浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053
原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)是一種發(fā)病率極高的惡性腫瘤,病情進展快,患者5年生存率低[1]。 肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是PHC最常見的病理類型,因其早期癥狀隱匿,大部分HCC患者確診時已處于中晚期,已錯失根治性手術(shù)的最佳時機。目前HCC的治療方式大多為手術(shù)、化療、放療、分子靶向治療等,但往往伴隨嚴重的不良反應(yīng)。因此,如何抑制HCC的發(fā)生發(fā)展,減少不良反應(yīng),延長患者生存期,已成為現(xiàn)今的研究熱點。中醫(yī)藥在延緩HCC疾病進展、緩解治療副反應(yīng)、提高患者生活質(zhì)量等方面優(yōu)勢顯著[2],日漸成為綜合性治療的重要組成部分。
中醫(yī)認為,HCC可歸屬于“肝積”“黃疸”“肥氣”等范疇,病機屬正虛邪侵,為機體陰陽氣血失調(diào),痰濕熱毒內(nèi)生,積聚于脅下而成腫塊,故治療上當(dāng)清熱毒、調(diào)氣血、益肝用。白花蛇舌草-半枝蓮為臨床常用清熱解毒藥對,白花蛇舌草兼有消腫止痛、半枝蓮兼有活血化瘀的功效,二者相伍,共奏抗癌奇功?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,白花蛇舌草的化學(xué)成分主要包括環(huán)烯醚萜類、黃酮類、蒽醌類等化合物,具有抗癌、抗氧化、抗炎等多種生物活性[3];半枝蓮的主要活性成分為黃酮類、二萜及其內(nèi)酯類、多糖類化合物,具有良好的抗癌、護肝及抗病毒作用[4]。研究證實,兩藥聯(lián)合能夠誘導(dǎo)細胞凋亡、增強免疫功能,較單藥對腫瘤細胞的抑制作用更加明顯[5]。然而由于中藥多成分、多靶點的特性,白花蛇舌草-半枝蓮藥對抗HCC的具體作用機制尚未闡明。
網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興學(xué)科,能夠?qū)χ兴幓钚猿煞旨皾撛谧饔冒悬c進行系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)性研究,這恰好與中藥多層次、多靶點、多通路的特性相符。故本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,挖掘白花蛇舌草-半枝蓮藥對的活性成分及治療HCC的潛在靶點,并探索其作用機制,為深入研究HCC的診治奠定基礎(chǔ)。本研究整體框架見圖1。
圖1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體研究框架Fig.1 The whole framework of the study based on network pharmacology
1.1 白花蛇舌草-半枝蓮活性成分及靶點的篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/)檢索白花蛇舌草、半枝蓮的化學(xué)成分,同時收集其藥物動力學(xué)參數(shù),以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(druglikeness,DL)≥0.18為標(biāo)準[6],篩選其有效活性成分,將收集到的藥物活性成分導(dǎo)入到Drugbank 數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)中進行蛋白靶點的篩選匹配。為了提高數(shù)據(jù)的標(biāo)準性及統(tǒng)一性,進一步運用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/),查詢其蛋白靶點名所對應(yīng)的人類基因名稱,并匹配整理藥物靶點。
1.2 HCC相關(guān)靶點的篩選 選擇GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫、人類在線孟德爾遺傳(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)數(shù) 據(jù) 庫(http://www.omim.org/)、 治療目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(Therapeutic Target Database,TTD)(http://db.idrblab.net/ttd/)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)、肝細胞癌腫瘤數(shù)據(jù)庫(Oncogenomic Database of Hepatocellular Carcinoma,OncoDB.HCC) (http://oncodb.hcc.ibms.sinica.edu.tw)和Liverome數(shù)據(jù)庫(http://liverome.kobic.re.kr/),以“Hepatocellular carcinoma”或“HCC”為關(guān)鍵詞檢索HCC相關(guān)靶點,整合并刪除重復(fù)項。通過R語言(Version 3.6.1)將藥物靶點與疾病靶點進行匹配,取交集作為白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療HCC的潛在作用靶點。
1.3 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò) 選用可視化軟件Cytoscape(Version 3.7.1)構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”關(guān)系網(wǎng)絡(luò),以闡明白花蛇舌草-半枝蓮藥對中活性成分與疾病靶點的關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)下方節(jié)點代表篩選后白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療疾病的潛在作用靶點,網(wǎng)絡(luò)上方節(jié)點代表白花蛇舌草-半枝蓮藥對的共活性成分,邊代表白花蛇舌草-半枝蓮藥對與其活性成分、活性成分與潛在作用靶點、潛在作用靶點與疾病的相互關(guān)系。
