張 澤，裴 鑫，魯儀增，常金財(cái)，鄭 健，①

(1. 北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院，北京 102206； 2. 山東省林木種質(zhì)資源中心，山東 濟(jì)南 250102；3. 呼倫貝爾市林業(yè)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021008)

小熱激蛋白(sHSPs)是理論相對(duì)分子質(zhì)量介于16 000～40 000之間的一類熱激蛋白，是植物中最豐富且分布廣泛的一類熱激蛋白，且相較于其他真核生物，數(shù)目更多，差異也較大[1]。小熱激蛋白不僅參與許多細(xì)胞內(nèi)過(guò)程及某些蛋白質(zhì)家族成員突變導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂的調(diào)節(jié)[2-3]，還能在脅迫下作為中間體，通過(guò)阻止蛋白質(zhì)的不可逆變性保護(hù)蛋白質(zhì)。同時(shí)，小熱激蛋白不僅起著“保持酶”伴侶的作用，還積極調(diào)控蛋白質(zhì)富集過(guò)程，提高細(xì)胞在不同應(yīng)激條件下(如高溫或氧化應(yīng)激)恢復(fù)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的能力。除了調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和響應(yīng)細(xì)胞條件的變化，許多小熱激蛋白基因還能在正常生長(zhǎng)的細(xì)胞中表達(dá)[4-5]，通過(guò)調(diào)節(jié)正常蛋白質(zhì)間的相互作用影響多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、分化和凋亡。研究表明：小熱激蛋白不僅參與植物對(duì)高溫或熱激的響應(yīng)，而且能響應(yīng)其他生物及非生物脅迫，如病原菌、捕食者、干旱、低溫、鹽害、紫外線、重金屬離子、滲透脅迫、厭氧脅迫甚至是重力的變化等，也能誘導(dǎo)小熱激蛋白基因表達(dá)[6]。高溫脅迫下，F(xiàn)estucaarundinaceaSchreb.中FaHSP18.2基因的表達(dá)量明顯上調(diào)，進(jìn)而提高其對(duì)高溫的耐受性[7]；干旱脅迫處理后，EucalyptuscladocalyxF. Muell.中EcHSP17.6基因表達(dá)量極顯著升高[8]；馬鈴薯(SolanumtuberosumLinn.)中大多數(shù)小熱激蛋白基因在高溫脅迫、鹽脅迫和滲透脅迫下明顯上調(diào)表達(dá)[9]；水稻(OryzasativaLinn.)中OsHSP26.7、OsHSP23.2、OsHSP17.9A、OsHSP17.4和OsHSP16.9A基因在熱脅迫下上調(diào)表達(dá)[10]；橡膠樹(shù)〔Heveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg.〕在低溫脅迫條件下大多數(shù)小熱激蛋白基因明顯上調(diào)表達(dá)[11]。然而，小葉楊(PopulussimoniiCarr.)中PsHSP17.4基因在高溫脅迫下轉(zhuǎn)錄下調(diào)，推測(cè)其可能在小葉楊高溫脅迫過(guò)程中不作為分子伴侶，而是發(fā)揮了其他功能[12]。此外，小熱激蛋白還能參與植物特定的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[13]。

