楊燕

[摘要]本研究建立了以固相萃取凈化樣品、超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測定糧食中玉米赤霉烯酮的檢測方法。試樣以1%乙酸乙腈-水（84∶16，V/V）作為提取溶劑，經(jīng)固相萃取凈化柱凈化濃縮，乙腈和水做流動相，經(jīng)C18柱分離，以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進行定量定性分析，以外標法定量。結(jié)果表明，該檢測方法在1.0～100.0ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R>0.999，樣品回收率在84.2%～107.6%，相對標準偏差（RSD）在1.7%～6.5%，能滿足當(dāng)前糧食中玉米赤霉烯酮的檢測要求。

[關(guān)鍵詞]玉米赤霉烯酮;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;固相萃取

中圖分類號：TS207.4 文獻標識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202009

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是由鐮刀菌產(chǎn)生的雌激素類真菌毒素，是污染糧食種類最廣泛的真菌毒素之一[1]，玉米、小麥等糧食及其谷物制品中都可能檢測到玉米赤霉烯酮[2]。玉米赤霉烯酮具有較弱的雌激素作用，人和動物食用被玉米赤霉烯酮污染的食物或飼料后會導(dǎo)致雌激素水平提高，造成生殖系統(tǒng)機能紊亂，危害人體健康。該毒素還具有肝毒性、免疫毒性及細胞毒性，在外部條件誘導(dǎo)下還會致癌[3-4]。玉米赤霉烯酮的毒性及污染受到世界各國的重視，各國都制定了糧食及谷物制品中玉米赤霉烯酮含量的限量標準。例如，法國規(guī)定植物油和谷類中玉米赤霉烯酮檢測限量不得超過200μg/kg;俄羅斯規(guī)定硬質(zhì)小麥、面粉中玉米赤霉烯酮檢測限量不得超過1 000μg/kg;意大利規(guī)定谷物和谷物產(chǎn)品中玉米赤霉烯酮檢測限量不得超過100μg/kg;巴西規(guī)定玉米中玉米赤霉烯酮檢測限量不得超過200μg/kg;我國《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）[5]中規(guī)定玉米、小麥等谷物及其制品中玉米赤霉烯酮限量指 標≤60μg/kg，《飼料衛(wèi)生標準》（GB 13078—2017） [6]中規(guī)定玉米赤霉烯酮限量指標≤0.5mg/kg。

測定糧食谷物食品中玉米赤霉烯酮的方法很多，有薄層色譜法[7]、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）[8]、膠體金免疫層析法[9]、（超）高效液相色譜法[10]（紫外檢測高效液相色譜法、免疫親和柱-熒光檢測高效液相色譜法）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜法[11]等。其中，薄層色譜法重現(xiàn)性差，靈敏度低;酶聯(lián)免疫吸附測定法和膠體金法操作簡便、快速，適用于糧食企業(yè)大批樣品的現(xiàn)場快速檢測，但特異性差;氣相色譜法具有靈敏度高、測量準確等特點，但檢測速度不如液相色譜法快，所以較少應(yīng)用于霉菌毒素檢測;（超）高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法適用于實驗室內(nèi)精確定量。當(dāng)前較常用的測定糧食中玉米赤霉烯酮含量的方法有免疫親和柱-熒光檢測高效液相色譜法，但現(xiàn)有普遍使用的免疫親和柱-熒光檢測高效液相色譜法存在前處理復(fù)雜、耗時長，人為因素引入誤差的風(fēng)險高等問題。為此，本研究通過試驗，建立采用226多功能固相萃取柱進行凈化處理，以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測糧食中玉米赤霉烯酮的方法。該方法操作簡單快速、檢測靈敏度高、重現(xiàn)性好、定性定量兼顧，與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相比快速省時、準確可靠。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

玉米、小麥、稻谷等樣品：市售;玉米赤霉烯酮標準品：濃度為100μg/mL，青島普瑞邦生物工程有限公司。

乙腈色譜純：賽默飛世爾科技（中國）有限公司;純水：屈臣氏集團（香港）有限公司。

1.2 主要儀器和設(shè)備

1290-6470型高效液相色譜-三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜：安捷倫科技有限公司;MV5型多通道平行濃縮儀（氮吹儀）：北京萊伯泰科儀器股份有限公司;HC-3018型離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;IKA型漩渦混合器：北京聯(lián)合科力科技有限公司;BLH-5601型錘式旋風(fēng)磨（全自動）：浙江伯利恒儀器設(shè)備有限公司;MCF226型赤霉烯酮固相凈化柱、玉米赤霉烯酮免疫親和柱：青島普瑞邦生物工程有限公司;有機微孔濾膜（0.22μm）：天津市津騰實驗設(shè)備有限公司。

2 試驗方法

2.1 樣品前處理

玉米樣品經(jīng)錘式旋風(fēng)磨粉碎后，稱取5.0g于50mL離心管中，加入20mL1%乙酸乙腈-水混合液（84∶16，V/V），渦旋混勻1min，置于旋轉(zhuǎn)混合器上震蕩提取1h，然后以10 000r/min離心2min，上清液待凈化。

吸取8mL上清液過PriboFast、MCF226固相凈化柱，取4mL凈化液45℃氮吹至近干，用1mL乙腈-水（20∶80，V/V）復(fù)溶，渦旋混勻后待UPLC-MS/MS分析。

2.2 標準溶液配制

標準儲備液：將濃度為100.0μg/mL的玉米赤霉烯酮標準溶液用乙腈定容配制成濃度為1 000.0ng/mL的標準儲備液，于-20℃保存。

標準工作使用液：移取適量體積的標準儲備液至不同的10mL容量瓶中，用乙腈-水（20∶80，V/V） 定容，得到濃度分別為1μg/L、5μg/L、10μg/L、25μg/L、 50μg/L、100μg/L的標準溶液。

基質(zhì)標準使用液：分別取上述各濃度標準溶液1mL于離心管中氮吹至近干，用1mL空白基質(zhì)溶液復(fù)溶，得到濃度分別為1μg/L、5μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L的基質(zhì)標準溶液，臨用現(xiàn)配。

2.3 儀器工作條件

2.3.1 色譜條

C18色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm）;柱溫：40℃;流速：0.4mL/min;進樣量：5μL;流動相及洗脫梯度見表1。