硒鎘交互作用對西葫蘆幼苗生長及抗氧化酶活性的影響

郭 鋒 吳偉鋒 馮 瑜 許劍敏 馬祥愛

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山西 太谷 030801)

鎘(Cd)是一種對植物、動物和人類具有較高毒性的重金屬污染物之一。土壤中Cd具有較強的流動性和較高的生物有效性[1-3]，容易被植物通過根部吸收運輸至其他部位產(chǎn)生損傷作用，不僅會影響植物的正常生長發(fā)育和產(chǎn)量[4-8]，還會富集到植物的可食部分，通過食物鏈對人類健康造成威脅[1]，因此應(yīng)積極探索有效的方法以緩解Cd對植物的損害以及減少其富集量。研究發(fā)現(xiàn)，對農(nóng)作物施加外源礦物質(zhì)元素，如硅(Si)、硒(Se)、鋅(Zi)等，可以作為一種安全有效的方法來緩解Cd對植物的毒害作用，同時可以增加農(nóng)作物體內(nèi)這類礦質(zhì)營養(yǎng)元素的含量[9-12]。

硒(Se)是動物和人類必需的營養(yǎng)元素之一?，F(xiàn)尚無證據(jù)表明Se是高等植物的必需微量元素，但研究發(fā)現(xiàn)在各種環(huán)境脅迫下，Se能保護(hù)植物免受危害[13-14]。如Cd脅迫下，外源Se能夠緩解Cd對植物的毒害作用，減少對Cd的吸收和富集[5, 14-15]。然而有研究認(rèn)為Se對Cd脅迫下植物的生長發(fā)育呈現(xiàn)雙重濃度效應(yīng)，低劑量Se能夠促進(jìn)植物生長，高劑量Se作為氧化強化劑反而對植物產(chǎn)生傷害[16-18]。由于Se和Cd在植物體內(nèi)存在一定的劑量效應(yīng)，因此探討緩解Cd脅迫的最佳Se濃度具有非常重要的研究意義。

目前，外源Se對Cd脅迫緩解作用的研究在菜心[19]、豆瓣菜[20]、油菜[21-22]、煙草[23]、向日葵[24]、水稻[25]、黃瓜[18]、菠菜[26]等作物中已有報道，但關(guān)于Se緩解Cd脅迫對西葫蘆(CucurbitapepoL.)毒害的相關(guān)研究鮮有報道。西葫蘆作為一種大眾消費的蔬菜，在我國各地全年均有種植和銷售。本研究以西葫蘆幼苗為研究對象，利用沙培法研究不同濃度Se和Cd交互作用對西葫蘆幼苗生長、抗氧化酶活性及Cd和Se含量的影響，闡明Se與Cd交互作用之間的關(guān)系和劑量效應(yīng)，探求緩解Cd脅迫的最佳外源Se濃度，以期為緩解作物中Cd毒害的同時提高Se含量的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試西葫蘆品種為早青一代，購自山西省太谷縣藝榮蔬菜種苗經(jīng)營部；供試Cd2+以氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)形態(tài)加入，Se4+以亞硒酸鈉(Na2SeO3·5H2O)形態(tài)加入，均為分析純。

1.2 試驗設(shè)計

參照文獻(xiàn)[27]的方法和濃度設(shè)計。將過16目篩的細(xì)沙于干燥箱中130℃高溫滅菌24 h，按照表1的濃度組合將配制好的CdCl2溶液與Na2SeO3溶液分別噴灑于細(xì)沙中，不斷攪拌使2種溶液與細(xì)沙混合均勻。把含有不同濃度CdCl2和Na2SeO3的細(xì)沙分別裝于塑料營養(yǎng)缽(10 cm×10 cm)中，平衡1周。精選飽滿一致的西葫蘆種子，用0.1% HgCl2溶液消毒10 min，流動自來水沖凈，蒸餾水反復(fù)沖洗5次后，播種于塑料營養(yǎng)缽中，每缽播種20粒種子，試驗共設(shè)置12個不同濃度組合，每個組合3次重復(fù)。采用完全隨機區(qū)組排列，然后放入HP-2808型光照培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián)電子有限公司)進(jìn)行恒溫光照培養(yǎng)，溫度為25±1℃，相對濕度為60%～75%。試驗期間采用稱重法用去離子水及時補充損失水分，使?fàn)I養(yǎng)缽細(xì)砂中Cd2+和Se4+濃度保持恒定，共培養(yǎng)15 d后第一片真葉展開時采集樣品進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.3 測定項目與方法

