余亦程 熊武 蔡昫 王禹萌 肖慧 白雪 鄒曉玲

摘要?目的：研究黃芪甲苷（Astragaloside IV，AS-IV）干預(yù)高糖受損人內(nèi)皮祖細(xì)胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）增殖的最佳濃度，并探討AS-IV對高糖受損EPCs生物學(xué)功能的影響。方法：取足月新生兒臍帶血分離、培養(yǎng)并鑒定EPCs，將鑒定成功的EPCs用30 mmol/L的葡萄糖預(yù)處理120 h后，隨機(jī)分為實驗組（HG+AS-IV組）和對照組（HG組），同時設(shè)置正常組（NC組）。用CCK8檢測不同濃度AS-IV（0、25、50、100、200、400 mg/L）干預(yù)EPCs 24 h后的增殖情況，繪制增殖曲線，初步得出AS-IV干預(yù)高糖受損人EPCs增殖的最佳濃度。進(jìn)而通過CCK-8增殖實驗、黏附能力測定試驗、細(xì)胞劃痕試驗及Matrigel體外成血管實驗檢測最佳濃度的AS-IV對高糖受損EPCs增殖、黏附、遷移和成管功能的影響。結(jié)果：AS-IV促高糖受損EPCs增殖的最佳濃度為100 mg/L;與對照組比較，100 mg/L AS-IV干預(yù)后的高糖受損EPCs增殖能力、黏附細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞遷移率、體外成管數(shù)均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P1<0.05）;同時檢測實驗組與正常組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P2>0.05）。結(jié)論：AS-IV可顯著改善體外高糖受損的人EPCs的生物學(xué)功能，恢復(fù)其原有活力并具有介導(dǎo)血管新生的潛能。

關(guān)鍵詞?黃芪甲苷;內(nèi)皮祖細(xì)胞;生物學(xué)功能;體外實驗

Abstract?Objective：To study the optimal concentration of Astragaloside IV（AS-IV）on the proliferation of human endothelial progenitor cells（EPCs）impaired by high glucose，and to explore the biological effects of AS-IV on high glucose impaired EPCs.Methods：Full-term neonatal umbilical cord blood was isolated，cultured，and EPCs were identified.The identified EPCs were pretreated with 30 mmol/L glucose for 120 hours，and were randomly divided into an experimental group（HG+AS-IV group）and a control group（HG Group），while the normal group（NC group）was set.CCK8 was used to detect the proliferation of EPCs at different concentrations of AS-IV（0，25，50，100，200，400 mg/L）after 24 hours，and the proliferation curve was drawn to obtain the preliminary conclusion that AS-IV interfered with the proliferation of EPCs in patients with high glucose damage.Optimal concentration.Furthermore，the effects of the optimal concentration of AS-IV on the proliferation，adhesion，migration，and tube-forming function of high-glucose-damaged EPCs were tested by CCK-8 proliferation assay，adhesion ability test，cell scratch test，and Matrigel in vitro angiogenesis experiment.Results：The optimal concentration of AS-IV to promote the proliferation of high-glucose-damaged EPCs was 100 mg/L; compared with the control group，100 mg/L AS-IV-treated high-glucose-damaged EPCs had the proliferation capacity，the number of adherent cells，and cell migration The rate and the number of tube formation in vitro were significantly increased，and the differences were statistically significant（P1<0.05）.At the same time，there was no significant difference between the experimental group and the normal group（P2>0.05）.Conclusion：AS-IV can significantly improve the biological function of human EPCs with impaired high glucose in vitro，restore their original vitality and have the potential to mediate angiogenesis.