花楸樹(shù)〔Sorbuspohuashanensis(Hance) Hedl.〕為落葉小喬木，廣泛分布于中國(guó)北方地區(qū)，原生境海拔約800～2 500 m，是一種優(yōu)良的觀葉、觀花、觀果樹(shù)種，在中國(guó)東北地區(qū)作為行道樹(shù)適應(yīng)性良好[14]。除觀賞價(jià)值外，花楸樹(shù)還是中國(guó)傳統(tǒng)的藥用植物[15-16]。已有關(guān)于花楸樹(shù)的研究主要集中在地理分布與天然更新[17]、群體遺傳多樣性[18]、種源地理變異[19]、種子發(fā)育與休眠[20-21]、繁殖技術(shù)[22-23]以及引種馴化[24]等方面，而在花楸樹(shù)響應(yīng)高溫脅迫的機(jī)制方面，僅有花楸樹(shù)2年生幼苗響應(yīng)高溫脅迫的生理生化機(jī)制[25-26]以及花楸樹(shù)熱激蛋白70基因克隆和功能[27]方面的初步報(bào)道。花楸樹(shù)自然生境海拔較高，土壤大多為山地棕壤，pH 5.4至pH 6.2，呈弱酸性，腐殖質(zhì)含量高，養(yǎng)分豐富，土壤肥力高。在實(shí)際引種馴化及種質(zhì)資源保存過(guò)程中，難以保證引種地(或保存地)與原生地環(huán)境完全一致，因此，花楸樹(shù)引種到低海拔地區(qū)將面臨包括高溫在內(nèi)的多種非生物脅迫限制，探究其對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)有助于研究其馴化適應(yīng)機(jī)制。本研究克隆了花楸樹(shù)小熱激蛋白基因，探討其在非生物脅迫條件下的表達(dá)模式，并通過(guò)轉(zhuǎn)化擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕對(duì)其功能進(jìn)行進(jìn)一步剖析，明確其在高溫等非生物脅迫下的響應(yīng)表達(dá)模式，以期為花楸樹(shù)引種馴化奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)于2017年3月至2019年5月在北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。供試花楸樹(shù)1年生實(shí)生苗(營(yíng)養(yǎng)缽栽)用于干旱和NaCl脅迫實(shí)驗(yàn)，2年生實(shí)生苗(盆栽)用于高溫脅迫實(shí)驗(yàn)，4年生實(shí)生苗用于基因組DNA提取和組織特異性表達(dá)分析。野生型擬南芥(Col背景)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

實(shí)驗(yàn)用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、2×EasyTaq PCR SuperMix、Trans2K Plus DNA Marker、pTOPO-TA Simple克隆載體及EasyPure Quick Gel Extraction Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，EASYspin Plus Complex Plant RNA Kit、50×TAE Buffer、2×Sybr Green qPCR Mix和抗生素等化學(xué)試劑購(gòu)自北京艾德萊生物技術(shù)有限公司。Pleela超表達(dá)載體由中國(guó)科學(xué)院植物研究所劉永秀課題組惠贈(zèng)。引物合成及測(cè)序皆由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA、總RNA提取及cDNA第1鏈合成 參照劉聰聰?shù)萚27]的方法進(jìn)行花楸樹(shù)葉片基因組DNA的提取，參照EASYspin Plus Complex Plant RNA Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA的提取，參照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第1鏈。

1.2.2 基因克隆和序列分析 對(duì)花楸樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[28]進(jìn)行分析后，經(jīng)NCBI的BLAST網(wǎng)站(http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中BLASTn在線軟件比對(duì)，獲得1條與小熱激蛋白基因相似的序列，依據(jù)所得序列設(shè)計(jì)引物SpHSP23.8-CF和SpHSP23.8-CR(表1)，分別以花楸樹(shù)cDNA和gDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積為20.0 μL，包括模板1.0 μL、10 μmol·L-1正向和反向引物各0.4 μL、2×EasyTaq PCR SuperMix 10.0 μL和ddH2O 8.2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳并回收目的條帶、連接到pTOPO-TA Simple克隆載體進(jìn)行測(cè)序，采用DNAMAN 7.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)分析，獲得該基因的cDNA序列，然后對(duì)該基因的gDNA和cDNA進(jìn)行序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)分析。

1.2.3 蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析 使用DNAMAN 7.0軟件預(yù)測(cè)花楸樹(shù)SpHSP23.8基因編碼的氨基酸序列，利用NCBI的BLAST網(wǎng)站中BLASTp在線軟件進(jìn)行同源性比對(duì)；利用ExPasy網(wǎng)站(http：∥www.expasy.org/)的相關(guān)軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)和理論相對(duì)分子質(zhì)量；通過(guò)ProtParam工具(https：∥web.expasy.org/protparam/)對(duì)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；利用Sopma工具(https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用ClustalX 2.1軟件對(duì)花楸樹(shù)SpHSP23.8蛋白以及擬南芥、水稻和毛果楊(PopulustrichocarpaTorr. et A. Gray ex Hook.)等模式植物不同亞族小熱激蛋白的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析(鄰接法，neighbor joining method)，并采用自檢舉法(bootstrap method)對(duì)構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行評(píng)估(重復(fù)1 000次)。

