模擬移動床分離D-果糖與D-阿洛酮糖的色譜模型參數(shù)及傳質(zhì)系數(shù)測定

周錦怡 武國慶 郭元亨 陳博 武麗達 李義 佟毅

摘 要：以固定化酶催化轉(zhuǎn)化后的D-果糖及D-阿洛酮糖的混合糖漿為原料，采用陰陽離子樹脂對反應(yīng)后的混合糖漿進行脫鹽預(yù)處理，脫鹽后的電導率為（14.4±0.5）μs·cm-1。對D-果糖及D-阿洛酮糖在不同類型樹脂上的保留行為及分離效果進行研究，確定了DOWEX 310Ca樹脂為適宜的固定相。此外，在不同流速條件下測定了固定相DOWEX 310Ca樹脂的色譜柱參數(shù)并計算得到兩組分的傳質(zhì)系數(shù)。本研究獲得的色譜模型參數(shù)及傳質(zhì)系數(shù)可以為后續(xù)D-阿洛酮糖產(chǎn)品分離實驗、生產(chǎn)優(yōu)化操作及工業(yè)化放大設(shè)計提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：D-阿洛酮糖;D-果糖;傳質(zhì)系數(shù);模擬移動床;色譜分離

Abstract：The mixed syrup of D-fructose and D- psicose that produced by immobilized enzyme catalysis process， were used as the raw material during the separation process. The mixed syrup subjected to desalination pretreatment with anion and cationic resin. The conductivity after desalination of （14.4 ± 0.5） μs·cm-1. The retention behavior and separation effect of D-fructose and D-psicose on different types of resin were studied， and DOWEX 310Ca resin was determined as a suitable stationary phase. The column parameters of the stationary phase DOWEX 310Ca resin were measured under different flow rates， and the mass transfer coefficients of the two components were calculated. This study provided basic data for subsequent D-psicose product separation experiments， production optimization operations， and industrial scale-up design.

Key words：D-Psicose; D-Fructose; Mass transfer; Simulated moving bed; Chromatographic separation

中圖分類號：TS245.4

目前，世界范圍內(nèi)糖尿病、高血壓和高脂血癥等肥胖相關(guān)疾病的患病率和發(fā)病率顯著增加[1]，根據(jù)有關(guān)研究表明，全球2010年大約有2.8億人患有糖尿病，預(yù)計到2030年患者將會增加至4.3億，高脂肪、高熱量食品是導致這種情況的主要原因。在這一背景下，國家越來越重視食品的安全性和對人體健康的影響。2017年，國務(wù)院辦公廳發(fā)布的《中國防止慢性病中長期規(guī)劃》（2017—2025年）指出，以健康促進和健康管理為手段，到2020年降低慢性病導致的過早死亡率較2015年降低10%。積極開展慢病防治是推動由疾病治療向健康管理轉(zhuǎn)變的重要手段，因此，飲食中糖分的“健康攝取”成為新的健康課題，其中，低熱量甜味劑的開發(fā)和應(yīng)用是最為有效的途徑之一[2]。

D-阿洛酮糖作為一款新型甜味劑，其甜度約為蔗糖的70%，熱量約為蔗糖0.3%。與其他天然甜味劑相比，D-阿洛酮糖的熱值明顯偏低，與蔗糖相比，D-阿洛酮糖可同等程度的滿足消費者對甜味的味覺需求，其甜味溫和，且甜度不隨溫度變化而變化，是一款蔗糖的完美替代品[3]。此外，研究表明，D-阿洛酮糖能明顯抑制體重的增加和腹部脂肪的堆積，每天攝入超過6.7%總碳水化合物的D-阿洛酮糖，可以明顯抑制餐后血糖水平[4]。因此，D-阿洛酮糖在控制肥胖和糖尿病治療方面具有極大的潛力，可以作為糖尿病人食用的新型甜味劑，具有良好的應(yīng)用前景[5]。