Keywords?Astragaloside IV; Endothelial progenitor cells; Biological function; In vitro experiment

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.21.009

內(nèi)皮祖細(xì)胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）可分化成為成熟內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial Cells，ECs），并具有修復(fù)內(nèi)皮損傷、促進(jìn)缺血組織血管再生的作用[1]。隨著我國人口老齡化及生活方式的變化，近年糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病率逐年升高。糖尿病血管相關(guān)性并發(fā)癥是糖尿病患者致殘甚至致死的主要原因，然而如何改善高糖環(huán)境下的血管損傷及血管新生障礙，目前已成為研究糖尿病血管病變的熱點。有研究顯示高糖環(huán)境下EPCs數(shù)量減少，生物學(xué)功能受損，導(dǎo)致其損傷修復(fù)及血管新生的功能下降[2]。目前黃芪甲苷（Astragaloside IV，AS-IV）被發(fā)現(xiàn)可提高體外培養(yǎng)EPCs數(shù)量，并改善人外周血EPCs增殖、黏附、遷移以及血管形成等生物學(xué)功能[3]。本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)AS-IV可改善正常情況下人EPCs的細(xì)胞活性及增殖功能[4]，但尚未對AS-IV干預(yù)下高糖受損的EPCs功能進(jìn)行確切研究。本實驗通過檢測不同濃度AS-IV干預(yù)高糖受損EPCs后的增殖功能，初步得到促高糖受損EPCs增殖作用的最佳AS-IV濃度，并進(jìn)一步探討最佳濃度AS-IV對高糖受損EPCs生物學(xué)功能的影響，為深入研究AS-IV在改善高糖受損人EPCs介導(dǎo)血管新生的機(jī)制及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?細(xì)胞?無菌條件下取湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院正常剖宮產(chǎn)胎盤臍帶血用于獲得臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞（均簽署知情同意書并獲我院倫理委員會同意）。

1.1.2?藥物?黃芪甲苷（上海吉至公司，貨號：110781-201813，純度98%）。

1.1.3?試劑與儀器?人淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物制品有限公司，貨號：LTS10771）;EGM-2培養(yǎng)基（Lonza公司，美國，貨號：cc-3162）;ECGS、胎牛血清（Hyclone公司，美國，貨號：SH30406.02）;血管內(nèi)皮生長因子（貨號：100-20）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（貨號：100-18B）、胰島素樣生長因子（貨號：100-11）均購自美國Peprotech公司;纖維連接蛋白（Sigma公司，美國，貨號：10838039001）;PBS液（Gibco公司，美國，貨號：10010023）;AntiCD31抗體（貨號：ab28364）、山羊抗兔IgG（H&L）（貨號：ab6717）均來自英國Abcam公司;DAPI溶液（北京中科瑞泰公司，貨號：C0065）;多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司，貨號：P1110）;FITC-UEA-I（貨號：FS1109-500UG）、Dil-ac-LDL（貨號：FS1088-500UG）均來自上海復(fù)申生物科技有限公司;CCK-8試劑盒（同仁化學(xué)研究所，日本，貨號：CK04）;Matrigel基底膜基質(zhì)膠（上海前塵公司，貨號：354230）;熒光顯微鏡（北京同舟同德公司，型號：Olympus-BX51）;酶聯(lián)免疫檢測儀（型號：熱電MK3酶標(biāo)儀）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號：3110系列水套CO2培養(yǎng)箱）均購自美國Thermofisher Scientific公司。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

1.2.1.1?EPCs的培養(yǎng)?取足月健康新生兒臍帶血密度梯度離心分離得到單個核細(xì)胞。將單個核細(xì)胞以1×105/cm2接種于纖維連接蛋白包被12.5 mL培養(yǎng)瓶中，應(yīng)用M199培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d;取貼壁細(xì)胞，半量換培養(yǎng)液，每2～3 d全量換液1次。繼續(xù)培養(yǎng)7 d;取貼壁細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞按1∶3進(jìn)行傳代。