表1 用于花楸樹(shù)SpHSP23.8基因克隆和表達(dá)的引物序列

1.2.4 基因表達(dá)分析

1.2.4.1 組織特異性表達(dá)分析 參照劉聰聰?shù)萚27]的研究方法，選取3株花楸樹(shù)4年生實(shí)生苗，分別于2018年3月10日取芽，3月20日取幼葉和莖(1年生枝條的頂部第1和第2節(jié)間部分)，4月20日(盛花期)取花，5月20日(花期后20 d)取果實(shí)、成熟葉和根，液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。每株作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，重復(fù)3次。

1.2.4.2 響應(yīng)高溫脅迫表達(dá)分析 以花楸樹(shù)2年生實(shí)生苗為實(shí)驗(yàn)材料，置于晝溫25 ℃、夜溫23 ℃、光照時(shí)間16 h·d-1、光照強(qiáng)度300 μmol·m-2·s-1的人工氣候箱中預(yù)處理3 d后，進(jìn)行溫度42 ℃、全光照、光照強(qiáng)度300 μmol·m-2·s-1熱激脅迫處理，期間正常澆灌清水避免干旱，分別于處理0.00、0.25、1.00、2.00、6.00、12.00和24.00 h從植株頂端往下數(shù)取第3枚葉片，液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以高溫脅迫0.00 h為對(duì)照。每個(gè)處理3株，重復(fù)3次。

1.2.4.3 響應(yīng)NaCl脅迫表達(dá)分析 以花楸樹(shù)1年生實(shí)生苗為實(shí)驗(yàn)材料，在晝溫25 ℃、夜溫23 ℃、光照時(shí)間16 h·d-1、光照強(qiáng)度300 μmol·m·s-1的培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，分別澆灌200和300 mmol·L-1NaCl溶液100 mL，分別于處理2和7 d從植株頂端往下數(shù)取第3枚葉片，液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以澆灌等體積蒸餾水為對(duì)照。每個(gè)處理10株，重復(fù)3次。

1.2.4.4 響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)分析 以花楸樹(shù)1年生實(shí)生苗為實(shí)驗(yàn)材料，在晝溫25 ℃、夜溫23 ℃、光照時(shí)間16 h·d-1、光照強(qiáng)度300 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)室中，分別于干旱脅迫(不澆灌清水)處理5和10 d從植株頂端往下數(shù)取第3枚葉片，液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以正常澆灌清水為對(duì)照。每個(gè)處理10株，重復(fù)3次。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析使用的引物為SpHSP23.8-QF和SpHSP23.8-QR(表1)，均以花楸樹(shù)β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物為Spβ-actinQF和Spβ-actinQR(表1)，PCR反應(yīng)體系參照2×Sybr Green qPCR Mix說(shuō)明書(shū)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s、58 ℃退火15 s、72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.5 轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)分析

采用Gateway方法[29]，構(gòu)建SpHSP23.8-Pella(35S驅(qū)動(dòng))超表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101+MPK90，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。在含有100 μg·mL-1草銨膦(PPT)的固體MS培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)3代篩選獲得2個(gè)超表達(dá)純合轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系OE1和OE2，用于后續(xù)試驗(yàn)。載體構(gòu)建使用的引物為SpHSP23.8-TF和SpHSP23.8-TR(表1)。

1.2.5.1 轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥響應(yīng)高溫脅迫表達(dá)分析 以4周齡OE1和OE2為實(shí)驗(yàn)材料，將其置于溫度42 ℃、全光照、光照強(qiáng)度150 μmol·m-2·s-1的人工氣候箱中，分別于處理0.00、0.25、1.00、2.00、6.00、12.00和24.00 h取蓮座葉片(處理期間正常澆灌清水)，經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以高溫脅迫0.00 h為對(duì)照。每個(gè)基因型每個(gè)處理收集3株，重復(fù)3次。