1.4 構(gòu)建靶點蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò) 將交集后的潛在作用靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)處理,限定物種為“Homo sapiens”進行檢索,構(gòu)建白花蛇舌草-半枝蓮藥對抗HCC作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。
1.5 網(wǎng)絡(luò)拓撲分析 對于網(wǎng)絡(luò)中的每個節(jié)點,使用Cytoscape軟件中的Network Analyzer工具及cytoNCA插件對其進行拓撲分析。選擇3個參數(shù)來評估其拓撲特征:(1)連接度中心性(degree centrality,DC),即與一個節(jié)點直接相連的節(jié)點個數(shù);(2)緊密度中心性(closeness centrality,CC),即從一個節(jié)點到其他節(jié)點的平均距離;(3)中介中心性(betweeness centrality,BC),即經(jīng)過某個節(jié)點的最短路徑數(shù)目。這3個參數(shù)在網(wǎng)絡(luò)中起著至關(guān)重要的作用,DC越高,CC、BC越大,節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的核心地位越高。根據(jù)上述參數(shù)進行網(wǎng)絡(luò)核心節(jié)點的篩選。
1.6 基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析 利用R語言中Bioconductor平臺及Cytoscape中Cluego插件對預(yù)測得到的關(guān)鍵靶點進行GO和KEGG富集分析,篩選條件為P<0.05,Q<0.05,分析結(jié)果以條形圖、氣泡圖及餅狀圖呈現(xiàn)。隨后用Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/)對富集通路進行整合。
2.1 白花蛇舌草-半枝蓮藥對的活性成分及作用靶點 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫得到白花蛇舌草化學(xué)成分37個,半枝蓮化學(xué)成分94個;設(shè)定OB≥30%,DL≥0.18進一步篩選后,最終納入共活性成分3個,白花蛇舌草活性成分4個(除去3個共活性成分),半枝蓮活性成分26個(除去3個共活性成分)。見表1。將上述33個活性成分導(dǎo)入到Drugbank數(shù)據(jù)庫,共收集到236個蛋白靶點。進一步查詢Uniprot數(shù)據(jù)庫后,得到88個白花蛇舌草、104個半枝蓮對應(yīng)靶點,刪除87個重復(fù)項后,最終得到105個藥物靶點。
2.2 HCC相關(guān)靶點 通過檢索,在GeneCards、OMIM、TTD、Drugbank、OncoDB.HCC和Liverome數(shù)據(jù)庫中分別獲得6 592、200、47、14、325和241個HCC相關(guān)靶點,刪除重復(fù)項后共篩選得到6 832個HCC相關(guān)靶點,與105個藥物共同靶點匹配后,交集得到89個白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療HCC的潛在作用靶點。見圖2。
2.3 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)分析 將白花蛇舌草-半枝蓮活性成分、潛在作用靶點、HCC靶點及其屬性導(dǎo)入到Cytoscape,建立“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)。見圖3。利用Network Analyzer計算節(jié)點DC,結(jié)果發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草-半枝蓮藥對中DC居前5位的活性成分分別為槲皮素(quercetin,degree=121)、木犀草素(luteolin,degree=28)、β-谷甾醇(beta-sitosterol,degree=22)、黃芩素(baicalein,degree=19)及漢黃芩素(wogonin,degree=19)。見表2。以上成分均為白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療HCC的關(guān)鍵活性成分。分析網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn),藥對中相同活性成分能同時作用于多個靶點,而相同靶點亦對應(yīng)多種活性成分,證明白花蛇舌草-半枝蓮藥對能夠多成分、多靶點發(fā)揮治療作用。
2.4 靶點PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將白花蛇舌草-半枝蓮藥對抗HCC的89個潛在作用靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫平臺,剔除1個無相互作用關(guān)系的蛋白后,得到由88個節(jié)點及864條邊組成的PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖4。進一步應(yīng)用CytoNCA計算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的拓撲參數(shù),并進行核心靶點的篩選。DC的中位數(shù)為14,CC的中位數(shù)為0.52,BC的中位數(shù)為0.003868,基于這3個參數(shù)的中位數(shù)進行第1次篩選,即篩選條件為DC≥14,CC≥0.52,BC≥0.003868,共得到31個關(guān)鍵靶點。隨后設(shè)定閾值為DC≥40,CC≥0.655462,BC≥0.035574進行第2次篩選,最終得到6個核心靶點,包括白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3,CASP3)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、myc基因、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)。最后構(gòu)建核心靶點與白花蛇舌草-半枝蓮活性成分關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。見圖5。
