研究。但是由于主鏈羥基較多，到目前為止，得到結(jié)構(gòu)明確的山梨糖醇聚酯仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。丙三醇酯酶催化共聚的研究和應(yīng)用更為廣泛，只是得到的產(chǎn)物往往是無(wú)規(guī)樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)，PDI較大(>3.0)[21-25]。如此差的結(jié)構(gòu)可控性已經(jīng)大大影響其在先進(jìn)軟物質(zhì)納米材料領(lǐng)域的應(yīng)用。

Kobayashi等[26-27]報(bào)道了丙三醇的酶催化聚合，文中根據(jù)不同13C NMR特征峰，將丙三醇結(jié)構(gòu)單元分成了四類： 1-取代，1，2-二取代，1，3-二取代和3取代單元。隨后，Gross等[11]報(bào)道了一取代，二取代和三取代結(jié)構(gòu)單元分別為端基單元、線型單元和樹(shù)枝狀單元。以最常見(jiàn)的脂肪酶N435為催化劑，生物相容的三羥甲基乙烷(TME)和辛二酸二乙酯為反應(yīng)單體，合成一種結(jié)構(gòu)規(guī)整的樹(shù)枝狀窄分布多元醇聚酯。并且，將常見(jiàn)的丙三醇聚酯與TME聚酯的酶催化聚合過(guò)程作對(duì)比，研究其鏈增長(zhǎng)行為的不同之處，從而探索規(guī)則的樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)的形成機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Varian-400-MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑, TMS為內(nèi)標(biāo))；Waters Associates Model ALC/GPC 244 型高效液相色譜儀。

三羥甲基乙烷(TME， Sigma-Aldrich, 98%)，丙三醇(成都科龍，98%)，辛二酸二乙酯(Tokyo Chemical Industry， 98%)，脂肪酶N435(Sigma-Aldrich)；其他所用試劑均為分析純。

1.2 合成

稱取三羥甲基乙烷1.201 g(10 mmol)或者丙三醇0.921 g(10 mmol)，真空干燥后加入辛二酸二乙酯2.303 g(10 mmol)，然后再加入相當(dāng)于反應(yīng)單體總質(zhì)量?jī)杀兜亩矫炎鳛槿軇?。隨后，加入干燥好的N435(單體總質(zhì)量的10%)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，油浴反應(yīng)溫度逐步升高到80 ℃，在常壓下反應(yīng)2 h。隨后，在真空條件下(10 mmHg)繼續(xù)反應(yīng)46 h。

2 結(jié)果與討論

2.1 Poly(suberic acid-TME)(PST)的表征

圖1為PST的1H NMR譜圖。根據(jù)三羥甲基乙烷的取代度的不同，將聚合物結(jié)構(gòu)分成了terminal(T)單元，linear(L)單元和dendritic(Den)單元。c1， c2和c3分別代表T單元，L單元和Den單元上的甲基(CH3-)峰，而它們的相對(duì)面積則可以被用來(lái)計(jì)算各個(gè)單元結(jié)構(gòu)的比重。

除此之外，GPC分析已經(jīng)證實(shí)了PST的多分散性指數(shù)在最終產(chǎn)物中相對(duì)較低。由于PST有如此低的多分散性指數(shù)(1.40)，預(yù)計(jì)PST也是一種結(jié)構(gòu)規(guī)整的樹(shù)枝狀聚合物。

圖1 PST結(jié)構(gòu)和的1H NMR譜圖

表1 PST各個(gè)階段1H NMR和GPC

Log M

2.2 PST的鏈增長(zhǎng)

結(jié)構(gòu)單元比重、分子量及其分布隨著反應(yīng)時(shí)間的變化趨勢(shì)如圖2和表1所示。直觀的，PST的數(shù)均分子量在前24 h的時(shí)間內(nèi)幾乎呈現(xiàn)出快速增長(zhǎng)。

圖3 PST的鏈增長(zhǎng)機(jī)理示意圖

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，需要對(duì)各個(gè)階段的鏈增長(zhǎng)行為建模。目前超支化分子的結(jié)構(gòu)形狀仍然有許多懸而未決的問(wèn)題[28]。但是，在酶催化聚合反應(yīng)中不會(huì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的前提下[17]，提出了3個(gè)鏈增長(zhǎng)模型：線型增長(zhǎng)(linear growth)、支化增長(zhǎng)(grafted growth)和樹(shù)枝狀增長(zhǎng)(dendritic growth)。