1.2.5.2 轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥響應(yīng)NaCl脅迫表達(dá)分析 以4周齡OE1和OE2為實(shí)驗(yàn)材料，在晝溫22 ℃、夜溫18 ℃、光照時(shí)間16 h·d-1、光照強(qiáng)度150 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)室中，分別澆灌150 mmol·L-1NaCl溶液100 mL，每3 d澆灌1次，分別于處理0、3、6和9 d取蓮座葉片，液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以處理0 d為對(duì)照。每個(gè)基因型每個(gè)處理收集3株，重復(fù)3次。

1.2.5.3 轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)分析 以4周齡OE1和OE2為實(shí)驗(yàn)材料，在光照時(shí)間16 h·d-1、晝溫22 ℃、夜溫18 ℃、光照強(qiáng)度150 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)室中，分別于干旱脅迫(不澆灌清水)0、3、6和9 d取蓮座葉片，液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以干旱脅迫0 d為對(duì)照。每個(gè)基因型每個(gè)處理收集3株，重復(fù)3次。

qRT-PCR分析使用的引物為SpHSP23.8-QF和SpHSP23.8-QR(表1)，以擬南芥β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物為Atβ-actinQF和Atβ-actinQR(表1)，參照2×Sybr Green qPCR Mix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR分析，PCR反應(yīng)程序同1.2.4.4，每個(gè)樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

定量結(jié)果采用2-ΔΔCT方法[30]進(jìn)行計(jì)算。采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較[31]。

2 結(jié)果和分析

2.1 花楸樹(shù)小熱激蛋白基因cDNA和gDNA序列分析

根據(jù)花楸樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以花楸樹(shù)cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序，獲得1條長(zhǎng)度為648 bp的片段(圖1)，經(jīng)與其他植物比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該片段為花楸樹(shù)小熱激蛋白20家族基因。將PCR產(chǎn)物純化并成功連入pTOPO-TA Simple克隆載體，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI比對(duì)后，確定克隆得到的序列為小熱激蛋白20基因的ORF序列，該序列共包含648個(gè)堿基，編碼215個(gè)氨基酸，編碼氨基酸序列理論相對(duì)分子質(zhì)量約23 800，該基因命名為SpHSP23.8(圖2)。以花楸樹(shù)gDNA為模板的PCR產(chǎn)物堿基序列與SpHSP23.8基因ORF堿基序列比較，發(fā)現(xiàn)該基因gDNA序列共包含953個(gè)堿基，在238至633位點(diǎn)插入1個(gè)長(zhǎng)度為305 bp的內(nèi)含子(圖1-B)。

M： Marker； 1，2： 分別為SpHSP23.8基因的cDNA和gDNA的PCR擴(kuò)增條帶PCR amplified bands of cDNA and gDNA of SpHSP23.8 gene，respectively； ATG： 起始密碼子Initiation codon； TAG： 終止密碼子Termination codon.

2.2 花楸樹(shù)SpHSP23.8蛋白的基本特性

蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示：花楸樹(shù)SpHSP23.8基因編碼215個(gè)氨基酸，組成結(jié)構(gòu)為C1034H1685N297O334S7，不穩(wěn)定系數(shù)66.61，屬于不穩(wěn)定蛋白。該蛋白包含帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(天冬氨酸和谷氨酸)33個(gè)，帶正電荷的氨基酸殘基(精氨酸和賴氨酸)31個(gè)(圖2)，理論等電點(diǎn)為pI 5.47，屬于酸性蛋白質(zhì)。

箭頭示內(nèi)含子插入位點(diǎn)The arrow shows the insertion site of intron； 方框示小熱激蛋白特有保守序列The boxes show the specific and conserved sequences of small heat shock protein； *： 終止密碼子Termination codon.

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果(圖3)顯示：花楸樹(shù)SpHSP23.8蛋白中α螺旋包含50個(gè)氨基酸殘基，占總氨基酸殘基數(shù)的23.26%；β轉(zhuǎn)角包含9個(gè)氨基酸殘基，占總氨基酸殘基數(shù)的4.19%；延伸鏈包含28個(gè)氨基酸殘基，占總氨基酸殘基數(shù)的13.02%；無(wú)規(guī)卷曲包含128個(gè)氨基酸殘基，占總氨基酸殘基數(shù)的59.53%。

h： α螺旋α-helix； t： β轉(zhuǎn)角β-turn； e： 延伸鏈Extended strand； c： 無(wú)規(guī)卷曲Random coil.

蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果(圖4)顯示：SpHSP23.8蛋白包含28個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中，絲氨酸磷酸化位點(diǎn)23個(gè)，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)5個(gè)。

： 絲氨酸Serine； ： 酪氨酸Tyrosine； ： 蘇氨酸Threonine； ： 閾值Threshold.

SignalP預(yù)測(cè)結(jié)果(圖5)顯示：Y分值的最大值為0.214，C分值的最大值為0.126，S分值的最大值為0.444，D值(S分值的平均值和Y分值的最大值的平均值)為0.224(小于0.500)，說(shuō)明SpHSP23.8蛋白不具有信號(hào)肽。

： C分值C-score； ： S分值S-score； ： Y分值Y-score； ： 閾值Threshold.

將SpHSP23.8蛋白的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)SpHSP23.8蛋白中ACD序列分別位于119～200位點(diǎn)，其羧基端存在小熱激蛋白中保守的氨基酸殘基序列P-x(14)-x-V/L/I-V/L/I和P-x(14)-G-V-L(圖2)。與同源性較高的植物的比對(duì)結(jié)果(圖6)顯示：SpHSP23.8蛋白與枇杷〔Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.〕EjsHSP6蛋白(登錄號(hào)AKP06201.1)的同源性最高，為94.88%；與白梨(PyrusbretschneideriRehd.)PbsHSP蛋白(登錄號(hào)XP_009348586.1)、梅(PrunusmumeSieb.)PmHSP22蛋白(登錄號(hào)XP_008238549.1)、桃〔Prunuspersica(Linn.) Batsch〕PpHSP22蛋白(登錄號(hào)XP_007209602.1)和歐洲甜櫻桃〔Prunusavium(Linn.) Linn.〕PaHSP22蛋白(登錄號(hào)XP_021831941.1)的同源性也較高，分別為93.95%、83.26%、82.33%和81.86%；與月季花(RosachinensisJacq.)RcHSP22蛋白(登錄號(hào)XP_024172893.1)、大桉(EucalyptusgrandisW. Mill ex Maiden)EgsHSP蛋白(登錄號(hào)XP_010053471.1)、野草莓(FragariavescaLinn.)FvHSP22蛋白(登錄號(hào)XP_004299444.1)、中華獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch.)AcsHSP蛋白(登錄號(hào)PSS11530.1)和南瓜(CucurbitamoschataDuch.)CmsHSP蛋白(登錄號(hào)XP_022937223.1)的同源性較低，分別為64.94%、64.53%、63.20%、61.09%和61.01%。

Sp： 花楸樹(shù)Sorbus pohuashanensis (Hance) Hedl.； Ej： 枇杷Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.； Pb： 白梨Pyrus bretschneideri Rehd.； Pm： 梅Prunus mume Sieb.； Pp： 桃Prunus persica (Linn.) Batsch； Pa： 歐洲甜櫻桃Prunus avium (Linn.) Linn.； Rc： 月季花Rosa chinensis Jacq.； Eg： 大桉Eucalyptus grandis W. Mill ex Maiden； Fv： 野草莓Fragaria vesca Linn.； Ac： 中華獼猴桃Actinidia chinensis Planch.； Cm： 南瓜Cucurbita moschata Duch.

對(duì)花楸樹(shù)SpHSP23.8蛋白與擬南芥、水稻和毛果楊3種模式植物不同亞族小熱激蛋白的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果(圖7)顯示：花楸樹(shù)SpHSP23.8蛋白與毛果楊PtHSP24.0蛋白在進(jìn)化上關(guān)系最近，且與毛果楊、擬南芥和水稻線粒體亞族的小熱激蛋白聚為一支，推測(cè)SpHSP23.8蛋白定位于花楸樹(shù)的線粒體中。

Pt： 毛果楊Populus trichocarpa Torr. et A. Gray ex Hook.； At： 擬南芥Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.； Os： 水稻Oryza sativa Linn.； Sp： 花楸樹(shù)Sorbus pohuashanensis (Hance) Hedl. CⅠ，CⅡ，CⅢ，CⅣ，CⅤ，CⅥ： 分別為細(xì)胞質(zhì)亞族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ Cytosol subgroup Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，and Ⅵ，respectively； ER： 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)亞族Endoplasmic reticulum subgroup； PX： 過(guò)氧化物酶體亞族Peroxisome subgroup； CP： 葉綠體亞族Chloroplast subgroup； MⅠ，MⅡ： 分別為線粒體亞族Ⅰ和Ⅱ Mitochondria subgroup Ⅰ and Ⅱ，respectively. 分支上數(shù)據(jù)表示重復(fù)次數(shù)Datums in the branches indicate repeats.

