雙歧桿菌分離株的耐藥性評價

潘 琳 郭慧玲 李麗娜 張文羿 陳永福 孟和畢力格

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室 農(nóng)業(yè)部奶制品加工重點實驗室呼和浩特010018）

雙歧桿菌是一種重要的腸道微生物，可用作益生菌應(yīng)用于食物、醫(yī)藥和飼料中。雙歧桿菌存在于人類體內(nèi)、動物體內(nèi)以及食物中。人類和動物的腸道健康與否都會受到雙歧桿菌的影響[1]。嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）、短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）和長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）被廣泛用于食物補充劑中。在人與動物預(yù)防性使用抗生素的過程中，導致全球的抗生素耐藥性危機[2]。一些有利于人類健康和畜牧業(yè)的細菌類群也產(chǎn)生了抗生素耐藥性。耐藥基因可在相同或者不同類群的細菌之間轉(zhuǎn)移，耐藥性評估是食品和飼料中使用的細菌安全性評估的一部分[3]。在用抗生素治療后，可使用固有抗生素耐藥性的菌株來恢復(fù)腸道菌群的平衡[4]。然而，雙歧桿菌的耐藥基因有可能通過移動元件轉(zhuǎn)移到病原體。通過雙歧桿菌的耐藥表型和基因型分析可以確定耐藥基因的轉(zhuǎn)移潛力[5]。本研究中，評估來自不同來源的20 株雙歧桿菌分離株的耐藥性，并確定它們是否具有將耐藥基因轉(zhuǎn)移到其它細菌的能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株 本試驗用菌株見表1，均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳酸菌菌種保藏庫（LABCC）提供。

1.1.2 試劑 抗生素：氨芐西林（Amp）、慶大霉素（Gen）、卡那霉素（Kan）、鏈霉素（Str）、新霉素（Neo）、克林霉素（Cli）、利奈唑胺（Lin）、萬古霉素（Van）、奎奴普丁/達福普?。≦ui）、四環(huán)素（Tet）、利福霉素（Rif）、環(huán)丙沙星（Cip）、甲氧芐啶（Tri）、紅霉素（Ery）及氯霉素（Chl），均購自美國Sigma 公司。

試劑：所用引物，上海桑尼生物有限公司合成；DNA 提取試劑盒（天根），10×EasyTaq 緩沖液，dNTPs，EasyTaq 酶，10×TBE 緩沖液，核酸染料。

培養(yǎng)基：標準藥敏檢測肉湯培養(yǎng)基，Iso-Sensitest，Oxoid；MRS 肉湯培養(yǎng)基，Oxoid；TPY 液體培養(yǎng)基，青島海博；LSM 液體培養(yǎng)基（90% Iso-Sensitest 肉湯培養(yǎng)基+10% MRS 肉湯培養(yǎng)基）。

1.2 方法

1.2.1 抗生素的配制及菌懸液的制備 15 種抗生素（10 種水溶性，5 種水不溶性）的最小抑菌濃度測定詳見參考文獻[6]。采用雙歧桿菌藥敏試驗的標準溶劑和最終抗生素濃度[7]。采用LSM-cys（LSM+0.03%半胱氨酸鹽酸鹽）液體培養(yǎng)基作為藥敏試驗稀釋劑[6]。

表1 本試驗用雙歧桿菌分離株Table 1 Isolates of Bifidobacterium species used in this study

雙歧桿菌分離株劃線培養(yǎng)在含1.5%瓊脂的TPY 培養(yǎng)基，37 °C 培養(yǎng)在Whitley DG250 厭氧工作站（5% CO2，10% H2，and 85% N2）48 h。在0.85%的生理鹽水中挑取單個菌落并懸浮在生理鹽水中。采用紫外分光光度計測定波長625 nm 處的光密度OD625nm，通過加入生理鹽水調(diào)整稀釋比，使OD625nm值達到0.16～0.2（3×108CFU/mL）。