目前，D-阿洛酮糖主要通過生物合成制得[5]。生物合成法以果糖為底物，通過D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的催化生成阿洛酮糖[6-7]。經(jīng)過異構(gòu)酶催化轉(zhuǎn)化得到的D-阿洛酮糖與未轉(zhuǎn)化的D-果糖最終會同時存在于溶液體系中。從圖1可以看出，果糖及阿洛酮糖結(jié)構(gòu)十分相近[8]，因此采用普通的方法很難實現(xiàn)將二者分離開來，目前多采用色譜分離法，主要包括離子交換色譜[9-10]和模擬移動床色譜[11-12]等。其中，模擬移動床（SMB）色譜技術(shù)具有節(jié)約流動相、自動化程度高、分離效率高、操作費用小等優(yōu)勢，近年來在食品行業(yè)中應(yīng)用得到快速發(fā)展，尤其是在糖類工業(yè)中已得到大規(guī)模的應(yīng)用[13]。其中，果糖與葡萄糖的分離是SMB在糖類成分制備中起步最早的，也是目前制糖工業(yè)分離中規(guī)模最大的[14]。20世紀80年代，美國UOP公司采用Sarex分離過程，以Ca型離子交換樹脂或者分子篩作為填料，水作為洗脫機，首次實現(xiàn)葡萄糖與果糖的分離[15]。當前，SMB分離果葡糖漿已經(jīng)在我國實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。中糧生化能源（公主嶺）有限公司、中糧上海（融氏）生物科技有限公司均建成了年產(chǎn)10萬噸以上的F55生產(chǎn)線[12]。此外，SMB也用于木糖[16]、阿拉伯糖[17]、海藻糖[18]、甜葉菊甙[19]的分離，目前在國內(nèi)企業(yè)均實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

中糧營養(yǎng)健康研究院在小試的基礎(chǔ)上，采用SMB技術(shù)對混合糖漿中D-果糖及D-阿洛酮糖進行分離純化，阿洛酮糖純度可以到98%，收率達到70%。雖然目前采用SMB分離可以達到較好的效果，但是操作參數(shù)仍有很大的優(yōu)化空間，通過優(yōu)化工藝參數(shù)，可以進一步降低生產(chǎn)成本，提高工藝經(jīng)濟性。對于SMB分離過程而言，溶質(zhì)的傳質(zhì)性質(zhì)的研究不僅是色譜分離的基礎(chǔ)，也是工業(yè)色譜放大及優(yōu)化的重要前提[20]。因此，需要通過實驗對D-果糖與D-阿洛酮糖的傳質(zhì)等動力學數(shù)據(jù)進行測定，為后續(xù)模擬和優(yōu)化SMB提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 模擬移動床色譜分離原理

1.1 D-果糖與D-阿洛酮糖分離原理

在SMB分離過程中，固定相直接影響吸附選擇性、保留時間和載量，因此固定相的選擇至關(guān)重要。最早用于果葡糖漿分離介質(zhì)的是分子篩，固定K+的X型沸石對葡萄糖具有吸附作用，而固定有NH4+、Na+、Ca2+或Ba2+離子的沸石對果糖具有吸附選擇作用。目前廣泛應(yīng)用的分離介質(zhì)是離子交換樹脂，其較沸石具有更好的穩(wěn)定、均勻性及再生性能[21]。20世紀80年代，美國UOP公司將Ca2+離子交換樹脂作為分離介質(zhì)用于果糖與葡萄糖的分離，并實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。離子交換樹脂是利用不同類型的糖與陽離子親和力的差異實現(xiàn)分離的目的。理想的陽離子和糖的結(jié)合模型中，相鄰的羥基具有2對軸向-平伏的排列（a-e），沒有平伏-平伏的羥基排列（e-e），如圖2所示。Goulding研究發(fā)現(xiàn)，相鄰羥基的a-e排列與陽離子的結(jié)合能力遠大于e-e排列，即a-e排列越多，結(jié)合越牢固，如β-D-吡喃果糖有兩對不相鄰的a-e排序，而β-D-吡喃D-葡萄糖沒有a-e的排序[21-22]。分析D-阿洛酮糖的構(gòu)型，其軸向-平伏鍵的排列最接近于理想模型（如圖3所示），因此與陽離子的結(jié)合最為牢固。因此從理論上講，陽離子交換樹脂是有可能將D-果糖與D-阿洛酮糖相互分開的。