1.2.1.2?EPCs的鑒定?CD31抗體聯(lián)合DAPI核染鑒定[5]：取生長狀態(tài)良好的P3代細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min;0.1MPBS洗3次×2 min，PBS浸洗后滴加山羊血清，室溫封閉30 min;加入Anti-CD31抗體并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。PBST浸洗后滴加山羊抗兔IgG（H&L）抗體，20～37 ℃濕盒孵育1 h;加入DAPI染核5 min;0.1 MPBS洗3次×2 min。50%甘油封片，顯微鏡下觀察熒光染色。FITC-UEA-I和Dil-ac-LDL雙熒光染色鑒定[6]：將P3代細(xì)胞接種于蓋玻片上使細(xì)胞爬片，加入Dil-ac-LDL（2.4 g/L）并于37 ℃避光孵育1 h，使用多聚甲醛（20 g/L）固定10 min，PBS浸洗后加入FITC-UEA-I（10 g/L）并于37 ℃避光孵育1 h，PBST沖洗，顯微鏡下觀察熒光染色。

1.2.1.3?實驗分組?將鑒定成功的人EPCs隨分為3等份，分別為正常組（NC組），實驗組（黃芪甲苷干預(yù)高糖培養(yǎng)組，HG+AS-IV組），對照組（高糖培養(yǎng)組，HG組）。

1.2.2?干預(yù)方法?正常組EPCs用無糖的EGM-2培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)120 h;實驗組及對照組EPCs在高糖條件為葡萄糖濃度30 mmol/L的EGM-2培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)120 h;實驗組用黃芪甲苷進(jìn)行干預(yù)，正常培養(yǎng)組及對照組用等容量的PBS液處理。

1.2.3?檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1?檢測不同濃度AS-IV干預(yù)高糖受損EPCs的增殖曲線?取高糖培養(yǎng)（葡萄糖濃度30 mmol/L）對數(shù)生長期EPCs，胰酶消化，終止后離心收集，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度（1×105/孔）于96孔板。置于溫箱（37 ℃、5% CO2）培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。取處于指數(shù)生長期的細(xì)胞接種到96孔板上，進(jìn)行CCK8檢測。在96孔板中配制100 μL的細(xì)胞懸液。培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）預(yù)培養(yǎng)24 h。向培養(yǎng)板加入0、25、50、100、200、400 mg/L AS-IV作用于EPCs。培養(yǎng)24 h后向每孔加入10 μL CCK8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

1.2.3.2?黃芪甲苷對高糖下EPCs生物學(xué)功能影響的研究?1）EPCs CCK8增殖檢測：取對數(shù)期EPCs，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分于96孔板，1×105/孔。置于37 ℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁。取處于指數(shù)生長期的細(xì)胞接種到96孔板上。板中配制100 μL的細(xì)胞懸液。在37 ℃，5% CO2的條件下預(yù)培養(yǎng)24 h。實驗組加入100 mg/L AS-IV進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，NC組及HG組加等量PBS液;3組細(xì)胞在培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μL CCK8溶液。在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。酶標(biāo)儀測定吸光度。避光保存在室溫條件下，設(shè)置對照孔，每組設(shè)3復(fù)孔。2）EPCs黏附能力檢測：用胰酶消化貼壁EPCs使細(xì)胞脫落，形成500 μL的細(xì)胞懸液并計數(shù)，然后將EPCs均勻分于24孔板并于37 ℃、5% CO2孵育培養(yǎng)1 h，實驗組用100 mg/L AS-IV進(jìn)行干預(yù)，NC組及HG組加等量PBS液;培養(yǎng)8 h后，將EPCs均勻接種在包被有大鼠纖維連接蛋白培養(yǎng)板并培養(yǎng)30 min，2個隨機(jī)200倍視野計數(shù)EPCs。3）EPCs遷移能力檢測：先用marker筆在6孔板背后每隔1 cm劃橫線一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。取對數(shù)生長期的EPCs，在孔中加入約5×105個細(xì)胞，預(yù)培養(yǎng)1 d后用無菌200 μL槍頭在培養(yǎng)孔底部中央劃一道痕跡，用用PBS洗去劃下的細(xì)胞。實驗組用含有100 mg/L AS-IV的無血清M199完全培養(yǎng)基，NC組及HG組用含等量PBS液的無血清M199完全培養(yǎng)基;在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇2個不同視野，分別測量0、24 h的劃痕創(chuàng)面愈合情況并拍照。細(xì)胞遷移能力用遷移率表示，細(xì)胞遷移率=（0 h劃痕的平均邊距-24 h劃痕的平均邊距）/0 h劃痕的平均邊距×100%。4）EPCs成管實驗：Matrigel基質(zhì)膠稀釋混勻后，以50 μL/孔加入提前預(yù)冷的12孔板。37 ℃孵箱放置30 min，當(dāng)EPCs細(xì)胞長到80%～90%時，胰酶消化，用含10%FBS