每處理隨機選取10株長勢一致的植株，利用直尺測定幼苗的苗高；采用千分之一電子天平對所選植株稱重，取其平均值為單株鮮重(g)，然后于烘箱中105℃殺青0.5 h，70℃烘干至恒重，稱重即為干重；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測定：選取西葫蘆幼苗葉片采用氮藍(lán)四唑(nitro-blue tetrazolium, NBT)光化還原法測定[27]；過氧化物酶(peroxidase，POD)活性測定：選取西葫蘆幼苗葉片采用愈創(chuàng)木酚法測定[27]；Cd和Se含量測定: 取西葫蘆幼苗地上部干樣1.00 g經(jīng)混酸(硝酸和高氯酸)消解，采用AA240Z石墨爐原子吸收分光光度計(Varina，美國)測定Cd含量, 采用AFS-230E原子熒光光度計(北京海光儀器有限公司)測定Se含量[28]。

表1 不同濃度Cd2+ 和Se4+組合Table 1 Different concentration combinations of Cd2+ and Se4+

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗結(jié)果均為3次重復(fù)的平均值。利用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并制圖，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析，1%和5%水平下LSD多重比較檢驗各處理平均值之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的硒鎘交互作用對西葫蘆幼苗苗高的影響

由圖1可知，單一Cd脅迫下，隨著Cd濃度的增加，其對西葫蘆幼苗生長有一定的促進(jìn)作用。不同濃度Se(0.5、2.0和4.0 mg·L-1)與低中濃度Cd(0.2、0.4 mg·kg-1)交互作用使西葫蘆幼苗的苗高均隨著Se濃度增加呈先升高后降低的趨勢，且均高于相應(yīng)單一Cd脅迫下幼苗的苗高，且大部分處理間差異極顯著，2.0 mg·L-1Se與0.2、0.4 mg·kg-1Cd交互作用對西葫蘆幼苗生長的促進(jìn)作用最強，其苗高較相應(yīng)單一Cd脅迫增加了17.70%和39.90%。不同濃度Se與高濃度Cd(0.6 mg·kg-1)交互作用下，西葫蘆幼苗苗高均極顯著低于相應(yīng)單一Cd脅迫，分別下降了19.72%、15.01%和25.06%，但幼苗苗高與Se濃度并未呈現(xiàn)嚴(yán)格的負(fù)相關(guān)性。表明不同濃度的Se與較低濃度Cd的交互作用能促進(jìn)西葫蘆幼苗的生長，且Se濃度越大，促進(jìn)作用越強；但不同濃度Se與較高濃度Cd交互作用則抑制了幼苗的生長，且Se濃度越大，抑制作用越強，表現(xiàn)出Se與Cd協(xié)同毒害現(xiàn)象，可見Se與Cd交互作用在西葫蘆幼苗生長過程發(fā)揮著雙重效應(yīng)。

注：大寫字母和小寫字母分別表示在相同濃度Cd脅迫下不同濃度Se之間在0.01和0.05水平下有極顯著和顯著差異。下同。Note: Different capital and lowercase letters mean significant difference between different concentrations of Se at 0.01 and 0.05 level under the Cd stress with the same concentration respectively. The same as following.圖1 不同濃度的硒鎘交互作用對西葫蘆幼苗苗高的影響Fig.1 Interactive effects of selenium and cadmium on the seedling height in zucchini seedlings

2.2 不同濃度的硒鎘交互作用對西葫蘆幼苗生物量的影響

由圖2可知，不同濃度硒鎘交互作用對西葫蘆幼苗生物量產(chǎn)生的影響與苗高的影響相似，單一Cd脅迫下，隨著Cd濃度的增加，西葫蘆幼苗的鮮重和干重呈升高趨勢。不同濃度Se與Cd交互作用下西葫蘆幼苗的鮮重和干重總體高于相應(yīng)單一Cd脅迫，且對鮮重的影響大于干重。影響最大的交互作用組合分別是Cd0.2+Se2.0、Cd0.4+Se2.0和Cd0.6+Se0.5。與單一Cd脅迫相比，低中濃度Cd(0.2、0.4 mg·kg-1)與不同濃度Se交互作用后鮮重的變化呈極顯著差異，高濃度Cd(0.6 mg·kg-1)與不同濃度Se交互作用后鮮重的變化差異未達(dá)極顯著水平；不同濃度Cd與不同濃度Se交互作用后干重的變化均不顯著。由此可見，較低濃度Cd脅迫下，低中濃度Se可顯著緩解Cd毒害對西葫蘆幼苗生物量積累的抑制作用，使其生物量顯著或極顯著增加，高濃度Se的緩解作用不明顯；但在高濃度Cd脅迫下，不同濃度Se對西葫蘆幼苗生物量的促進(jìn)作用較小，大部分處理西葫蘆幼苗生物量的積累增長率降低，并呈現(xiàn)負(fù)增長。