2.3 花楸樹(shù)SpHSP23.8基因的表達(dá)分析

花楸樹(shù)不同器官中SpHSP23.8基因的表達(dá)情況見(jiàn)圖8；高溫脅迫、NaCl脅迫和干旱脅迫下，花楸樹(shù)葉片中SpHSP23.8基因的表達(dá)情況分別見(jiàn)圖9、圖10和圖11。

YL： 幼葉Young leaf； ML： 成熟葉Mature leaf； B： 芽Bud； Fl： 花Flower； Fr： 果實(shí)Fruit； S： 莖Stem； R： 根Root. 不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)Different lowercases indicate the significant (P<0.05) difference.

由圖9可以看出：隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，花楸樹(shù)葉片中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。高溫脅迫0.25 h，SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量即顯著升高，隨后急劇升高；高溫脅迫2.00 h，其相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，隨后其相對(duì)表達(dá)量顯著降低。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)Different lowercases indicate the significant (P<0.05) difference.

由圖10可以看出：200和300 mmol·L-1NaCl脅迫下，花楸樹(shù)葉片中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照(蒸餾水)。NaCl脅迫2 d，SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量隨著NaCl濃度的提高顯著升高；NaCl脅迫7 d，其相對(duì)表達(dá)量隨著NaCl濃度的提高先顯著升高后顯著降低。

： 對(duì)照The control； ： 200 mmol·L-1 NaCl； ： 300 mmol·L-1 NaCl.

由圖8可以看出：花楸樹(shù)莖中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著(P<0.05)高于其他器官；果實(shí)和根中的相對(duì)表達(dá)量也較高；花中的相對(duì)表達(dá)量最低。

由圖11可以看出：干旱脅迫5 d，花楸樹(shù)葉片中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照(正常澆灌清水)無(wú)顯著差異；干旱脅迫10 d，SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照。

： 對(duì)照The control； ： 干旱處理Drought treatment.

2.4 轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥對(duì)非生物脅迫響應(yīng)的表達(dá)分析

為進(jìn)一步探究SpHSP23.8基因響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)模式，構(gòu)建了SpHSP23.8基因的超表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，通過(guò)草銨膦(PPT)篩選獲得超表達(dá)純合轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系OE1和OE2(圖12)。

M： Marker； WT： 野生型擬南芥Wild type of Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.

對(duì)轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系OE1和OE2分別進(jìn)行高溫脅迫、NaCl脅迫和干旱脅迫，結(jié)果(圖13)顯示：隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系OE1和OE2中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后下降的趨勢(shì)，其中，高溫脅迫0.25 h，2個(gè)轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量即較對(duì)照(高溫脅迫0.00 h)顯著升高；高溫脅迫6.00 h，2個(gè)轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值；高溫脅迫24.00 h，2個(gè)轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照。隨著NaCl脅迫和干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系OE1和OE2中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量均呈逐漸升高的變化趨勢(shì)，且均較對(duì)照(脅迫0 d)顯著升高。上述結(jié)果說(shuō)明：轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥中SpHSP23.8基因能夠被高溫脅迫、NaCl脅迫以及干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。

： OE1株系OE1 line； ： OE2株系OE2 line.