的DMEM重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105，每孔加入1 mL重懸液。待細(xì)胞貼壁后，實驗組用100 mg/LAS-IV進(jìn)行干預(yù)，NC組及HG組加等量PBS液;培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察并拍照。計算小管長度，并取平均值。

1.3?統(tǒng)計學(xué)方法?采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)中的計量資料進(jìn)行檢驗，本資料為完全隨機(jī)設(shè)計單變量計量資料的單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?AS-IV最佳作用濃度?通過不同濃度梯度AS-IV干預(yù)高糖受損的EPCs增殖24 h后的細(xì)胞OD值，并繪制成增殖曲線，初步得到AS-IV干預(yù)高糖受損EPCs最佳濃度為100 mg/L。見圖1。

2.2?EPCs的培養(yǎng)及鑒定?第7天培養(yǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)典型集落形態(tài)，中央細(xì)胞呈圓形，周邊細(xì)胞呈梭形。繼續(xù)培養(yǎng)至10 d，細(xì)胞形態(tài)以扁平的“鋪路石”樣為主。見圖2。對人內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行鑒定。細(xì)胞膜結(jié)合CD31免疫熒光抗體呈綠色，細(xì)胞攝取DAPI后核染呈藍(lán)色，融合圖像顯示膜染綠色熒光，核染藍(lán)色熒光。見圖3。同時細(xì)胞結(jié)合FITC-UEA-I呈綠色，細(xì)胞攝取Dil-ac-LDL呈紅色，二者雙染呈橙黃色改變的細(xì)胞即為正常分化的EPCs。見圖3～4。

2.3?黃芪甲苷對高糖受損下EPCs生物學(xué)功能影

響的研究?在AS-IV（100 mg/L）干預(yù)下的實驗組與對照組比較，細(xì)胞增殖的OD值增大，細(xì)胞黏附數(shù)增多，細(xì)胞遷移相對寬度降低（細(xì)胞遷移率升高），體外成管數(shù)增多，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P1<0.05）。實驗組與正常組比較，細(xì)胞增殖的OD值、細(xì)胞黏附數(shù)、細(xì)胞遷移相對寬度、體外成管數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P2>0.05）。見表1，圖5～8。

3?討論

發(fā)揮血管新生及形成作用的細(xì)胞主要有2個來源，一是源于已分化完全的內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的增殖和遷移，該過程被稱為血管生成;另一個則源于骨髓中EPCs動員至外周循壞中，進(jìn)而歸巢到損傷部位并參與初期內(nèi)皮的形成，這一過程被稱為血管形成。EPCs在人體出生后損傷血管修復(fù)和血管新生中發(fā)揮重要作用，尤其在缺血性病變的組織修復(fù)中，需要重建血運，離不開EPCs從骨髓中動員、遷移到病損部位發(fā)揮血管新生作用。Kang H等[7]發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境下的EPCs的生物學(xué)功能受損，并發(fā)現(xiàn)糖尿病患者循環(huán)系統(tǒng)中的EPCs數(shù)目減少、生物學(xué)功能減退。Fadini等[8]研究表明糖耐量受損患者的外周循環(huán)中的EPCs數(shù)量已經(jīng)開始減少，并發(fā)現(xiàn)EPCs的數(shù)量、生物學(xué)功能及促克隆形成能力的下降是導(dǎo)致2型糖尿病患者外周動脈疾病的重要因素之一。高糖環(huán)境下EPCs受損將直接影響損傷血管修復(fù)和血管新生，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者來源的EPCs的管狀形成能力明顯下降，并在實驗中發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基中的VEGF、SDF-1a、PIGF等促血管新生因子被下調(diào)，這可能是導(dǎo)致糖尿病患者血管修復(fù)及新成障礙的重要原因[9]。

