施建軍，張旭娟，楊涵，施渭堯，柴偉國(guó)

(1.杭州佳惠農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，浙江 杭州 311228； 2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310024)

蘆筍(AsparagusoffcinalisL.)，又名石刁柏，為天門冬科天門冬屬多年生宿根草本植物，蘆筍的嫩莖既可鮮食，也可加工制罐，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常豐富；其嫩莖質(zhì)地鮮嫩、清新可口，對(duì)心臟病、高血壓、癌癥等有特殊療效，具有很高的藥用價(jià)值，因此是一種藥食同源的蔬菜，素有“蔬菜之王”的美譽(yù)[1-2]。由于蘆筍所具的保健功能和較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，使得蘆筍產(chǎn)業(yè)得以迅速發(fā)展。利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行蘆筍優(yōu)良品系的快繁生產(chǎn)，既可以培育大量的優(yōu)質(zhì)種苗，滿足生產(chǎn)的需要，又可以縮短育種年限[3]。杭州佳惠農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司自2006年開始從世界各地引進(jìn)蘆筍優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，開展種質(zhì)材料的創(chuàng)制和新品種選育。T2-32-6是從Jersey Giant全雄品種中選育出的優(yōu)系，其生長(zhǎng)勢(shì)旺，豐產(chǎn)性好，抗旱、抗病能力強(qiáng)。鱗芽休眠、淺春季出筍早熟，嫩莖粗細(xì)一致，頭部鱗片抱合比較緊湊，在夏季高溫條件下不易散頭，適宜作為雜交親本。為加快蘆筍優(yōu)系T2-32-6的擴(kuò)繁，在參考前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)增殖培養(yǎng)、誘導(dǎo)生根等組培技術(shù)進(jìn)行研究，建立了該品系植株材料的高效離體繁殖技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

杭州佳惠農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供的蘆筍優(yōu)系T2-32-6植株。

1.2 處理設(shè)計(jì)

1.2.1 外植體處理

選擇健康、綜合性狀好的T2-32-6單株，摘取露出地面但莖尖尚未分枝的嫩莖，用體積分?jǐn)?shù)2%洗潔精浸泡8～10 min，洗凈后在流動(dòng)的自來水中沖洗30～60 min，吸干水分。在超凈工作臺(tái)上，用75%乙醇處理2 min，0.1% HgCl2滅菌15 min，再用無菌水沖洗5～7次；然后用解剖刀小心切除與藥液接觸過的傷口部位，切成帶芽小段接種到誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基上。

1.2.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基中的糖含量均為30 g·L-1，瓊脂為7.5 g·L-1，pH值為5.8。培養(yǎng)室溫度25 ℃，光照度2 000～3 000 lx，光周期為16 h光照/8 h黑暗。

1.2.3 不同部位外植體

外植體分別為嫩莖白色部分、嫩莖綠色部分、嫩莖頂端。設(shè)3個(gè)處理，每瓶接種6個(gè)莖段，每個(gè)處理12瓶。10 d后，觀察記錄污染株數(shù)，計(jì)算污染率。

1.2.4 誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)

把篩選出的滅菌效果好、適于誘導(dǎo)增殖的莖段分別接種于MS+0.2 mg·L-1NAA、附加不同濃度6-BA激素的培養(yǎng)基上。6-BA設(shè)3個(gè)濃度：0.1、0.3、0.5 mg·L-1，共3個(gè)處理。每個(gè)處理4瓶，每瓶接種6個(gè)莖段，重復(fù)3次。40 d后，觀察記錄叢生芽萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)叢芽萌發(fā)率。

1.2.5 生根培養(yǎng)

選取粗壯的叢芽，接種在1/2MS+0.05 mg·L-1NAA+0.05 mg·L-1KT，附加不同濃度的IBA和嘧啶醇的培養(yǎng)基上。IBA設(shè)2種濃度：0.5、1.0 mg·L-1；嘧啶醇設(shè)2種濃度：0.1、0.5 mg·L-1。共4個(gè)處理，每個(gè)處理接種4瓶，每瓶接種6個(gè)叢生芽，重復(fù)3次。40 d后，觀察生根情況，統(tǒng)計(jì)生根率。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體不同部位的滅菌效果

從表1可知，嫩莖的綠色部分是較適宜的外植體材料，污染率為40.3%，明顯低于嫩莖頂端和嫩莖白色部分。嫩莖頂端由于被鱗片包被，滅菌效果差，不適宜作為外植體材料。嫩莖白色部分為植株基部，易受土壤污染，同時(shí)組織老化不利于叢生芽誘導(dǎo)分化。

