冀東野生大豆(Glycine soja)耐鹽堿性鑒定及耐性生理指標測定

符楊磊 魏志園 王 宇 劉瀟陽 王冰冰 喬亞科 李桂蘭 張 鍇,*

(1河北科技師范學院農(nóng)學與生物科技學院，河北 秦皇島 066000；2河北科技師范學院園藝科技學院，河北 秦皇島 066000)

鹽堿地是遍布全球的一種土壤類型，具有較大的潛在利用價值。我國有近4 000萬hm2鹽堿荒地和200萬hm2沿海灘涂，尤其是冀東濱海地區(qū)鹽堿地分布廣泛。冀東地區(qū)鹽漬化土壤呈沿海帶狀縱深分布，pH值最高達8.0，土壤pH值高于7.5的土地面積達34%[1]。土壤鹽堿化會導致土粒高度分散或板結(jié)，滲水性失調(diào)，嚴重影響植物在土壤中扎根生長。由于缺少耐鹽堿作物品種，不適合傳統(tǒng)作物生長的鹽堿地得不到充分利用，因此，篩選耐鹽堿作物種質(zhì)資源是充分利用鹽堿地資源，解決日益增長的糧食需要與耕地面積不足之間矛盾的重要途徑之一。我國是大豆的起源地，保存有豐富的野生大豆(Glycinesoja)資源。野生大豆資源中蘊含豐富的抗性基因，與耐鹽堿相關(guān)的基因可參與調(diào)控植株鹽堿脅迫反應[2-4]，增強耐鹽堿能力，且已通過轉(zhuǎn)基因驗證[5-6]。野生大豆中的抗性基因可用于拓寬栽培大豆的遺傳基礎(chǔ)，培育抗性栽培大豆新品種。

鹽堿脅迫對植物的傷害主要表現(xiàn)在滲透脅迫、離子毒害[7]和高pH值損傷，脅迫下植物細胞內(nèi)Na+濃度升高，造成脂質(zhì)過氧化，并伴隨著電解質(zhì)的外滲[8-9]。丙二醛(malondialdehyde, MDA)是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量反映了質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化水平；電解質(zhì)外滲率是判斷電解質(zhì)外滲水平的指標，反映了細胞在脅迫狀態(tài)下的損傷程度；可溶性糖和脯氨酸可以調(diào)節(jié)細胞滲透壓，在鹽堿、干旱等脅迫下脯氨酸及可溶性糖含量有升高的趨勢[10-12]。植株體內(nèi)脯氨酸合成關(guān)鍵酶吡咯琳-5-羧酸合成酶(pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)、吡咯琳-5-羧酸還原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR)及介導脯氨酸降解的脯氨酸脫氫酶(proline dehydrogenase，PDH)對脅迫下植株脯氨酸含量具有重要調(diào)節(jié)作用[13-14]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，P5CS基因可由干旱、鹽脅迫和植物激素脫落酸(abscisic acid, ABA)誘導[15]。過表達P5CS的轉(zhuǎn)基因煙草植株中脯氨酸含量升高，對滲透脅迫耐性增強[16]。因此，P5CS和P5CR對植物脯氨酸的生物合成及維持細胞滲透平衡具有重要意義[17]。此外，王臻昱等[18]對野生大豆GsGST19基因功能進行研究，發(fā)現(xiàn)過表達GsGST19基因的苜蓿耐鹽堿能力提高。鑒于脯氨酸代謝酶基因及GSTs基因在植物耐鹽堿脅迫中的作用，本研究選取GmP5CS、GmP5CR、GmPDH和GsGST19基因以研究不同耐性野生大豆材料在鹽堿脅迫下基因的表達情況。

本研究對349份野生大豆種質(zhì)資源進行抗鹽堿性鑒定，對不同耐性野生大豆種質(zhì)在鹽堿脅迫下的脯氨酸、MDA、可溶性糖含量，電解質(zhì)外滲率及GmP5CS、GmP5CR、GmPDH和GsGST19基因的表達進行測定，旨在篩選高耐鹽堿的野生大豆材料，為野生大豆抗鹽堿資源利用、抗性機理研究和培育優(yōu)質(zhì)抗性大豆新品種提供育種材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生大豆材料共349份，由河北科技師范學院野生大豆資源課題組提供。