1.2.2 最小抑菌濃度的測定 20 株雙歧桿菌分離株采用肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），測定標準詳見美國臨床和實驗室標準[7]。將細菌懸浮液稀釋500 倍和100 倍，分別用于測定水溶性抗生素和不溶性抗生素的耐藥性。對于水溶性抗生素，將1 mL 菌懸液與1 mL 抗生素相混合。對于水不溶性抗生素，將0.2 mL 菌懸液與1.8 mL 抗生素相混合。分別以不添加菌懸液和不添加抗生素的空白作為對照。對每組濃度的抗生素濃度做3 個重復(fù)。厭氧培養(yǎng)48 h，記錄MIC 值。MIC 值等于或小于臨界值定義為敏感（S）；MIC 值高于臨界值定義為抗性（R）[8]。MIC 值≥8 μg/mL 和＞32 μg/mL 定義為中等抗性（MR）[9]。選取ATCC15707 作為質(zhì)控菌，檢測試驗的準確性。

1.2.3 耐藥基因的檢測 用DNA 提取試劑盒提取雙歧桿菌分離株的基因組DNA，將其作為模板，根據(jù)表2中不同耐藥性基因的引物進行擴增。每個PCR 反應(yīng)（20 μL）由DNA 模板、引物、10×EasyTaq 緩沖液、dNTPs、酶和ddH2O 組成。擴增條件是：預(yù)變性4 min；30 個循環(huán)：變性94°C 30 s，退火30 s，延伸72 °C 1 min；末端延伸72 °C 7 min。PCR 產(chǎn)物由1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 PCR 檢測用特異性引物Table 2 Specific primers used in the PCR detection

（續(xù)表2）

1.2.4 抗生素耐藥基因轉(zhuǎn)移試驗 以雙歧桿菌為供體，乳酸乳球菌MG1614 和糞腸球菌181 為受體，通過濾膜雜交試驗評價雙歧桿菌種耐藥基因的轉(zhuǎn)移情況[10-11]。供體雙歧桿菌在添加有紅霉素（5 μg/mL）或四環(huán)素（10 μg/mL）的TPY 培養(yǎng)基中37°C 厭氧培養(yǎng)。受體菌株乳酸乳球菌MG1614 和糞腸球菌181 在不含抗生素的GM17 和BHI 培養(yǎng)基中分別于30°C 和37°C 培養(yǎng)。以2%的接種量分別接種到不含抗生素的新鮮MRS 和M17 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600nm值為0.2～0.5。分別取供體菌株和受體菌株1 mL，混合后使用壓力為-50 kPa的泵將混合液通過濾膜 （直徑2.5 cm，孔徑0.45 μm）。再次使用PPS 溶液（0.8%NaCl 和中性細菌蛋白胨） 通過濾膜，確保細菌緊密地貼合在濾膜上。將濾膜無菌置于適合受體生長的環(huán)境中過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)后將濾膜置于2 mL PPS 中，用1 mL PPS 沖洗平板，并再次將洗滌液與原始濾膜置于無菌管中。將無菌管渦旋震蕩后，除去濾膜上所有細胞，10 倍稀釋溶液后將供體、受體和轉(zhuǎn)化結(jié)合子培養(yǎng)在選擇性培養(yǎng)基平板中，將平板在37℃或30 ℃培養(yǎng)48 h，每組試驗3 個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑菌濃度

20 株雙歧桿菌分離株的MIC 值見表3。

20 株雙歧桿菌的MIC 值分布集中在2～128 μg/mL 范圍，見圖1。所有分離株都表現(xiàn)出相似的抗生素敏感性。例如，所有分離株對卡那霉素都有耐藥性 （MIC 64～1024 μg/mL），而對氨芐西林（0.032～2 μg/mL）、慶大霉素（2～64 μg/mL）、鏈霉素（2～128 μg/mL）和利奈唑胺（0.125～4 μg/mL）敏感。各分離株對氯霉素、環(huán)丙沙星、克林霉素、紅霉素、四環(huán)素、甲氧芐啶、奎奴普丁/達福普汀、利福平、新霉素和萬古霉素的敏感性存在多樣化。菌株IMAUFB113 對卡那霉素的MIC 值為256 μg/mL，而對氨芐西林的最低MIC 值卻只有0.0625 μg/mL；菌株IMAUFB271 和IMAUFB272 同屬于假長雙歧桿菌球旋蟲亞種，卻對新霉素的敏感程度不同。同樣，菌株IMAUFB102，IMAUFB103，IMAUFB104，IMAUFB105，IMAUFB106 及DSM-10140同屬于動物雙歧桿菌乳酸亞種，也對環(huán)丙沙星、四環(huán)素、甲氧芐啶及紅霉素表現(xiàn)出不同的敏感及抗性程度。

