0.05);與對照組比較,高劑量組能夠顯著提高小鼠的細(xì)胞免疫功能,如淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、NK細(xì)胞活性(P關(guān)鍵詞:亞麻籽油;小"/>
董和亮 郭嘉欣 白坤穎 趙娟
摘 要:目的:研究亞麻籽油對小鼠免疫力功能的影響。方法:測定亞麻籽油中亞麻酸的含量,以高、中、低劑量組給予小鼠30 d灌胃實(shí)驗(yàn),分析測定碳粒廓清實(shí)驗(yàn),遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng),抗體生成細(xì)胞實(shí)驗(yàn),腹腔巨噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn),淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),NK細(xì)胞活性測定。結(jié)果:亞麻籽油對小鼠的體重、臟器/體重比值、血清溶血素以及單核巨噬細(xì)胞功能無顯著影響(P>0.05);與對照組比較,高劑量組能夠顯著提高小鼠的細(xì)胞免疫功能,如淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、NK細(xì)胞活性(P<0.05)。結(jié)論:亞麻籽油對小鼠具有增強(qiáng)免疫力的功能。
關(guān)鍵詞:亞麻籽油;小鼠;免疫功能;亞麻酸
Abstract:Objective: To study the effect of linseed oil on the immune function of mice. Method: The content of linolenic acid in linseed oil was analyzed, and linseed oil were used as high, medium and low dose groups to give mice a 30 d gavage experiment to analyze and determine carbon Clearance test, delayed type allergy, antibody-producing cell test, chicken macrophage cell test, lymphocyte transformation test, NK cell activity determination. Results: Linseed oil had no significant effect on the body weight, organ/weight ratio, serum hemolysin and mononuclear macrophage function of mice (P>0.05); compared with the control group, the high-dose group could significantly improve the mice Cellular immune function, such as lymphocyte transformation, delayed type allergy, NK cell activity (P<0.05). Conclusion: Linseed oil has the function of enhancing immunity in mice.
Key words:Linseed oil; Mice; Immune function; Linolenic acid
中圖分類號(hào):TS201.4
亞麻籽油中的亞麻酸對維持和提高正常的生理功能、預(yù)防疾病及患病風(fēng)險(xiǎn)具有積極的作用[1-3]。隨著人們健康意識(shí)的提高,各類營養(yǎng)補(bǔ)充劑不斷興起,亞麻酸已成為重要的食品與保健品原料[4]。亞麻籽油富含人體所需的必需脂肪酸,可彌補(bǔ)日常飲食中脂肪酸攝入量不足,解決比例失衡的問題[5-7]。鑒于飲食中不飽和脂肪酸的缺乏,市場上出現(xiàn)了各種脂肪酸保健品。亞麻籽油作為豐富亞麻酸的植物來源,目前關(guān)于其對免疫力的影響尚處于空白階段,亟需理論研究支持[8-10]。
基于亞麻籽油表現(xiàn)出的功能特性,本文分析測定了亞麻籽油中亞麻酸的含量,并以小鼠為研究對象,依據(jù)保健食品檢驗(yàn)與技術(shù)評價(jià)規(guī)范,采用碳粒廓清實(shí)驗(yàn),遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng),抗體生成細(xì)胞實(shí)驗(yàn),腹腔巨噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn),淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),NK細(xì)胞活性測定等方法,研究分析亞麻籽油對小鼠免疫力的影響,以期闡明亞麻籽油的免疫調(diào)節(jié)過程及調(diào)節(jié)途徑,為其全面利用和開發(fā)亞麻籽油提供科學(xué)指導(dǎo)和理論依據(jù),為開發(fā)功能保健食品提供借鑒。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料與動(dòng)物
亞麻籽油,由山西五臺(tái)山沙棘制品有限公司提供,為淺黃色至黃色液體。體重18~22 g清潔級ICR雌性小鼠200只,由上海萊斯克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002。飼料,由上海普路騰生物科技有限公司提供,許可證號(hào):滬飼證(2014)04001