1.2 試驗設(shè)計

野生大豆籽粒利用小刀破泥漿膜后播種于直徑10 cm的營養(yǎng)缽內(nèi)。缽中培養(yǎng)介質(zhì)以營養(yǎng)土和蛭石按等體積配置。每缽播種3粒野生大豆，每個野生大豆材料種植9缽，置于溫室中生長。溫室溫度25℃/15℃，每天日照時長14 h。待幼苗第一對真葉完全展開后進行鹽堿液處理，鹽堿液按NaCl∶Na2CO3(無水)=1∶3質(zhì)量分數(shù)配置(調(diào)pH值至8.0)。鹽堿液濃度為0(CK)、100和200 mmol·L-1，每種濃度處理3缽。每隔3 d澆一次鹽堿液，每次150 mL，共澆3次。最后一次處理3 d后用清水進行透灌。設(shè)置3次生物學重復。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 野生大豆耐鹽堿性等級調(diào)查 清水透灌3 d后，按照羅教芬[19]的方法進行耐鹽堿性等級調(diào)查。具體分為5等級：1級(高耐)：植株未表現(xiàn)受害癥狀，生長與CK無差異；2級：植株生長基本正常，個別植株下部有萎蔫癥狀；3級：植株受害癥狀(主要為葉片表現(xiàn)枯萎癥狀)達整個植株三分之一；4級：植株受害癥狀達整個植株二分之一；5級：植株受害癥狀在整個植株二分之一以上，甚至死亡。

每個野生大豆材料調(diào)查9株，鹽堿性等級取9株中受害等級最高者。本試驗選取高耐材料1份、敏感材料2份進行后續(xù)指標的測定。

1.3.2 脯氨酸含量測定 由于鹽堿脅迫下植物脯氨酸含量有升高趨勢[10, 12]，故測定了鹽堿脅迫下野生大豆材料脯氨酸含量。于鹽堿脅迫處理0(處理后立即取樣)、3、10、24、48 h后取0.1 g野生大豆植株葉片加入3 mL 3%磺基水楊酸溶液，煮沸10 min，過濾，濾液加入2 mL冰醋酸和2 mL 2.5%酸性茚三酮溶液，沸水煮沸30 min。溶液冷卻后加入4 mL甲苯，充分搖蕩混勻，靜置分層后用移液槍吸取上層液至新的10 mL離心管中，3 000 r·min-1離心5 min，上清液利用UV1901PC型紫外分光光度計(上海奧析公司)于520 nm波長處讀取吸光度值。

1.3.3 MDA含量測定 分別于鹽堿脅迫處理0、3、10、24、48 h后取0.1 g野生大豆植株葉片，加入2 mL 5%三氯乙酸溶液，研磨后3 000 r·min-1離心10 min。吸取1 mL上清液至新的離心管中，加入2 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，充分混勻后沸水煮沸30 min，3 000 r·min-1離心10 min，上清液分別于450、532和600 nm波長處測定吸光度值。

1.3.4 可溶性糖含量測定 分別于鹽堿脅迫處理0、3、10、24、48 h后取0.1 g野生大豆植株葉片，加入10 mL蒸餾水，沸水煮沸20 min，冷卻至室溫后定容至100 mL。取1 mL定容液加入5 mL 0.2%蒽酮溶液，于620 nm波長處測定吸光度值。

1.3.5 電解質(zhì)外滲率測定 分別于鹽堿脅迫處理0、3、10、24、48 h后取0.1 g野生大豆植株葉片材料于離心管中，加入10 mL去離子水，將離心管放入真空干燥機中用真空泵抽氣10 min，抽氣后緩緩打開閥門，將離心管取出后于室溫放置24 h，期間多次晃動，促進水分交換，利用DDS-307電導儀(上海儀分科學儀器有限公司)測定其電導值，作為初值(K1)，以去離子水為空白對照組。測完初值的離心管放入沸水中煮沸10 min，以殺死細胞組織，待其冷卻至室溫后，搖勻，測其電導值，作為終值(K2)。根據(jù)公式計算電解質(zhì)外滲率：