[12]Chl[12]Ery[9]Tri 4S＜0.125S 0.0625S 1S 1R＜0.125S 1S 0.125S＜0.125S 4S 0.0625S＞64R 1S 1R 1S 2S 0.125S＜0.125S 32R＞8R＞64R 32R＞8R 32R 64R＞8R 32R 64R 2R 64R 32R＞8R 32R 2S 0.125S 64R 16R＞8R 64R 4S 8R 32R 2S＞8R 32R 32R＞8R 32R 64R 8R 64R 1S 4R 16MR 0.5S 0.032S 32R 0.5S 0.125S 32R[9]2S[9]ND[9]16MR普奴v；Qui：奎素霉古；Van：萬胺）（μg/mL值MIC的株離分菌桿歧雙株20 3表）（μg/mL The MIC values for the 20 Bifidobacterium isolates Table 3 [9]Cip[9]Rif[12]Tet[9]Qui[12]Van[9]Lin[12]Cli[9]Neo[12]Str[12]Kan[12]Gen[12]Amp素生抗株離分8MR 0.25S 16R 1S 0.5S 1S＜0.032S 32R 64S 256R 64S 0.25S IMAUFB102 4S 0.25S 8S 0.25S＜0.25S 1S＜0.032S 32R 128S 256R 64S 0.25S IMAUFB103 4S 0.25S 16R 0.25S 0.5S 0.5S＜0.032S 32R 32S 256R 32S 0.25S IMAUFB104 32R 1S 8S 4S 1S 2S 0.125S 32R 16S 128R 16S 1S IMAUFB105 4S 0.25S 8S 0.5S＜0.25S 1S＜0.032S 16MR 32S 128R 16S 0.125S IMAUFB106 4S 1S 32R 0.25S 0.5S 2S＜0.032S 32R 16S 256R 32S 0.125S DSM-10140 64R 16MR 32R 8MR＞128R 4S 8R 32R 64S＞1 024R 64S 1S IMAUFB271 128R 4S 64R 4S＞128R 2S＞16R 2S 128S 512R 32S 2S IMAUFB272 16MR 16MR 32R 4S＞128R 4S 16R 32R 128S＞1 024R 16S 1S IMAUFB125 128R 8MR 64R 4S＞128R 4S 8R 32R 64S 512R 64S 2S IMAUFB126 16MR 8MR 32R 4S＞128R 4S 16R 32R 64S＞1 024R 64S 1S IMAUFB127 1S 0.25S 4S 0.125S＜0.25S 1S 0.5R 4S 2S 128R 8S＜0.032S IMAUFB134 4S 4S 4S 0.25S 8R 1S 16R 32R 32S 512R 16S 1S IMAUFB135 32R 4S 32R 4S 1S 2S 0.5R 32R 128S＞1 024R 32S 0.5S IMAUFB137 32R 0.25S 16R 0.125S＜0.25S 0.5S＞16R 16R 8S 64R 4S 0.25S IMAUFB139 4S 32R 16R 2S 128R 4S 16R 32R 128S＞1 024R 64S 2S IMAUFB140 64R 4S 64R 4S＞128R 4S 16R 32R 128S＞1 024R 64S 2S IMAUFB141 4S＜0.125S 4S 0.125S＜0.25S 0.125S 16R 4S 4S 256R 2S 0.0625S IMAUFB113 8MR 1S 8S 0.5S 128R 1S 8R 32R 128S 512R 64S 2S IMAUFB108 4S 0.25S 4S 0.25S 128R 1S 4R 32R 64S 256R 2S 0.25S IMAUFB110[9]4S[9]0.5S[9]1S[9]0.25S[9]0.5S[6]1S[9]＜0.032S[9]32R[9]8S[9]128R[9]8S[9]0.5S ATCC15707唑奈；Lin：利素霉林；Cli：克素霉；Neo：新素霉；Str：鏈素霉那；Kan：卡素霉大；Gen：慶林西芐；Amp：氨；ND：無性抗等；MR：中感；S：敏藥：R：耐。素霉；Chl：氯素霉；Ery：紅啶芐氧ciprofloxacin；Tri：甲星沙丙；Cip：環(huán)平福；Rif：利素環(huán)；Tet：四汀普福/達注丁