3 討論和結(jié)論

植物小熱激蛋白的高度多樣化以及與穩(wěn)定蛋白結(jié)合等特點(diǎn)反映了植物對(duì)特定應(yīng)激條件的適應(yīng)性，表明小熱激蛋白在植物抗逆性中起重要作用[32]。本研究從花楸樹(shù)中分離出1個(gè)小熱激蛋白20家族基因SpHSP23.8，該基因的開(kāi)放閱讀框包含648個(gè)堿基，編碼215個(gè)氨基酸；SpHSP23.8蛋白氨基酸序列的羧基端存在小熱激蛋白中保守的氨基酸殘基序列P-x(14)-x-V/L/I-V/L/I和P-x(14)-G-V-L，進(jìn)一步證實(shí)該基因?yàn)榛ㄩ睒?shù)小熱激蛋白基因[33]。同時(shí)，這些保守基序的存在也是小熱激蛋白二聚體形成的前提[34]，推測(cè)該小熱激蛋白能夠發(fā)揮分子伴侶的功能。

植物小熱激蛋白中內(nèi)含子數(shù)量多變，且插入位點(diǎn)也存在較大差異。大多數(shù)小熱激蛋白不含或含有1個(gè)內(nèi)含子，如：馬鈴薯48個(gè)小熱激蛋白基因中，20個(gè)不含內(nèi)含子，23個(gè)含有1個(gè)內(nèi)含子，5個(gè)含有2個(gè)及以上內(nèi)含子[9]；水稻39個(gè)小熱激蛋白基因中，19個(gè)不含內(nèi)含子，17個(gè)含有1個(gè)內(nèi)含子，3個(gè)含有2個(gè)及以上內(nèi)含子[35]。另有研究發(fā)現(xiàn)，一般在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過(guò)氧化物酶體以及細(xì)胞質(zhì)Ⅰ和Ⅱ亞族中小熱激蛋白不含內(nèi)含子，而在葉綠體和線粒體亞族中小熱激蛋白含有1個(gè)內(nèi)含子，且內(nèi)含子插入位點(diǎn)相似，這些亞族小熱激蛋白具有較近的親緣關(guān)系[36]。本研究中，花楸樹(shù)SpHSP23.8基因包含1個(gè)內(nèi)含子，該小熱激蛋白屬于線粒體亞族，這一結(jié)果進(jìn)一步論證了含有1個(gè)內(nèi)含子的線粒體亞族小熱激蛋白在進(jìn)化上的親緣關(guān)系較近。

花楸樹(shù)SpHSP23.8蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包含23.26%的α螺旋、4.19%的β轉(zhuǎn)角、13.02%的延伸鏈和59.53%的無(wú)規(guī)卷曲，其中，β轉(zhuǎn)角有助于SpHSP23.8蛋白形成反向平行結(jié)構(gòu)[37-38]，進(jìn)而發(fā)揮功能。蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程中較為重要和普遍的調(diào)節(jié)方式之一，SpHSP23.8蛋白包含28個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為23個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)和5個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明在非生物脅迫時(shí)，SpHSP23.8蛋白在翻譯后可能通過(guò)磷酸化修飾發(fā)揮抗性作用[39]。

花楸樹(shù)SpHSP23.8基因在花楸樹(shù)不同器官中均有表達(dá)，表明該基因參與了花楸樹(shù)各器官正常的生長(zhǎng)發(fā)育。對(duì)蘭州百合〔Liliumdavidiivar.willmottiae(E. H. Wilson) Raffill〕小熱激蛋白的研究結(jié)果顯示：LimHSP16.45基因在花藥中特異性高表達(dá)[40]。而本研究中SpHSP23.8基因在花楸樹(shù)花中的相對(duì)表達(dá)量最低，推測(cè)該基因在花的發(fā)育過(guò)程中參與較少。對(duì)橡膠樹(shù)HbHSP23.8基因的組織特異性表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因在膠乳中的相對(duì)表達(dá)量最高，且在葉片不同發(fā)育時(shí)期也存在明顯差異[41]。茶樹(shù)〔Camelliasinensis(Linn.) Kuntze〕4個(gè)小熱激蛋白基因在組織中的相對(duì)表達(dá)量也存在差異，其中，CsHSP22.4和CsHSP27.4基因在葉片中的相對(duì)表達(dá)量最高，CsHSP17.5和CsHSP25.2基因在莖中的相對(duì)表達(dá)量最高[42]。本研究中，SpHSP23.8基因在花楸樹(shù)莖中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是果實(shí)和根。不同植物小熱激蛋白基因在不同組織中的差異表達(dá)也進(jìn)一步表明小熱激蛋白進(jìn)化存在差異。