電解質(zhì)外滲率=K1/K2×100%

(1)。

1.3.6 耐鹽堿相關(guān)基因表達測定 分別于鹽堿脅迫處理0、3、10、24、48 h后取野生大豆材料植株葉片提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。以cDNA為模板，β-Tubulin為內(nèi)參基因進行耐鹽堿相關(guān)基因表達量測定。GmP5CS、GmP5CR和GmPDH基因序列通過NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取，其GenBank登錄號分別為AY492005 547907和NM_001250359，GsGST19(JQ031560)基因序列通過王臻昱等[18]研究報告獲取。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計基因全長序列的定量PCR引物(表1)。利用CFX96型熒光定量PCR儀(美國伯樂公司)進行定量PCR測定，試劑盒采用One Step SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR 試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)利用SAS 9.2和Microsoft Excel 2003進行統(tǒng)計，利用Duncan’s多重比較法進行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 冀東野生大豆耐鹽堿鑒定結(jié)果

349份野生大豆進行耐鹽性鑒定結(jié)果如表2所示。由于200 mmol·L-1鹽堿液處理野生大豆后全部植株的耐鹽堿等級均表現(xiàn)為5級，故本研究結(jié)果為100 mmol·L-1鹽堿液處理后野生大豆的耐鹽堿性等級。表現(xiàn)1級的高耐材料有Yong 2和2010-12，占總數(shù)的0.57%；表現(xiàn)2級的耐性材料有22份，占總數(shù)的6.30%；表現(xiàn)3級的材料共80份，占總數(shù)的22.92%；表現(xiàn)4級的材料共77份，占總數(shù)的22.06%，表現(xiàn)5級的材料共161份，占總數(shù)的46.13%。冀東地區(qū)野生大豆材料對鹽堿脅迫表現(xiàn)3級及以上的占總數(shù)的91.11%，表明這些野生大豆材料對本試驗中所用鹽堿處理水平的耐性較差。篩選到野生大豆材料Yong 2和2010-12對鹽堿脅迫耐性好，可作為耐鹽堿相關(guān)研究的種質(zhì)材料。

表2 野生大豆耐鹽堿鑒定結(jié)果Table 2 Results of salt and alkali tolerance of wild soybean

表2(續(xù))

2.2 鹽堿脅迫下3種野生大豆材料的脯氨酸含量

高耐野生大豆材料2010-12和敏感野生大豆材料2012-34和2012-49在100與200 mmol·L-1鹽堿液脅迫下脯氨酸含量測定結(jié)果如圖1所示。高耐野生大豆材料2010-12在鹽堿脅迫處理后脯氨酸含量在各脅迫時間點均較CK顯著升高，并且100與200 mmol·L-1的鹽堿液處理間無顯著差異。敏感野生大豆材料2012-34和2012-49脯氨酸含量在2種濃度的鹽堿液脅迫處理下隨著脅迫時間的延長與CK均無顯著差異。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note： Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.圖1 不同野生大豆材料在鹽堿脅迫下的脯氨酸含量Fig.1 Proline content in different wild soybean materials under saline-alkali stress

圖2 鹽堿脅迫下不同野生大豆材料MDA含量Fig.2 MDA content in different wild soybean materials under saline-alkali stress

2.3 鹽堿脅迫下3種野生大豆材料MDA含量

由圖2可知，高耐野生大豆材料2010-12在100與200 mmol·L-1鹽堿液處理下MDA含量在各脅迫時間點與CK相比均無顯著差異。敏感野生大豆材料2012-34和2012-49在鹽堿脅迫處理后各脅迫時間點MDA含量均較CK顯著升高，2種濃度鹽堿脅迫處理間無顯著差異。