對雙歧桿菌菌株耐藥譜的測定，將有助于開發(fā)用于產(chǎn)品雙歧桿菌計數(shù)的選擇性試劑，提高對抗生素對正常腸道菌群影響的認識[13]。Xiao 等[14]從酸奶、膳食補充劑和嬰兒糞便中分離出的雙歧桿菌的MIC 值（n=23）與本研究顯示的耐藥譜的情況類似。卡那霉素是氨基糖苷蛋白合成抑制劑，作用于30 s 核糖體RNA 可導致對mRNA 密碼的誤讀。從嬰兒糞便中分離的雙歧桿菌通常對氨基糖苷類抗生素具有耐藥性[15-16]。此外，Aloisio 等[17]為了治療新生兒腸道疾病，篩選出的15 株雙歧桿菌分離株對卡那霉素具有耐藥性 （MIC 64～256 μg/mL）。氨芐青霉素是β-內(nèi)酰胺類抗生素，其與青霉素結(jié)合蛋白（PBP）的羧基末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合而導致青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）的不可逆失活[18]，進而導致細胞壁結(jié)構(gòu)的損傷，影響細胞壁的滲透性和細胞的生長[19]。根據(jù)歐洲食品安全管理局（EFSA）的斷點測定標準，這5 個被評估的雙歧桿菌亞種都對氨芐西林敏感，這與文獻[20]，[21]，[22]的研究結(jié)果一致。

圖1 20 株雙歧桿菌菌株的MIC 值分布Fig.1 The MIC values distribution of 20 Bifidobacterium isolates

20 株雙歧桿菌都對氨基糖苷類抗生素-慶大霉素和鏈霉素敏感，而MIC 值都較高。Georgieva等[22]研究表明鏈霉素對19 株雙歧桿菌MIC 值都較高，在8～64 μg/mL 范圍。

Behra-Miellet 等[24]用瓊脂稀釋法檢測雙歧桿菌菌株的MIC 值，在0.25～4 mg/L 范圍，所有菌株對利奈唑胺表現(xiàn)出耐藥性[23]。另一項研究[14]稱，從日本市場上食品、膳食補充劑和藥品中分離出來的23 株雙歧桿菌都對利奈唑胺敏感。Xiao 等[14]以及Behra-Miellet 等[23]的研究也表明不同的雙歧桿菌菌株對利奈唑胺表現(xiàn)出不同的耐藥性。

Masco 等[24]報道動物雙歧桿菌乳酸亞種和青春雙歧桿菌菌株對奎奴普丁/達福普汀和利福平敏感，對甲氧芐氨嘧啶、環(huán)丙沙星、克林霉素和四環(huán)素有不同程度的敏感性和耐藥性，這與本文結(jié)果相符。

雙歧桿菌通常對氯霉素敏感[25-26]。此外，氯霉素的最高MIC 值為64 μg/mL，與Kheadr 等[16]研究結(jié)果一致；然而，商業(yè)雙歧桿菌菌株，例如長雙歧桿菌ATCC 27536、ATCC 15708、ATCC 15700 和假長雙歧桿菌ATCC 25526 的MIC 值略高于此前報道。上述結(jié)果表明：雙歧桿菌菌株具有特異性的抗生素耐藥性。從犬和靈長類動物糞便中分離出來的雙歧桿菌，據(jù)報道[27]對四環(huán)素以外的抗生素敏感。事實上，雙歧桿菌對四環(huán)素和新霉素具有不同程度的敏感性[20]。在另一項研究中，從人類、動物和益生菌中分離出來的100 個雙歧桿菌都對奎奴普丁/達福普汀敏感[24]。相比金黃色葡萄球菌和糞腸球菌，雙歧桿菌基本不會對奎奴普丁/達福普汀產(chǎn)生耐藥性[28]。