黃芪用于臨床已有兩千多年歷史，《本草綱目》記載黃芪可“排膿止痛、活血生血、內(nèi)托陰疽、為瘡家圣藥”。黃芪內(nèi)的天然活性成分中以黃芪皂苷Ⅳ（別稱黃芪甲苷，AS-Ⅳ）最為重要。研究表明，高糖環(huán)境下產(chǎn)生的氧化應(yīng)激在內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷中起著至關(guān)重要的作用，且活性氧化物質(zhì)可能是糖尿病狀態(tài)下導(dǎo)致內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙的重要因素[3]。AS-Ⅳ具有明的抗顯氧化作用，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷時，黃芪甲苷在能起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷并修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用[10]。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)AS-IV可改善人外周血EPCs增殖、黏附、遷移和體外血管生成等生物學(xué)功能[11]。當(dāng)機(jī)體處于炎性反應(yīng)、創(chuàng)傷、缺氧等應(yīng)激狀態(tài)時，EPCs會隨著SDF-1等趨化因子梯度自骨髓遷移至外周循環(huán)中，進(jìn)而歸巢到損傷發(fā)揮其作用。國內(nèi)學(xué)者楊雷等[12]發(fā)現(xiàn)AS-IV可以顯著提升大鼠骨髓源性EPCs的生物學(xué)功能，減少EPCs的凋亡，并上調(diào)EPCs中SDF-1α和CXCR4的mRNA蛋白及p-CXCR4蛋白的水平?？梢夾S-IV可干預(yù)EPCs發(fā)揮血管新生的作用。

目前國內(nèi)外對黃芪甲苷聯(lián)合內(nèi)皮祖細(xì)胞促血管新生的研究主要是AS-IV干預(yù)正常EPCs而展開的研究，尚未對AS-IV干預(yù)高糖受損EPCs發(fā)揮血管新生作用進(jìn)行相關(guān)研究。本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)AS-IV能增強(qiáng)正常情況下人臍帶血EPCs活性并促進(jìn)EPCs增殖，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AS-IV能改善體外人EPCs增殖、黏附、遷移和成管功能生物學(xué)功能[4]。本研究是在前期研究基礎(chǔ)上，通過檢測不同濃度梯度的AS-IV對高糖受損人EPCs增殖的影響，發(fā)現(xiàn)100 mg/L的AS-IV干預(yù)下，高糖受損人EPCs增殖作用最明顯。且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AS-IV能顯著改善受損高糖受損人EPCs的增殖、黏附、遷移和成管等生物學(xué)功能，這與國內(nèi)學(xué)者陳軍等[13]通過不同濃度AS-IV（2、10、50 μg/mL）干預(yù)由3，4苯并芘導(dǎo)致的損傷人EPCs后，其增殖、黏附及遷移能力增強(qiáng)的實驗研究結(jié)果相吻合，但該研究的AS-IV濃度梯度范圍較小，并未發(fā)現(xiàn)AS-IV發(fā)揮作用的最佳濃度;且未對EPCs成管功能進(jìn)行檢測，實驗存在欠缺。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)100 mg/L AS-IV能顯著改善高糖受損EPCs的生物學(xué)功能，為深入探討黃芪甲苷通過高糖受損后的EPCs介導(dǎo)的促進(jìn)血管新生的作用機(jī)制奠定了堅實的基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開發(fā)以黃芪甲苷為主要成分的促糖尿病皮膚潰瘍血管新生的藥物制劑提供了實驗依據(jù)。

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（2020-02-19收稿?責(zé)任編輯：王明）