表1 外植體不同取樣部位的滅菌效果

2.2 不同激素組合的誘導(dǎo)增殖效果

由圖1結(jié)果可見，嫩莖綠色部分的莖段接種于含0.1、0.3、0.5 mg·L-16-BA的MS+0.2 mg·L-1NAA組合培養(yǎng)基上，0.3 mg·L-16-BA的組合培養(yǎng)基叢芽萌發(fā)率最高，達(dá)89.2%；含0.5 mg·L-16-BA的培養(yǎng)基次之，叢芽萌發(fā)率為74.2%；含0.1 mg·L-16-BA的培養(yǎng)基叢芽萌發(fā)率為70%。結(jié)果表明，適宜蘆筍莖段誘導(dǎo)增殖叢芽的激素組合為MS+0.2 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-16-BA。采用最適誘導(dǎo)增殖配方，在1.2.2節(jié)規(guī)定的培養(yǎng)條件下，帶芽嫩莖綠色部分的莖段經(jīng)過1～2個(gè)繼代周期后，形成無根叢芽組培苗，其基部逐漸膨大，形成鱗莖盤，利于誘導(dǎo)生根(圖2)。

圖1 不同激素組合培養(yǎng)基的誘導(dǎo)增殖效果

培養(yǎng)基配方為MS+0.2 mg·L-1 NAA+0.3 mg·L-1 6-BA。圖2 優(yōu)系T2-32-6誘導(dǎo)增殖效果

2.3 不同激素組合的生根效果

選取粗壯的叢芽進(jìn)行生根試驗(yàn)，在1.2.2節(jié)的培養(yǎng)條件下，接種在1/2MS+0.05 mg·L-1NAA+0.05 mg·L-1KT、附加不同濃度的IBA和嘧啶醇的培養(yǎng)基上。IBA設(shè)2種濃度：0.5、1.0 mg·L-1；嘧啶醇設(shè)2種濃度：0.1、0.5 mg·L-1。培養(yǎng)室溫度25 ℃，光照度2 000～3 000 lx，光周期為16 h光照/8 h黑暗。表2結(jié)果表明，不同激素組合的生根率從高到低依次為0.5 mg·L-1嘧啶醇、0.1 mg·L-1嘧啶醇、1 mg·L-1IBA、0.5 mg·L-1IBA。GA抑制劑嘧啶醇的加入可有效促進(jìn)蘆筍叢芽生根，含有0.5 mg·L-1嘧啶醇的組合生根率較高，可達(dá)80.6%；且植株生長(zhǎng)健壯，根粗壯且長(zhǎng)，肉質(zhì)根上長(zhǎng)出吸收根。培養(yǎng)基中添加嘧啶醇的生根效果明顯優(yōu)于添加IBA(圖3)。

表2 不同激素組合的生根效果

生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+0.05 mg·L-1 NAA+0.05 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1嘧啶醇。圖3 優(yōu)系T2-32-6組培苗生根試驗(yàn)

3 小結(jié)與討論

植物不同部位組織細(xì)胞的排列順序和活動(dòng)能力不同，在離體培養(yǎng)中也會(huì)產(chǎn)生不同的生育狀態(tài)。頂芽生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)，體現(xiàn)了植物頂端優(yōu)勢(shì)作用，利于芽的分化形成；而莖基部細(xì)胞較成熟，器官分化率低于頂芽外植體[4]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，嫩莖頂端因節(jié)間短，且外有鱗片覆蓋，難以滅菌徹底，易污染；而嫩莖基部莖段已為白色，纖維化程度高，其叢生芽分化率低。因此，蘆筍優(yōu)系T2-32-6嫩莖的綠色部分為最佳外植體材料，這部分外植體莖段節(jié)間已伸長(zhǎng)，易滅菌處理，同時(shí)保持了較好的組織分化能力。誘導(dǎo)增殖叢芽以MS+0.2 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-16-BA培養(yǎng)基為宜，叢芽萌發(fā)率可達(dá)89.2%；且經(jīng)過1～2個(gè)繼代周期后，莖基部逐漸膨大，形成鱗莖盤，利于誘導(dǎo)生根。

蘆筍是組培中較難生根的植物。本試驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)增殖和生根過程中，部分叢芽莖基部逐漸膨大，形成鱗莖盤，鱗莖盤上方萌生大量的鱗芽，而這類形成鱗莖盤的叢芽在生根培養(yǎng)時(shí)，鱗莖盤下方易生出肉質(zhì)根，生根率較高。T2-32-6叢芽生根在1/2MS+0.05 mg·L-1NAA+0.05 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1嘧啶醇的培養(yǎng)基上生根率較高，生根率可達(dá)80.6%。嘧啶醇可抑制赤霉素合成酶的活性[5]，從而減少蘆筍體內(nèi)的赤霉素含量，因此，嘧啶醇在本試驗(yàn)中有明顯的促進(jìn)生根作用。