2.2 抗性基因檢測結(jié)果

20 株雙歧桿菌抗性基因的檢測結(jié)果見表4。大多數(shù)的分離株含有tet（W）。分離株IMAUFB271和IMAUFB272 不含tet（W），而含有tet（K）基因。分離株IMAUFB125、IMAUFB134 和IMAUFB140 3 株菌株都有ant（6）和tet（W）基因。在20 株分離株中未檢測到與其它抗生素耐藥性相關(guān)的基因。

表4 20 株雙歧桿菌分離株的抗性基因檢測結(jié)果Table 4 Genotypic detection of resistance genes for 20 Bifidobacterium isolates

2.3 耐藥性基因轉(zhuǎn)移結(jié)果

選取檢測出具有抗性基因并同時MIC 表現(xiàn)為抗性的8 株雙歧桿菌作為供體 （見表5），乳酸乳球菌MG1614 和糞腸球菌181 作為受體，進行篩選交配試驗，評估耐藥基因的轉(zhuǎn)移潛力。

表5 試驗用供體菌株Table 5 Donor isolates used in the experiment

在濾膜雜交后的選擇性培養(yǎng)基中，沒有產(chǎn)生轉(zhuǎn)化結(jié)合子的菌落，說明沒有發(fā)生耐藥基因的轉(zhuǎn)移。一些雙歧桿菌的其它種屬可能會攜帶這種基因，例如動物雙歧桿菌乳酸亞種DSM-10140 因tet（W）的存在而具有四環(huán)素抗性[29]。Moubareck 等[30]的研究中，35 株嗜熱雙歧桿菌 （B.thermophilum）和3 株假長雙歧桿菌菌株中因具有tet（W）基因而同樣具有四環(huán)素抗性。許多細菌分離株，特別是革蘭氏陽性細菌分離株都含有多種四環(huán)素抗性基因。然而，到目前為止，在雙歧桿菌抗性基因的研究中，還沒有出現(xiàn)過多重四環(huán)素抗性基因。

基因的水平轉(zhuǎn)移可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導或結(jié)合發(fā)生，而結(jié)合在乳酸菌和雙歧桿菌的耐藥基因轉(zhuǎn)移過程中十分重要。本文評估了雙歧桿菌和乳酸乳球菌（L.lactis） MG1614 或糞腸球菌181 之間抗生素耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的潛力。據(jù)報道，大約14%～30%的雙歧桿菌對四環(huán)素具有耐藥性[30]。在菌株動物雙歧桿菌乳酸亞種Bb-12 中同樣存在tet（W）基因，而耐藥基因沒有轉(zhuǎn)移到任何受體菌株中[31]。初步試驗數(shù)據(jù)表明，長雙歧桿菌H66 和長雙歧桿菌L42 也沒有將tet（W）轉(zhuǎn)移到易感菌株。據(jù)報道，erm（X）基因的決定因素由Tn5432 轉(zhuǎn)座子攜帶，在長雙歧桿菌SQS4-63 和長雙歧桿菌SQS7-31 中同時存在[32]。這表明erm（X）基因可以從長雙歧桿菌水平轉(zhuǎn)移到其它雙歧桿菌屬。從雙歧桿菌中很少檢測到耐抗生素耐藥性質(zhì)粒和基因轉(zhuǎn)移原件；事實上，在雙歧桿菌中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于耐藥基因的可轉(zhuǎn)移原件[33]。此外，雙歧桿菌的轉(zhuǎn)座結(jié)合機制也降低了耐藥基因的轉(zhuǎn)移效率[34-35]。

3 結(jié)論

本試驗中檢測來自中國的20 株雙歧桿菌的抗生素耐藥性，評估這種耐藥基因轉(zhuǎn)移到其它物種的能力。這些雙歧桿菌分離株對15 種抗生素的敏感性和耐藥性類似，它們對某些抗生素的敏感性因物種不同而不同，甚至同一物種的不同菌株對抗生素耐藥性也不同。部分菌株經(jīng)PCR 鑒定具有耐藥基因，這些菌株將耐藥基因保留在菌株內(nèi)，不會轉(zhuǎn)移到其它細菌甚至于致病菌中。這表明雙歧桿菌與進一步出現(xiàn)的抗生素耐藥性細菌無關(guān)，20 株雙歧桿菌是安全的。