2.4 鹽堿脅迫下3種野生大豆材料可溶性糖含量

由圖3可知，高耐野生大豆材料2010-12在100與200 mmol·L-1的鹽堿脅迫后可溶性糖含量均較CK顯著升高，但2種濃度鹽堿液處理間無顯著差異。敏感野生大豆材料2012-34和2012-49在2種濃度的鹽堿液脅迫處理下各脅迫時間點與CK均無顯著差異。

圖3 鹽堿脅迫下不同野生大豆材料可溶性糖含量Fig.3 Soluble sugar content in different wild soybean materials under saline-alkali stress

2.5 鹽堿脅迫下3種野生大豆材料電解質(zhì)外滲率

鹽堿脅迫下3份野生大豆植株電解質(zhì)外滲率的測定結(jié)果如圖4所示。100與200 mmol·L-1鹽堿液脅迫下，高耐野生大豆材料2010-12在各脅迫時間點電解質(zhì)外滲率與CK相比均無顯著差異。敏感野生大豆材料2012-34和2012-49在2種濃度鹽堿液處理下各脅迫時間點均較CK顯著升高，且2種濃度鹽堿液處理間無顯著差異。

圖4 鹽堿脅迫下不同野生大豆材料電解質(zhì)外滲率Fig.4 Electrolyte exosmosis rate in different wild soybean materials under saline-alkali stress

2.6 鹽堿脅迫下3種野生大豆材料基因表達結(jié)果

鹽堿脅迫下野生大豆材料耐鹽堿相關(guān)基因表達情況如圖5所示，高耐鹽堿野生大豆材料2010-12在2種濃度鹽堿脅迫后GmP5CS、GmP5CR和GsGST19的表達量均升高，在各脅迫時間點與CK相比均達到差異顯著水平；GmPDH的表達量降低，在各脅迫時間點與CK相比均達到差異顯著水平。敏感野生大豆材料2012-34和2012-49在2種濃度鹽堿脅迫后4個基因的表達量與CK相比均無顯著差異。

3 討論

野生大豆中的優(yōu)異基因是栽培大豆優(yōu)異基因的重要來源，對于拓寬栽培大豆遺傳多樣性十分重要。目前已發(fā)現(xiàn)一些高耐鹽堿的野生大豆種質(zhì)資源。葛瑛等[20]對采集于吉林省白城市的345份野生大豆材料進行耐鹽堿性鑒定，篩選得到9份耐鹽堿性較強的野生大豆材料；肖鑫輝等[21]對津唐渤海灣沿海地區(qū)的895份野生大豆材料進行高濃度鹽堿脅迫，發(fā)現(xiàn)只有8.5%的材料活到了成熟期，最終篩選出15份耐鹽堿較好的野生大豆種質(zhì)。這些研究表明自然界中存在高耐鹽堿的野生大豆種質(zhì)資源。本研究利用采集于冀東地區(qū)的349份野生大豆種質(zhì)進行耐鹽堿性鑒定，處理的鹽堿液濃度為100 和200 mmol·L-1，比一般研究所用鹽堿脅迫濃度高，目的是在高濃度鹽堿脅迫下篩選極端耐鹽堿的野生大豆種質(zhì)資源。研究發(fā)現(xiàn)耐性等級為3、4、5的野生大豆材料占絕大多數(shù)(93.13%)，可能與鹽堿脅迫處理的濃度較高有關(guān)；耐性等級1級和2級的野生大豆種質(zhì)共24份(6.87%)，可作為優(yōu)異種質(zhì)培育耐鹽堿栽培大豆。