1.2 儀器設(shè)備
8 mm直徑打孔器,微量血凝試驗(yàn)板,2-16K通用離心機(jī),RT-6100酶標(biāo)儀,96孔培養(yǎng)板,Co-150 CO2培養(yǎng)箱,UV-1800紫外可見分光光度計(jì),OlympusIX71倒置顯微鏡,電子天平,顯微鏡。
1.3 主要試劑
注射用墨汁,刀豆蛋白A(ConA),MTT,DNFB,丙酮,麻油,SRBC,生理鹽水,雞紅細(xì)胞,羊紅細(xì)胞,甲醇,Giemsa染色,YAC-1細(xì)胞,Hanks液(pH7.2~7.4),RPM11640完全培養(yǎng)液,乳酸鋰,碘硝基氯化四氮唑(INT),吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)、NAD、Tris-HCL緩沖液(pH8.2),1%NP40,臺(tái)酚蘭,1 mol·L-1鹽酸,酸性異丙醇等。
1.4 方法
1.4.1 亞麻酸含量的測定
(1)待測樣品制備。準(zhǔn)確稱取油脂樣品50 mg移入10 mL小容量瓶內(nèi),向其中加入3 mL正己烷與苯混合溶液(1∶1比例),并輕輕搖晃使其混合均勻。再加入2 mL NaOH-CH3OH溶液,充分振蕩使其混合均勻后,在常溫下靜置30 min,向容量瓶內(nèi)添加一定量去離子水使容量瓶內(nèi)原有的有機(jī)溶劑升至瓶口,靜置5 min待穩(wěn)定后,吸取上清液進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析[11]。
(2)測定方法。將100 m×0.25 mm×0.20 μm的HP-88型號(hào)毛細(xì)管柱連接到6890/5973安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀上。氦氣作為載氣,載氣壓力保持在100 kPa,進(jìn)樣模式選擇split,分流比設(shè)為1∶30,流速為1 mL·min-1,注射溫度定為250 ℃,EI作為為離子源(溫度設(shè)為230 ℃),將四級桿溫度設(shè)為150 ℃,傳輸溫度設(shè)為250 ℃,并在50~550 amu的范圍、電離壓力為70 eV的條件下進(jìn)行掃描。掃描升溫過程如下:將儀器的初始溫度設(shè)為80 ℃并保持5 min;以10 ℃·min-1的速度升至150 ℃,保持2 min;再以5 ℃·min-1的速度升至230 ℃,保持10 min;整個(gè)分析過程持續(xù)40 min。采用外標(biāo)法測定油樣,每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。根據(jù)脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間及面積歸一法計(jì)算脂肪酸的相對含量。
1.4.2 受試樣品及配制
亞麻籽油的成人日推薦量為3 g,即0.05 g·kg-1?BW(成人體重以60 kg計(jì))。按日推薦量的5倍、10倍、30倍配制受試樣品濃度分別為0.15、0.05和0.025 g·mL-1的高、中、低劑量組,以食用大豆油作為對照組。臨用前稱取亞麻籽油15 g與食用大豆油混合均勻至100 mL,為高劑量組;取高劑量組樣品40 mL,與食用大豆油混合均勻至120 mL,為中劑量組,取中劑量組樣品40 mL,與食用大豆油混合均勻至80 mL,作為低劑量組。
1.4.3 動(dòng)物分組與給藥
參照韓飛方法,200只小鼠隨機(jī)分成5大組,再分成4小組,每小組10只小鼠,分別進(jìn)行體重、空斑、溶血素測定、臟器指數(shù),NK活性、淋轉(zhuǎn)試驗(yàn),DTH試驗(yàn),小鼠碳粒廓清試驗(yàn),小鼠腹腔巨噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)。按每日10 mL·kg-1 BW連續(xù)灌胃30 d后,分別進(jìn)行試驗(yàn)。
1.4.4 小鼠體重的測定。
標(biāo)記每只小鼠,記錄小鼠的初始體重和終期體重。
1.4.5 碳粒廓清實(shí)驗(yàn)測定
在最后一次給予受試物24 h后,稱小鼠體重,小鼠尾部靜脈注入稀釋的印度墨汁,2 min、10 min后,取內(nèi)眥靜脈血20 μL,并立即加入2 mL 0.1%NaCO3溶液中,以NaCO3溶液為空白對照,在600 nm處測定OD值,將小鼠處死后,取出肝臟、脾臟后稱重,計(jì)算吞噬指數(shù)a[12]。
式(1)(2)中:K-碳粒廓清指數(shù),表示吞噬速率;OD1-t1時(shí)的吸光度值;OD2-t2時(shí)的吸光度值;t1-給墨汁后第2次取血的時(shí)間;t2-給墨汁后第2次取血的時(shí)間;a-吞噬指數(shù),反映每單位組織質(zhì)量的吞噬活性。
1.4.6 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)檢測
在最后一次給予受試物24 h后,對小鼠腹部皮膚約3 cm×3 cm進(jìn)行脫毛處理,用50 μL的DNFB溶液涂抹均勻致敏;5 d后,再以10 μL的上述溶液均勻涂抹小鼠右耳。24 h后,頸椎脫臼處死小鼠,剪下左右耳,用打孔器取下直徑8 mm的耳片稱重[13]。
1.4.7 體液免疫功能測定
在最后一次給予受試物24 h后,腹腔注射0.2 mL 2%(V/V)SRBC懸液。5 d后,進(jìn)行血清溶血素檢測和抗體生成細(xì)胞檢測。
(1)抗體生成細(xì)胞的測定。頸椎脫臼處死小鼠,取脾臟,經(jīng)磨碎、過濾、離心,洗滌后懸浮于8 mL Hanks液中。取25 μL脾細(xì)胞懸液、50 μL 10%SRBC、0.5mL 0.5%的瓊脂糖Hanks液混合培養(yǎng)基迅速混勻,傾倒于6 cm已刷瓊脂薄層的平皿上,于CO2培養(yǎng)箱中溫育1.5 h,然后用SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體(1∶8)加入,溫育3 h后,統(tǒng)計(jì)溶血空斑數(shù)[14]。