表1 白花蛇舌草-半枝蓮潛在活性成分Tab.1 Potential active components of Hedyotis diffusa-Scutellariae barbatae Herba
圖2 白花蛇舌草-半枝蓮作用靶點與HCC相關(guān)靶點交集Fig.2 Interaction of Hedyotis diffusa-Scutellariae barbatae Herba related targets and HCC related targets
圖3 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig.3 “Drug-component-target” network
2.5 GO功能富集分析 通過R語言對潛在作用靶點進行分析,以P<0.05為條件,共篩選得到1 196個GO條目,其中生物過程(biological process,BP)條目1 067個,細胞組分(cellular component,CC)條目39個,分子功能(molecular function,MF)條目90個。 結(jié)果顯示,BP方面,白花蛇舌草-半枝蓮藥對主要參與對類固醇激素、外源刺激、氧化應(yīng)激等的反應(yīng)過程;CC方面,白花蛇舌草-半枝蓮藥對與細胞各個部分均有密切聯(lián)系,包括細胞膜、細胞核、線粒體等;MF方面,白花蛇舌草-半枝蓮藥對主要與核受體功能、轉(zhuǎn)錄因子活性、近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合等功能有關(guān)。此結(jié)果證實白花蛇舌草-半枝蓮藥對可通過調(diào)控多種生物學(xué)途徑發(fā)揮對HCC的治療作用,進一步分析發(fā)現(xiàn)這些生物學(xué)途徑主要與細胞增殖、細胞凋亡、炎癥反應(yīng)和血管生成有關(guān)。以條形圖展示校正后P值排名前20位的結(jié)果。見圖6。
表2 DC居前5位的關(guān)鍵活性成分信息Tab.2 Information of key-components of DC in the top 5
2.6 KEGG通路富集分析 通過Cluego將潛在作用靶點與KEGG信號通路進行匹配,共富集得到80條信號通路,其中p53抑癌基因通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K-Akt) 通路、 缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)通路、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路、VEGF通路是關(guān)鍵信號通路。見表3。此外,膀胱癌通路、結(jié)直腸癌通路、乳腺癌通路等也被顯著富集,這表明白花蛇舌草-半枝蓮藥對能夠通過多個信號通路發(fā)揮抗HCC及多種惡性腫瘤的作用,且其作用靶點可能為多種惡性腫瘤的共同靶標(biāo)。最后,對KEGG通路富集分析行可視化處理,并在Metascape數(shù)據(jù)庫中進行驗證。見圖7。
圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network
圖5 “核心靶點-關(guān)鍵成分”網(wǎng)絡(luò)Fig.5 “Core targets-key components” network
中醫(yī)認為,本虛標(biāo)實為HCC之基本病機。正氣先虛,加之情志過極,飲食勞倦,機體陰陽氣血失衡,氣滯痰凝血瘀而成癌毒。癌毒與痰瘀互結(jié),郁久化熱,更成熱毒,毒熱內(nèi)結(jié)為HCC發(fā)生的關(guān)鍵病機。臨床上HCC患者也常表現(xiàn)出發(fā)熱、疼痛、口苦、煩躁、尿黃、便秘等熱毒之癥。《素問·至真要大論》云:“寒者熱之,熱者寒之……”因此對于熱毒引發(fā)的惡性腫瘤,應(yīng)用清熱解毒的寒涼類方藥治療。作為清熱解毒類方藥的代表,有文獻報道,白花蛇舌草聯(lián)合半枝蓮能夠有效抑制HCC的發(fā)生發(fā)展[7]。但由于中藥多成分、多靶點作用的特性,該藥對治療HCC的具體成分、靶點及機制至今尚不明確。
本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療HCC的潛在靶點及作用機制。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲分析結(jié)果,得到5種關(guān)鍵成分,6個核心靶點,結(jié)合GO功能及KEGG通路富集分析得到的5條關(guān)鍵通路,白花蛇舌草-半枝蓮藥對可能通過調(diào)節(jié)細胞增殖與凋亡、控制炎癥、抗血管生成等多途徑發(fā)揮治療作用。
圖6 關(guān)鍵靶點的GO功能富集分析Fig.6 GO function enrichment analysis for key targets