Yu等[22]發(fā)現(xiàn)在鹽堿脅迫下，菜豆(Phaseolusvulgaris)植株體內(nèi)可溶性糖和脯氨酸含量升高，這對保持細胞離子平衡，維持細胞pH值有一定作用。此外，Jiao等[23]研究發(fā)現(xiàn)在鹽堿脅迫下，高耐野生大豆材料體內(nèi)的脯氨酸合成通路較敏感材料顯著激活，符楊磊[24]發(fā)現(xiàn)野生大豆脯氨酸含量在鹽堿脅迫48 h后較對照顯著增加。本研究對鹽堿脅迫下不同耐性水平野生大豆植株體內(nèi)MDA、脯氨酸、可溶性糖含量和電解質(zhì)外滲率進行測定，結(jié)果與前人相似。高耐鹽堿野生大豆2010-12在鹽堿脅迫下植株體內(nèi)脯氨酸和可溶性糖含量較CK顯著升高，MDA含量與電解質(zhì)外滲率與CK無顯著差異。說明高耐材料在鹽堿脅迫下電解質(zhì)外滲率低，能夠維持較穩(wěn)定的離子平衡，與其脯氨酸及可溶性糖含量升高有關(guān)。脯氨酸和可溶性糖對植物細胞滲透調(diào)節(jié)十分重要[25]，多種植物在鹽堿脅迫下脯氨酸和可溶性糖含量均呈升高趨勢[26-29]。但也有研究表明，脯氨酸含量升高與植株的耐鹽堿性無相關(guān)性，其含量升高只是植株在逆境下的一種被動反應。如Chen等[30]發(fā)現(xiàn)鹽堿脅迫下，耐鹽大麥(Hordeumvulgare)材料植株脯氨酸含量與對照無顯著差異，而Lacerda等[31]發(fā)現(xiàn)感性高粱(Sorghumbicolor)材料植株體內(nèi)積累了更多的脯氨酸，此外Lv等[32]發(fā)現(xiàn)水稻(Oryzasativa)在鹽堿脅迫下全部材料體內(nèi)脯氨酸含量均升高。綜上所述，植物在鹽堿脅迫下脯氨酸積累量與其耐性水平的相關(guān)性需進一步研究。

在滲透脅迫下，P5CS和P5CR是脯氨酸合成的關(guān)鍵酶，滲透脅迫解除后，PDH對植物脯氨酸含量恢復至正常狀態(tài)十分重要[33]。如Tavakoli等[34]和Lv等[35]分別對小麥(Triticumaestivum)和水稻進行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫處理下，小麥植株體內(nèi)P5CS和P5CR上調(diào)表達、PDH下調(diào)表達，脯氨酸含量升高[34]，水稻植株體內(nèi)脯氨酸合成基因(OsP5CS1，OsP5CS2和OsP5CR)以及降解酶基因(OsPDH1)的表達量顯著上調(diào)，脯氨酸含量升高[35]。本研究測定了脯氨酸合成相關(guān)基因GmP5CS、GmP5CR以及降解相關(guān)基因GmPDH的表達量，結(jié)果與前人相似。在鹽堿脅迫下，高耐野生大豆材料2010-12中GmP5CS和GmP5CR上調(diào)表達，GmPDH下調(diào)表達，而在敏感野生大豆材料2012-34和2012-49中GmP5CS、GmP5CR及GmPDH的表達量與CK無顯著差異。以上結(jié)果說明，鹽堿脅迫下高耐野生大豆材料脯氨酸合成通路激活，結(jié)合其細胞內(nèi)脯氨酸含量升高，表明在鹽堿脅迫下，高耐野生大豆材料脯氨酸的上調(diào)可能與其抗性較高有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究對采集于冀東地區(qū)的349份野生大豆材料進行耐鹽堿性鑒定，發(fā)現(xiàn)Yong 2和2010-12等野生大豆材料對鹽堿脅迫耐性較高，為培育耐鹽堿栽培大豆提供了種質(zhì)資源。另外，在鹽堿脅迫下，高耐鹽堿野生大豆GsGST19表達量顯著升高，說明GsGST19基因在植株鹽堿脅迫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮了重要作用，這對GSTs基因功能研究具有重要意義。此外，高耐鹽堿野生大豆材料脯氨酸及可溶性糖含量顯著升高，丙二醛含量及電解質(zhì)外滲率無顯著變化，脯氨酸合成關(guān)鍵酶基因GmP5CS和GmP5CR上調(diào)表達，降解關(guān)鍵酶基因GmPDH下調(diào)表達，說明鹽堿脅迫下高耐鹽堿野生大豆脯氨酸合成通路激活，脯氨酸積累量升高，這對野生大豆抵抗鹽堿脅迫十分重要。