(2)血清溶血素的測定。將小鼠摘除眼球采血,2 000 r·min-1離心10 min進(jìn)行血清的分離,用生理鹽水稀釋不同倍數(shù)并置于微量血凝板內(nèi),每孔100 μL,加入同體積的0.5%(v/v)的SRBC懸液,混勻,37 ℃溫箱孵育3 h,觀察血球凝集程度[15]。
1.4.8 小鼠腹腔巨噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(半體內(nèi)法)和臟器/體重比值
在最后一次給予受試物24 h后,腹腔注射1 mL 20%雞紅細(xì)胞懸液。30 min后,頸椎脫臼處死動(dòng)物,固定在鼠板上剪開腹壁皮膚,經(jīng)腹腔注入2 mL生理鹽水,轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1 min。吸出1 mL腹腔洗液,滴于2片載玻片上,移置37 ℃溫育30 min。生理鹽水漂洗、晾干、固定、染色、蒸餾水漂洗晾干。在油鏡下閱片計(jì)數(shù),計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。
吞噬率(%)=(吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù))×100? ?(3)
吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)? ?(4)
取脾臟及胸腺,稱重,計(jì)算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)[16]。
胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/體重(g)? ?(5)
脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體重(g)? ?(6)
1.4.9 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和小鼠NK細(xì)胞活性測定
在最后一次給予受試物24 h后,頸椎脫臼法處死小鼠,無菌取脾,置于無菌的適量Hanks液的小平皿中,用鑷子輕輕將脾撕碎,過200目篩網(wǎng),為單細(xì)胞懸液。
(1)ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。參照楊迪[17]的方法,并做適當(dāng)修改,將上述細(xì)胞懸液經(jīng)離心,調(diào)整濃度為3×106個(gè)/mL。分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中,每孔1 mL,一孔加75 μL ConA液,另一孔為對照,培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)68 h時(shí),每孔吸去0.7 mL上清液,并加入同體積不含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液與50 μL的MTT,繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后,分裝于96孔培養(yǎng)板,3個(gè)平行孔,于570 nm處測定OD值。
(2)小鼠NK細(xì)胞活性測定(乳酸脫氫LDH測定法)。參照王曉林的方法[18]。試驗(yàn)前24 h將靶細(xì)胞傳代培養(yǎng),Hanks液洗3次,RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL。棄上清液將細(xì)胞漿彈起,加入0.5 mL滅菌水20 s,裂解紅細(xì)胞后再加入0.5 mL 2倍Hanks液及8 mL Hanks液,離心10 min(1 000 r·min-1),用1 mL完全培養(yǎng)液重懸,用1%冰醋酸稀釋后計(jì)數(shù),染色計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100 μL(效靶比為50∶1),加入96孔培養(yǎng)板中;靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μL、靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1%NP40各100μL,上述各項(xiàng)均設(shè)3個(gè)平行孔,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,然后將培養(yǎng)板1 500 r·min-1離心5 min,每孔吸取上清液100 μL置于96孔培養(yǎng)板中,并加入同體積的LDH基質(zhì)液,反應(yīng)3min,每孔加入30 μL 1 moL·L-1的HCl,于490 nm處測定OD值。
1.5 數(shù)據(jù)處理
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以O(shè)rigin作圖,SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析。經(jīng)方差齊性檢驗(yàn),方差齊的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,方差不齊的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Tamnane法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 亞麻籽油中亞麻酸含量測定