在對(duì)花楸樹(shù)進(jìn)行高溫(42 ℃)脅迫的過(guò)程中，SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先急劇升高后降低的變化趨勢(shì)，高溫脅迫0.25 h時(shí)SpHSP23.8基因即出現(xiàn)顯著性變化，高溫脅迫2.00 h時(shí)SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值。這一結(jié)果與大多數(shù)植物小熱激蛋白基因在高溫脅迫下的變化趨勢(shì)一致，如：茶樹(shù)CsHSP17.2基因表達(dá)量在38 ℃下0.5 h出現(xiàn)顯著變化，于1.0 h達(dá)到峰值后開(kāi)始下降[43]；水稻中OsHSP18.2基因的表達(dá)量在45 ℃下0.25 h出現(xiàn)顯著變化，于2.00 h達(dá)到峰值后開(kāi)始下降[44]。高溫脅迫下，植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、代謝進(jìn)程、活性氧和抗氧化物質(zhì)含量、信號(hào)傳導(dǎo)以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量都會(huì)產(chǎn)生變化，此時(shí)小熱激蛋白寡聚體與底物結(jié)合殘基隨著溫度升高而被解離和激活[45]，增強(qiáng)了其分子伴侶活性，起到維持植物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用?；ㄩ睒?shù)SpHSP23.8基因在高溫脅迫不同時(shí)間的差異表達(dá)表明其可能參與了花楸樹(shù)對(duì)高溫脅迫的應(yīng)激反應(yīng)。對(duì)轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系的高溫(42 ℃)脅迫結(jié)果亦顯示：轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與其內(nèi)源表達(dá)趨勢(shì)一致，進(jìn)一步表明SpHSP23.8基因參與了花楸樹(shù)對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)。

花楸樹(shù)原生境土壤偏酸性，低海拔引種地區(qū)土壤的偏堿性可能對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育帶來(lái)一定影響。本研究中，200 mmol·L-1NaCl脅迫2 d，花楸樹(shù)SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量隨NaCl濃度升高而顯著升高，表明SpHSP23.8基因能夠響應(yīng)NaCl脅迫；而高濃度(300 mmol·L-1)NaCl脅迫7 d，SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量降低，這可能是由于花楸樹(shù)幼苗在高濃度NaCl脅迫下出現(xiàn)萎蔫所致。此外，在150 mmol·L-1NaCl脅迫下，2個(gè)轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與其內(nèi)源表達(dá)相一致，進(jìn)一步表明SpHSP23.8基因能夠響應(yīng)NaCl脅迫。

干旱脅迫5 d，花楸樹(shù)SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量未出現(xiàn)顯著變化，可能是此時(shí)花楸樹(shù)尚未受到明顯的干旱脅迫；干旱脅迫10 d，土壤含水量持續(xù)下降，SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，表明SpHSP23.8基因能夠響應(yīng)干旱脅迫。此外，在干旱脅迫下，2個(gè)轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系中SpHSP23.8基因相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與其內(nèi)源表達(dá)相一致，也進(jìn)一步表明SpHSP23.8基因能夠響應(yīng)干旱脅迫。

綜上所述，花楸樹(shù)SpHSP23.8基因表現(xiàn)出對(duì)高溫、干旱及NaCl等非生物脅迫的應(yīng)激響應(yīng)，這為揭示SpHSP23.8基因響應(yīng)非生物脅迫的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。但與野生型擬南芥相比，2個(gè)轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系未表現(xiàn)出明顯的表型差異。究其原因，一方面，依據(jù)微效多基因假說(shuō)，推測(cè)SpHSP23.8基因的單一超表達(dá)不足以提升擬南芥整個(gè)抗逆網(wǎng)絡(luò)對(duì)非生物脅迫的抵抗；另一方面，植物對(duì)于非生物脅迫的響應(yīng)包括感知、傳導(dǎo)和應(yīng)答等方面，而SpHSP23.8蛋白作為分子伴侶可能需要其他蛋白質(zhì)或者轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同參與，因此，轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥響應(yīng)和參與非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)還有待進(jìn)一步的深入研究。