圖2 不同濃度的硒鎘交互作用對西葫蘆幼苗生物量的影響Fig.2 Interactive effects of selenium and cadmium on the fresh weight and dry weight in zucchini seedlings

2.3 不同濃度的硒鎘交互作用對西葫蘆幼苗SOD活性的影響

SOD是植物抗氧化系統(tǒng)的一個重要組成部分，能夠有效清除外界脅迫下在植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，減輕膜質(zhì)過氧化反應(yīng)并維持細(xì)胞膜的完整性，其活性可以反映植物對Cd脅迫適應(yīng)能力的大小。由圖3可知，單一Cd脅迫下，隨著Cd濃度增加，西葫蘆幼苗SOD活性隨之提高。不同濃度Se與低濃度Cd(0.2 mg·kg-1)交互作用下西葫蘆幼苗SOD活性均大于相應(yīng)單一Cd脅迫，并隨著Se濃度的增加而提高，表示出一定的正相關(guān)，其SOD活性分別是相應(yīng)單一Cd脅迫的1.01、1.25和1.86倍。不同濃度Se與中高濃度Cd(0.4、0.6 mg·kg-1) 交互作用下，西葫蘆幼苗中SOD活性均低于相應(yīng)單一Cd脅迫，0.4 mg·kg-1Cd與不同濃度Se交互作用下，西葫蘆幼苗SOD活性較相應(yīng)單一Cd脅迫分別降低了13.80%、15.38%和11.56%，但差異不顯著；0.6 mg·kg-1Cd與不同濃度Se交互作用下，西葫蘆幼苗SOD活性較相應(yīng)單一Cd脅迫分別顯著降低了32.22%、21.96%和23.34%。

圖3 不同濃度的硒鎘交互作用對西葫蘆幼苗SOD活性的影響Fig.3 Interactive effects of selenium and cadmium on the SOD activity in zucchini seedlings

綜上表明，低濃度Cd脅迫下，外源一定濃度Se可明顯提高西葫蘆幼苗SOD活性，從而減輕或緩解重金屬Cd對西葫蘆幼苗生長的抑制或毒害。但隨著Cd濃度的增加，外源Se對重金屬Cd脅迫下西葫蘆幼苗SOD活性的影響效果越來越弱，可能是因為隨著Cd濃度的增加Se對Cd的拮抗作用越來越弱，也有可能與Se和Cd的協(xié)同毒害作用有關(guān)。

2.4 不同濃度的硒鎘交互作用對西葫蘆幼苗POD活性的影響

POD是植物應(yīng)對外界氧化脅迫的一種重要的酶，可以有效消除H2O2，減輕氧化脅迫對植物體造成的傷害。由圖4可知，單一Cd脅迫下，西葫蘆幼苗POD活性的變化與SOD情況相似，即隨著Cd濃度增加，西葫蘆幼苗POD活性增加，表明Cd脅迫未超過西葫蘆幼苗自身的防御能力，可以通過調(diào)節(jié)反應(yīng)提高POD活性，使細(xì)胞免受或減輕Cd毒害。

與單一Cd脅迫相比，不同濃度Se可使低濃度Cd(0.2 mg·kg-1)脅迫下西葫蘆幼苗POD活性增加，而使中高濃度Cd(0.4、0.6 mg·kg-1)脅迫下的POD活性降低。不同濃度Se與低濃度Cd交互作用中，西葫蘆幼苗POD活性表現(xiàn)為Cd0.2+Se0.5>Cd0.2+Se2.0>Cd0.2+Se4.0，Cd0.2+Se0.5與單一Cd脅迫(Cd0.2)和其他組合相比差異極顯著，其他組合與相應(yīng)單一Cd脅迫差異不顯著。不同濃度Se與中濃度Cd(Cd0.4)交互作用下使西葫蘆幼苗POD活性低于單一Cd脅迫，但是各組合與相應(yīng)單一Cd脅迫及各組合間差異不顯著。不同濃度Se與高濃度Cd交互作用可極顯著降低西葫蘆幼苗POD活性。較高濃度Cd脅迫下，隨著Se濃度的增加，西葫蘆幼苗POD活性呈降低趨勢，但與Se濃度并未呈現(xiàn)嚴(yán)格的負(fù)相關(guān)。

圖4 不同濃度的硒鎘交互作用對西葫蘆幼苗POD活性的影響Fig.4 Interactive effects of selenium and cadmium on the POD activity in zucchini seedlings