1.2 SMB分離原理

SMB色譜技術(shù)的分離原理與真實移動床（TMB）基本相同，是基于固定相對各組分的吸附能力的強弱差異進行分離。在TMB分離過程中，固定相由于重力作用，自上而下地移動，到達底部后，解吸完全的固定相被提升到頂部重復(fù)使用;流動相則由下而上移動。SMB的不同點是吸附顆粒被裝填后不再移動，而是由原料進口和產(chǎn)品液流出口之間不斷切換的方法，通過形成吸附顆粒和液流的相對逆流運動來模擬固定相的移動，典型的四帶結(jié)構(gòu)SMB如圖4所示[23]。

1.3 單柱色譜模型

SMB模型由單柱色譜模型和各區(qū)帶間的銜接條件構(gòu)成。單柱色譜模型基于吸附床層微元內(nèi)的物料守恒，是研究色譜分離過程的基礎(chǔ)，也是過程進行設(shè)計及優(yōu)化的前提[24]。目前，常見的色譜模塊包括一般速率模型（GR模型）、理想模型、平衡擴散模型及集總動力學模型等。其中，平衡擴散模型和集總動力學模型是在理想模型的基礎(chǔ)上發(fā)展而來。由于傳質(zhì)阻力不可忽略，因而采用集總動力學模型測定色譜模型參數(shù)，該模型的模型方程見式（1）：

組分k在固定相中的傳質(zhì)平衡方程見式（2）：

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

D-果糖（VWR公司）、D-阿洛酮糖（上海立足生物科技有限公司），均為色譜純;實驗用水，均為Milli-Q水凈化系統(tǒng)制備的超純水（Millipore，Bedford，MA，USA）。

LX-160型陽離子交換樹脂、D-354型陰離子交換樹脂，西安藍曉科技新材料股份有限公司生產(chǎn);DOWEX 310 Ca特種凝膠型陽離子交換樹脂，陶氏化學公司生產(chǎn);Agilent 1260高效液相色譜分析系，美國Agilent公司生產(chǎn);Centrifuge 5424恒溫水浴鍋，德國Eppendorf公司生產(chǎn);RE-2002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，北京神泰偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn);PAL-1手持糖度儀，日本ATAGO（愛拓）公司生產(chǎn);KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)。

2.2 實驗方法

2.2.1 高效液相色譜定量分析

配制20 g·L-1 D-果糖及D-阿洛酮糖標準液，依次稀釋成1、2、5、7 g·L-1和10 g·L-1。采用Agilent 1260系列高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)測定混合糖漿中D-果糖及D-阿洛酮糖的含量，以標準品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標分別繪制D-果糖及D-阿洛酮糖的標準曲線，根據(jù)標準曲線對分離前后的D-阿洛酮糖濃度進行定量分析。HPLC系統(tǒng)包括G1311C四元泵、G1316A柱溫箱、G1329B自動進樣系統(tǒng)和G1236A示差檢測器，色譜柱為Waters sugar-PakI （10 μm，6.5 mm×300 mm）;柱溫為80 ℃，RID檢測溫度為55 ℃，流動相為水，流速為0.4 mL·min-1。所有樣品進樣前均使用0.45 μm的微濾膜過濾，樣品進樣量為20 μL。

2.2.2 樣品溶液制備及預(yù)處理

前處理工藝流程如圖5所示。以D-果糖為原料，通過樹脂固定化酶進行異構(gòu)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，通過抽濾實現(xiàn)混合糖漿與樹脂固定化酶的分離，固定化酶回收利用進行下一次催化反應(yīng)，混合糖漿進行脫鹽處理，除去溶液中殘留的離子。通過LX-160型陽離子交換樹脂脫除金屬陽離子，采用D-354型陰離子交換樹脂脫除陰離子，使溶液的電導率為下降到50 μs·cm-1以下。脫鹽后的反應(yīng)液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至干固含量為50%備用。

2.2.3 固定相的篩選

SMB分離技術(shù)中，固定相和流動相的選擇至關(guān)重要。對于糖類的分離，流動相通常采用純凈水[21]，因此固定相的選擇尤為重要。色譜分離中，樹脂的吸附選擇性越高，分離效果越好。采用高效液相色譜（HPLC）對DOWEX 310Ca、DOWEX 310Na、DOWEX 310K及DOWEX 310H四種陽離子交換樹脂分離效果進行評價。其中，流動相為去離子水，流速10 mL·min-1，色譜柱溫度60 ℃，檢測器采用示差折光檢測器，所有樣品進樣前均使用0.45 μm的微濾膜過濾。