3.1 細胞增殖 細胞周期調(diào)節(jié)失控所致的細胞異常增殖,是惡性腫瘤的關(guān)鍵特征之一[8]。EGFR是表皮細胞生長因子(epidermal growth factor,EGF)的受體,廣泛分布于上皮細胞、成纖維細胞等多種細胞表面,參與細胞增殖及信號傳導(dǎo)。EGF和EGFR的結(jié)合導(dǎo)致EGFR的二聚化,進一步激活PI3K-Akt通路,抑制細胞增殖[9]。myc是細胞增殖和代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄程序,從而影響多種人類腫瘤細胞的增殖和代謝[10]。本研究分析篩選得出,白花蛇舌草-半枝蓮藥對的關(guān)鍵靶點包括與細胞增殖相關(guān)的EGFR、myc,關(guān)鍵信號通路包括PI3K-Akt信號通路,說明白花蛇舌草-半枝蓮藥對的活性成分槲皮素及木犀草素等可能是通過抑制EGFR及myc表達,調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路,從而抑制細胞增殖。且有研究證實,槲皮素可抑制EGFR及其下游信號分子PI3K、Akt的表達[11];木犀草素可抑制Akt和PI3K的磷酸化[12],抑制細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡,發(fā)揮抗HCC的作用,與本研究結(jié)果一致。
表3 關(guān)鍵KEGG信號通路信息Tab.3 Information on key KEGG signaling pathway
圖7 可視化KEGG通路富集分析Fig.7 Visual analysis of KEGG pathway enrichment
3.2 細胞凋亡 研究已證實,細胞增殖與凋亡的穩(wěn)態(tài)失衡是腫瘤的發(fā)病機制之一[13]。機體內(nèi)凋亡信號可激活CASP表達,刺激細胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)通路,而CASP3是CASP家族中最重要的一種,可通過級聯(lián)放大反應(yīng)促細胞凋亡。HIF-1和p53信號通路為促細胞凋亡關(guān)鍵通路,其中HIF-1作為一種促凋亡因子,能夠激活凋亡前體蛋白表達,同時p53能直接與HIF-1的氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域(oxygen-dependent degradation domain,ODDD)相結(jié)合,最終誘導(dǎo)細胞凋亡[14]。本研究富集分析結(jié)果表明,白花蛇舌草-半枝蓮藥對的活性成分可能通過調(diào)節(jié)HIF-1和p53信號通路,誘導(dǎo)下游的CASP級聯(lián)反應(yīng),從而促進腫瘤細胞凋亡。進一步分析提示,白花蛇舌草-半枝蓮藥對中的相關(guān)活性成分包括槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黃芩素及漢黃芩素等,以上活性成分都能通過CASP3級聯(lián)反應(yīng),促進細胞凋亡。
3.3 炎癥反應(yīng) 腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤微環(huán)境息息相關(guān)。炎癥反應(yīng)的刺激能產(chǎn)生多種趨化因子,從而形成炎癥微環(huán)境,促進腫瘤細胞的增殖遷移。IL-6作為一種重要的炎癥細胞因子,可經(jīng)自分泌和旁分泌途徑影響腫瘤細胞的增殖與分化。研究發(fā)現(xiàn),IL-6能夠介導(dǎo)正常成纖維細胞與腫瘤細胞之間的相互作用,并促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[15]。NF-κB是細胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子,能夠促進腫瘤中炎癥基因的轉(zhuǎn)錄,刺激機體分泌更多的IL-6等細胞因子,起到抑制腫瘤細胞凋亡的作用[16]。本研究富集分析結(jié)果提示,白花蛇舌草-半枝蓮藥對中的槲皮素、木犀草素、漢黃芩素等成分可能通過降低IL-6水平,減少NF-κB表達,抑制NF-κB信號通路,從而下調(diào)下游炎癥因子表達水平,控制炎癥反應(yīng)。此外,有研究表明癌性疼痛與某些炎性因子的表達密切相關(guān)[17],由此進一步推測白花蛇舌草-半枝蓮藥對可能通過抑制IL-6、NF-κB信號通路,從而發(fā)揮抗炎作用,緩解HCC引起的癌痛。
3.4 血管生成 血管生成在腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用,而HCC組織中存在著豐富的脈管系統(tǒng)。VEGFA是最重要的血管生成因子[18],其在HCC組織中的表達明顯高于正常組織[19],VEGFA能夠上調(diào)HIF-1α的表達,還可以作為一種自分泌生長因子,刺激腫瘤血管的生成[20-21]。本研究篩選發(fā)現(xiàn)VEGFA為白花蛇舌草-半枝蓮藥對的關(guān)鍵靶點,HIF-1及VEGF信號通路為其關(guān)鍵信號通路,提示白花蛇舌草-半枝蓮藥對可能通過作用于HIF-1α從而下調(diào)VEGFA表達水平,進一步抑制VEGF信號通路,抑制腫瘤血管生成。
綜上所述,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,對白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療HCC的作用進行了系統(tǒng)分析,明確了白花蛇舌草-半枝蓮藥對可能通過p53、PI3K-Akt、HIF-1、NF-κB、VEGF等信號通路發(fā)揮抗HCC作用,符合中醫(yī)藥多成分、多靶點、多通路的機制特點。本研究的結(jié)果為后續(xù)實驗研究提供了方向。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)極大地推動了現(xiàn)代生物醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展,但仍存在數(shù)據(jù)庫信息不完整、數(shù)據(jù)源算法與臨床存在差異等問題,有待進一步探究。因此,積極開發(fā)智能數(shù)據(jù)庫、進行深入的體內(nèi)外實驗探究,為臨床治療提供新的方向及依據(jù),是中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展方向之一。