亞麻籽油中含豐富的營養(yǎng)成分如維生素E、甾醇等[3-6]。另外,亞麻籽油中亞麻酸含量較高,大量研究認(rèn)為,亞麻酸具有降低心血管疾病的作用,對提高身體機(jī)能具有積極的影響,是目前最理想的單一植物油脂[7-9],因此,測定分析樣品中亞麻酸的含量。圖1為亞麻籽油脂肪酸氣相色譜圖,經(jīng)測定分析本實(shí)驗(yàn)中采用的亞麻籽油中亞麻酸含量高達(dá)44.0%。
2.2 亞麻籽油對小鼠體重的影響
亞麻籽油對小鼠體重的影響見表1。由表1可知,30 d灌胃試驗(yàn)結(jié)束后,低劑量組小鼠的體重最高為33.2 g,與對照組比較,高、中、低各劑量組小鼠的體重均無顯著差異(P>0.05),說明亞麻籽油對小鼠體重?zé)o影響。
2.3 小鼠碳粒廓清試驗(yàn)
圖2為小鼠的碳粒廓清試驗(yàn),由圖2可知,高、中、低各劑量組小鼠碳粒廓清吞噬指數(shù)a與對照組比較,差異均不顯著(P>0.05)。其中,高劑量組的吞噬指數(shù)a最高為4.82,低劑量組的吞噬指數(shù)a最低為4.56。
2.4 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)
表2為DTH測定結(jié)果,由表2可知,高劑量組小鼠左右耳腫脹度差最高為22.2 mg,明顯高于對照組,差異顯著(P<0.05),而中、低劑量組與對照組相比,差異不顯著(P>0.05)。
2.5 體液免疫功能測定
2.5.1 抗體生成細(xì)胞檢測試驗(yàn)
小鼠抗體生成細(xì)胞檢測試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,與對照組比較,高劑量組與中劑量組具有顯著的差異(P<0.05),低劑量組與對照組比較,差異不顯著(P>0.05)。
2.5.2 血清溶血素試驗(yàn)
血清溶血素試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,各劑量組小鼠抗體積數(shù)與對照組比較,差異均不顯著(P>0.05)。
2.6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)
巨噬細(xì)胞功能主要為吞噬作用,其代表著多個(gè)器官的免疫潛能。巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知,高、中、低各劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率、轉(zhuǎn)換值及吞噬指數(shù)與對照組比較,差異不顯著(P>0.05)。
2.7 臟器/體重比值的測定
正常時(shí)各臟器與體重的比值比較恒定。當(dāng)動(dòng)物染毒后,受損臟器重量可能發(fā)生改變,從而引起臟體比的變化。各劑量組胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的測定結(jié)果見表4,由表4可知,與對照組比較,高、中、低各劑量組均無顯著差異(P>0.05)。說明亞麻籽油對小鼠的臟器/體重比值無影響。其中P為概率值,取值在0~1之間,其數(shù)值越小,說明置信度就越高。由表4可知,P值均大于0.05,說明實(shí)驗(yàn)各組無差異,進(jìn)一步說明受試樣品亞麻籽油對小鼠的臟器/體重比值無影響。
2.8 細(xì)胞免疫功能測定
表5為ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果,由表5可知,與對照組比較,低劑量組和中劑量組小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化OD值差異不顯著(P>0.05),而高劑量組小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化OD差值明顯高于對照組,差異顯著(P<0.05)。說明亞麻籽油具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫的功能。
2.9 NK細(xì)胞活性測定
NK細(xì)胞活性測定結(jié)果見表6。由表6可知,高劑量組小鼠NK細(xì)胞活性明顯高于對照組,NK細(xì)胞活性提高了21.6%,差異顯著(P<0.05),而中、低劑量組與對照組比較,差異不顯著(P>0.05)。
3 結(jié)論
經(jīng)30 d灌胃試驗(yàn)后,與對照組比較,高、中、低各劑量組小鼠體重,胸腺指數(shù),脾指數(shù),小鼠血清溶血素水平,碳粒廓清能力,小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而亞麻籽油高劑量組能夠明顯增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力和DNFB誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng),能顯著提升小鼠抗體生成能力及小鼠NK細(xì)胞活性,說明亞麻籽油可提高小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》(衛(wèi)生部2003)的規(guī)定,說明亞麻籽油具有增強(qiáng)小鼠免疫功能的作用,其可用于食品、保健食品提高免疫力等功能產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用。
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