2.5 不同濃度的硒和鎘交互作用對西葫蘆幼苗Cd和Se含量的影響

由圖5可知，單一Cd脅迫下，隨著Cd濃度增加西葫蘆幼苗中Cd含量逐漸增加，Se含量逐漸降低。外源Se能夠降低西葫蘆幼苗對Cd的吸收，施加不同濃度Se(0.5、2.0和4.0 mg·kg-1)使西葫蘆幼苗中Cd含量與相應(yīng)單一Cd脅迫相比分別下降了10.87%、18.91%和9.45%(Cd脅迫濃度分別為0.2、0.4和0.6 mg·kg-1，下同)，12.14%、18.77%和4.29%，25.56%、24.28%和3.54%。此外，外源Se提高了西葫蘆幼苗中Se含量，低濃度Cd(0.2 mg·kg-1)條件下，隨著Se濃度增加，西葫蘆幼苗中Se含量呈逐漸升高的趨勢，不同濃度Se(0.5、2.0和4.0 mg·kg-1)與不同濃度Cd交互作用下西葫蘆幼苗Se含量分別是相應(yīng)單一Cd脅迫的1.5、2.0和2.5倍(Cd脅迫濃度分別為0.2、0.4和0.6 mg·kg-1，下同)，1.7、2.5和2.4倍，1.7、2.5和2.3倍，但是不同濃度Cd處理間差異不顯著(P>0.05)。

圖5 不同濃度的硒鎘交互作用對西葫蘆幼苗Cd和Se含量的影響Fig.5 Interactive effects of selenium and cadmium on Cd and Se concentration in zucchini seedlings

3 討論

重金屬Cd在環(huán)境中具有較強的移動性、生物有效性和較大的毒性，已成為目前最受關(guān)注的主要污染物之一[1]。Cd能影響植物的生長，植物對Cd脅迫最敏感的指標(biāo)是苗高、鮮重和干重[29]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，低劑量Cd能夠促進(jìn)植物生長[26]。本研究也得到了類似的結(jié)論，即隨著Cd濃度增加，西葫蘆幼苗苗高、鮮重和干重呈升高趨勢。植物在Cd脅迫下能產(chǎn)生更多的ROS，當(dāng)過剩的ROS打破細(xì)胞自身氧化還原平衡，會導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化引起氧化損傷。為了應(yīng)對Cd氧化脅迫，植物自身免疫系統(tǒng)會把Cd隔離在新陳代謝不活躍的部分(如根部細(xì)胞壁和葉子的液泡)，從而抵御Cd誘發(fā)的氧化脅迫，這些免疫系統(tǒng)包括酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)。SOD和POD是酶促抗氧化系統(tǒng)中2個關(guān)鍵的抗氧化物酶，能催化超氧自由基、H2O2等有毒物質(zhì)的分解，有效去除ROS，減輕外界脅迫對植物的毒害[2]。大量研究表明，Cd脅迫能改變植物的抗氧化酶活性，但其變化趨勢不一致，在辣椒葉子、豌豆葉子、大豆幼苗、黃瓜毛狀根、洋麻幼苗中的研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的Cd脅迫可使SOD和POD活性升高[30-33]，但油菜幼苗研究結(jié)果表明Cd明顯抑制了SOD的產(chǎn)生[34]，而在歐芹幼苗試驗中發(fā)現(xiàn)低濃度Cd可促進(jìn)SOD 和POD 活性提高，高濃度卻抑制這2種酶的活性[4]。在本研究選定的Cd濃度范圍內(nèi)，Cd對西葫蘆幼苗的生長和抗氧化酶活性具有一定的促進(jìn)作用。Cd脅迫對植物生長和抗氧化酶活性的影響產(chǎn)生差異的原因可能與Cd 濃度、處理時間、植物基因型和植物所處生育期等有關(guān)。

Se能有效緩解重金屬的毒害作用[13]。生物量的變化是反映外界脅迫對植物造成毒害效益的一個重要指標(biāo)[1]。關(guān)于Se與Cd交互作用對植物幼苗生長的影響已有相應(yīng)報道[24-25]，但結(jié)論不一致。有研究認(rèn)為，適宜劑量的Se與Cd交互作用能夠促進(jìn)植物幼苗的生長[9,34-36]，但也有研究認(rèn)為Se與Cd交互作用是一個“雙重作用”過程，即低濃度Se能夠與Cd相互作用緩解其對植物的毒害并刺激植物生長，高濃度Se作為“助氧化劑”會導(dǎo)致植物進(jìn)一步受到傷害[16-18]。本研究結(jié)果表明，不同濃度Cd與Se交互作用對西葫蘆幼苗生長的影響不同，低中濃度Cd與Se交互作用能刺激西葫蘆幼苗生長，高濃度Cd與Se交互作用會抑制西葫蘆幼苗生長。Yu等[37]研究小白菜也得出了相似的結(jié)果，外源Se使低濃度Cd(10 μmol·L-1)脅迫下小白菜幼苗地上部鮮重增加了58%，使高濃度Cd(20 μmol·L-1)脅迫下小白菜幼苗的鮮重降低了27%，推測此時Se和高濃度Cd的協(xié)同作用增加了重金屬對植物的毒害。