根據(jù)計(jì)算，在最終產(chǎn)物里，TME末端占整個(gè)末端比重的94%。純粹的樹(shù)枝狀增長(zhǎng)最終形成了結(jié)構(gòu)規(guī)整的樹(shù)枝狀大分子，如圖3所示。這個(gè)樹(shù)枝狀分子結(jié)構(gòu)中各個(gè)結(jié)構(gòu)單元的比重(Den/L/T)接近于1/2/1，與根據(jù)1H NMR的計(jì)算結(jié)果完全吻合(表1, 48 h)；被圈出的結(jié)構(gòu)可以是整個(gè)聚合物分子鏈節(jié)的基本單元。

2.3 Poly (Suberic acid-glycerol)(PSG)的表征

在相同的反應(yīng)條件下監(jiān)測(cè)丙三醇聚酯(PSG)的分子結(jié)構(gòu)，分子量等隨著時(shí)間的變化，以對(duì)比丙三醇聚酯與TME聚酯鏈增長(zhǎng)行為的不同之處。類似的，丙三醇聚酯的結(jié)構(gòu)被分成Dendritic(Den)、 Linear(L)和Terminal(T)單元。考慮到丙三醇有不同的酯化反應(yīng)點(diǎn)位，如伯羥基和仲羥基。根據(jù)酯化位點(diǎn)的不同我們把L單元又分成L12單元和L13單元，而T單元被分成T1單元和T2單元(圖4)。

圖4 PSG的單元結(jié)構(gòu)和1H NMR譜圖

2.4 丙三醇酯(PSG)的鏈增長(zhǎng)

丙三醇聚酯結(jié)構(gòu)單元比重、分子量及其分布隨時(shí)間的變化趨勢(shì)如圖5和表2所示。反應(yīng)前6 h， Den單元一直保持6%～8%的低含量，而線型單元L卻隨著末端單元T的消耗迅速增加；說(shuō)明在此階段線型增長(zhǎng)為主要鏈增長(zhǎng)行為。相應(yīng)的，在反應(yīng)的前6 h，聚合物的數(shù)均分子量也增長(zhǎng)緩慢。在6～8 h階段，Den和L單元同時(shí)增加，只有T單元在被消耗，這與支化增長(zhǎng)(grafted growth)相吻合。隨后，在8～48 h期間，末端T單元的比重始終在緩慢下降，而線型L單元(L12+L13)的比重卻在上下波動(dòng)，這說(shuō)明支化增長(zhǎng)和樹(shù)枝狀增長(zhǎng)同時(shí)存在。兩種不同的鏈增長(zhǎng)行為同時(shí)存在最終導(dǎo)致了GPC圖譜上兩個(gè)信號(hào)峰的出現(xiàn)(圖5)。

Log M

總的來(lái)說(shuō)，丙三醇辛二酯的聚合可以分為3個(gè)階段：線型增長(zhǎng)階段、支化增長(zhǎng)階段和支化+樹(shù)枝狀增長(zhǎng)階段。從以上的分析來(lái)看，樹(shù)枝狀鏈增長(zhǎng)行為(dendritic growth)只有在高反應(yīng)活性的線型單元的比重遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于末端基團(tuán)T時(shí)才能成為主要的鏈增長(zhǎng)行為。由于支化鏈增長(zhǎng)的空間位阻較小，其對(duì)反應(yīng)位點(diǎn)的選擇性較弱，所形成的分子結(jié)構(gòu)也就趨向于無(wú)規(guī)支化結(jié)構(gòu)。而無(wú)序的鏈增長(zhǎng)行為也必然導(dǎo)致聚合物的多分散性指數(shù)偏大。所以，PSG不能形成窄分布、規(guī)整的樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)。PSG最終的鏈增長(zhǎng)示意圖如圖6所示。

表2 PSG不同反應(yīng)階段的 1H NMR 和GPC數(shù)據(jù)綜合

圖6 PSG的鏈增長(zhǎng)行為示意圖

通過(guò)簡(jiǎn)單的酶催化聚合，成功合成了結(jié)構(gòu)規(guī)整的、分子量高且分布窄的多元醇聚酯，突破了傳統(tǒng)化學(xué)合成難以獲得的高分子量和窄分布。通過(guò)對(duì)比丙三醇和三羥甲基乙烷的鏈增長(zhǎng)行為，結(jié)果顯示：要想規(guī)避無(wú)規(guī)樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)，必須避免伯羥基和仲羥基的同時(shí)存在，因?yàn)槊复呋磻?yīng)更傾向于選擇性催化伯羥基，仲羥基在其中的反應(yīng)活性較弱。