2.2.4 色譜柱孔隙率的測定

孔隙率是色譜柱重要參數(shù)之一[25]。對于凝膠型色譜柱，一般采用藍葡聚糖作為示蹤劑[27]。通過測定示蹤劑在DOWEX 310Ca色譜柱上的保留時間，計算出色譜柱的孔隙率ε，如式（3）所示。

式（3）中，V0-系統(tǒng)死體積，VD-色譜柱孔隙體積;

V-色譜柱體積。

色譜實驗條件為：柱溫60 ℃，在流量10～14 mL·min-1條件下脈沖進樣1 g·L-1的藍葡聚糖示蹤劑，設(shè)置紫外檢測器記錄藍葡聚糖的流出曲線，紫外檢測波長254 nm。

2.2.5 傳質(zhì)系數(shù)的測定

對于二元組分，色譜柱上微元段的物料衡算方程見式（4）[25]。

組分的理論板數(shù)N與脈沖實驗流速u、傳質(zhì)擴散系數(shù)DL及總傳質(zhì)系數(shù)km有關(guān)[26]，根據(jù)上述條件可推到出式（7）。

2.3 數(shù)據(jù)分析

本實驗全部實驗數(shù)據(jù)用WPS Office表格進行統(tǒng)計處理，數(shù)值以均值±標準差表示，采用軟件Origin 9.1進行繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 高效液相色譜定量分析

D-果糖和D-阿洛酮糖的標準曲線如圖6、圖7所示，所得的回歸方程如式（8）、式（9）所示。

3.2 固定相的篩選結(jié)果

通過單柱脈沖實驗考察了不同類型的樹脂對于D-阿洛酮糖與D-果糖的分離情況，結(jié)果如圖8（a）～圖8（d）所示。分離過程中兩種糖類的保留行為（保留時間μ與σ2方差）結(jié)果如表1所示。

從上述結(jié)果可以分析得出，由于不同型號的樹脂性能上的差別，導致相同分離條件下分離結(jié)果存在差異。樹脂的離子型式對于保留行為和分離性能有較大影響，對于阿洛酮糖，Ca型樹脂保留性能最強，K型和Na型樹脂保留性能居中，H型樹脂保留相對較弱，體現(xiàn)在峰展寬和保留時間的不同。綜合分析，選擇分離效果最好Ca型陽離子交換樹脂作為SMB色譜分離的分離介質(zhì)。

3.3 孔隙率及傳質(zhì)系數(shù)測定結(jié)果

根據(jù)式（3）中流動相流量Q與出峰時間t的可以測定色譜柱孔隙率V0，具體實驗結(jié)果見表2。

除了樹脂的選擇以外，傳質(zhì)系數(shù)是色譜分離性能極為重要的判斷依據(jù)[27]。在流速5～10 mL·min-1的實驗范圍內(nèi)測定D-果糖及D-阿洛酮糖的流出曲線，實驗結(jié)果見表3。

理論板數(shù)N與u·λ的關(guān)聯(lián)結(jié)果見圖9。

D-果糖與D-阿洛酮糖的擬合方程見式（10）及式（11）：

從圖7可以看出不同流速下u·λ與1/N均呈線性相關(guān)，根據(jù)圖9的斜率和截距并結(jié)合式（7）可以得到D-果糖及D-阿洛酮糖的理論板數(shù)及傳質(zhì)系數(shù)：

4 結(jié)論

本文對混合糖漿中阿洛酮糖的分離過程進行研究。采用陽-陰離子樹脂，對酶催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)后的混合糖漿進行脫鹽預(yù)處理，脫鹽后的電導率為（14.4±0.5）μs·cm-1。對分離D-果糖及D-阿洛酮糖的固定相進行篩選，通過考察D-果糖及D-阿洛酮糖在不同類型樹脂上的保留行為及分離效果，確定DOWEX 310Ca樹脂為適宜的固定相。對D-果糖和D-阿洛酮糖的色譜模型參數(shù)及傳質(zhì)系數(shù)進行測定，在流速5～10 mL·min-1的范圍內(nèi)，D-果糖和D-阿洛酮糖的傳質(zhì)系數(shù)分別為4.84 min-1及24.2 min-1，色譜柱孔隙率為0.092，為后續(xù)進一步優(yōu)化SMB分離過程提供基礎(chǔ)參數(shù)。

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