適量Se能夠提高植物抗氧化性從而增強抵御重金屬毒害的能力[14]，但關(guān)于Se與Cd交互作用對SOD和POD影響的結(jié)論不一。有研究表明，當(dāng)Cd脅迫濃度較高時，Se與Cd交互作用能增加這2種酶的活性[22, 25]，但也有減少的情況[24]；有報道稱不同濃度Se與Cd交互作用對這2種酶活性的影響不同[32, 37]。本研究也發(fā)現(xiàn)，不同濃度Se與低濃度Cd交互作用會提高西葫蘆幼苗的SOD和POD活性，但不同濃度Se與中高濃度Cd交互作用抑制了西葫蘆幼苗的SOD和POD活性，Cd和Se濃度越高，抑制作用越強。究其原因，低濃度Se能夠調(diào)節(jié)ROS的新陳代謝，清除過剩的氧自由基，減少膜質(zhì)過氧化，提高抗氧化酶活性，緩解Cd誘發(fā)的氧化脅迫，而高濃度Se在植物體內(nèi)進(jìn)行同化作用時消耗了抗氧化劑，抑制了植物體內(nèi)部分酶的生物功能，反而增加了Cd的毒性；此外也可能與高濃度Se影響了這2種抗氧化酶轉(zhuǎn)錄過程有關(guān)。

適量Se能夠顯著減少Cd在作物中的累積[9,13,21,23]，但Se對Cd積累的這種拮抗效應(yīng)受Cd和Se濃度及形態(tài)等多種因素的影響[5,14]。Saidi等[24]研究發(fā)現(xiàn)，隨著Se濃度增加，向日葵幼苗葉片中Cd濃度呈先降低后逐漸升高的趨勢，但均低于單一Cd脅迫；Feng等[17]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度Cd脅迫下，隨著外源Se濃度的增加能有效抑制水稻對Cd吸收，但在較高濃度Cd脅迫下，隨著外源Se濃度的增加，水稻中Cd含量卻逐漸增加。本研究結(jié)果表明，不同濃度Se降低了西葫蘆幼苗中的Cd含量，抑制西葫蘆幼苗吸收Cd的Se濃度為2.0 mg·kg-1。Se能抑制植物對Cd的累積可能與Se在植物體內(nèi)能誘導(dǎo)產(chǎn)生可以與Cd螯合的一些特殊蛋白有關(guān)，也可能與Se抑制Cd向作物地上部的遷移和轉(zhuǎn)運有關(guān)[9, 13-14]。

研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫下外源Se能促進(jìn)植物對Se的吸收[5, 17, 20, 22-23]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)隨著Se濃度的增加，西葫蘆幼苗中Se含量逐漸增加，表明在施加外源Se緩解作物Cd毒害的同時可以增加作物體內(nèi)的Se含量，從而改善作物品質(zhì)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度Se與Cd交互作用對西葫蘆幼苗的生長及抗氧化酶活性的影響存在“雙重效應(yīng)”，低濃度Cd脅迫下，可以通過施加外源Se來緩解Cd的毒害，但高濃度Cd脅迫下施加外源Se并不一定能緩解Cd的毒害。因此通過外源Se緩解Cd對農(nóng)作物的毒害時，應(yīng)充分考慮Cd的濃度并選擇適量的Se。本研究探討了Se與Cd交互作用對西葫蘆的影響，為探索Cd污染的治理以及毒害的緩解提供了一定的參考依據(jù)。但本試驗僅從幼苗生長，SOD、POD 2種抗氧化酶活性及幼苗體內(nèi)Se、Cd含量幾方面進(jìn)行了研究，還應(yīng)對Se與Cd交互作用的機理進(jìn)行深入分析，特別是2種元素在作物中的吸收、轉(zhuǎn)運、代謝和積累等方面，為有關(guān)降低Cd在作物中的積累同時提高Se營養(yǎng)水平的研究提供理論依據(jù)。