高譽(yù)珊 張鑫蕾 吳夢瑤 周璐 張淑靜 陳琳 王敏 孫燕 鄭豐杰 李宇航

摘要?目的：觀察大柴胡湯及其拆方（方劑要素）對(duì)非酒精性脂肪肝病（NAFLD）大鼠模型“肝-腸軸”肝、腸形態(tài)學(xué)的影響。方法：采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、鹽酸吡格列酮組、大柴胡湯組、疏肝利膽組、健脾化痰組、通腑泄?jié)峤M。采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)16周建立NAFLD模型，并于第13～16周分別給予大柴胡湯及拆方。造模結(jié)束后，取小腸組織，電鏡觀察細(xì)胞間緊密連接情況，采用HE染色、油紅O染色、Masson染色觀察各組大鼠肝組織。結(jié)果：模型組腸細(xì)胞間隙明顯增大，緊密連接程度降低，各給藥組細(xì)胞間隙均有不同程度地減小，以全方組最為顯著;正常組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，模型組大鼠部分肝細(xì)胞呈氣球樣變性，見不同程度脂滴形成，各給藥組較模型組脂滴情況均有不同程度減輕。結(jié)論：大柴胡湯及其拆方均能不同程度地改善NAFLD模型大鼠肝細(xì)胞脂肪變及腸細(xì)胞緊密連接情況，并以全方共用效果尤著，疏肝利膽、健脾化痰、通腑泄?jié)岬戎畏?lián)合運(yùn)用對(duì)改善NAFLD具有較好的療效。

關(guān)鍵詞?大柴胡湯;方劑要素;拆方研究;非酒精性脂肪性肝病;肝-腸軸;形態(tài)學(xué);電鏡;油紅O染色

Abstract?Objective：To observe the effect of Dachaihu Decoction（DD）and its decomposition（formula-factors）on liver and intestine morphology of non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）model rats.Methods：Rats were divided into a normal group，a model group，a pioglitazone hydrochloride group，a DD group，a Shugan Lidan group，a Jianpi huatan group and a Tongfu Xiezhuo group by random number table.NAFLD model was established by feeding high-fat and high-sugar diet for 16 weeks，and DD and decomposition were given at 13-16 weeks respectively.After modeling，small intestinal tissues were taken and tight junctions between cells were observed by electron microscopy.Liver tissues of rats in each group were observed by HE，oil red O and Masson staining.Results：The intestinal intercellular space of the model group increased significantly and the degree of tight junction decreased，the intercellular space of each drug group decreased，especially in the DD group.The structure of hepatocytes in the normal group was normal，some hepatocytes in the model group showed balloon-like degeneration，and lipid droplets were formed in varying degrees.The lipid droplets in each drug group were alleviated to compare with the model group.Conclusion：DD and its decomposition can improve the fatty degeneration of hepatocytes and the tight junctions of intestinal cells in NAFLD model rats to varying degrees，and the effect of all prescriptions is particularly effective.The combined use of treatments such as soothing the liver and promoting gallbladder，invigorating the spleen and removing phlegm，and clearing the fu organs can improve NAFLD with good effect.

Keywords?Dachaihu Decoction; Formula-factors; Research on decomposition; Non-alcoholic fatty liver disease; Liver-intestinal axis; Morphology; Electron microscope; Oil red O staining

中圖分類號(hào)：R289.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.21.012

非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是指除外酒精和其他明確損肝因素所導(dǎo)致的以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，是與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷。目前臨床主要推薦使用吡格列酮等胰島素增敏劑進(jìn)行治療[1]。近年來隨著“肝-腸軸”概念的提出，肝病的發(fā)生與腸黏膜屏障的關(guān)系逐漸受到關(guān)注。研究表明，腸黏膜屏障功能受損，致使腸黏膜通透性改變，會(huì)導(dǎo)致腸道內(nèi)細(xì)菌及其產(chǎn)物（如內(nèi)毒素等）移位至腸外的肝組織，引起其免疫系統(tǒng)異?；罨脱仔苑磻?yīng)，從而誘導(dǎo)NAFLD的發(fā)生發(fā)展[2-3]。

中醫(yī)學(xué)根據(jù)NAFLD“脾失健運(yùn)、肝失疏泄、痰濁內(nèi)生、濕熱內(nèi)蘊(yùn)、瘀血阻滯”的主要病機(jī)，采用調(diào)理肝脾、祛痰化瘀、利濕泄?jié)岬戎畏ㄟM(jìn)行治療，取得較好療效[4-10]。然而，針對(duì)NAFLD所使用的中醫(yī)復(fù)方中，藥物之間的作用較為復(fù)雜，方劑要素的作用靶點(diǎn)及不同方劑要素間發(fā)生協(xié)同作用的機(jī)制仍未明確。為此，本實(shí)驗(yàn)選取大柴胡湯及其拆方（方劑要素）為主要干預(yù)手段，以NAFLD大鼠模型為干預(yù)對(duì)象，主要從腸、肝的形態(tài)學(xué)角度對(duì)具有疏肝利膽、健脾化痰、通腑泄?jié)嶂У拇蟛窈鷾捌洳鸱阶饔眯ЧM(jìn)行探討，以期為中醫(yī)臨床治療NAFLD時(shí)更為明確地選擇相應(yīng)治法提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠105只，體質(zhì)量（180±20）g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002。大鼠于SPF級(jí)動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)，室溫為22 ℃，濕度為50%。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d以后開始造模，整過程自由進(jìn)食、飲水。

1.1.2?藥物

中藥材購自北京同仁堂醫(yī)藥藥材有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定研究室鑒定;鹽酸吡格列酮片購于京東大藥房（中美華東制藥，產(chǎn)品批號(hào)：170102）。

1.1.3?試劑與儀器?蘇木素（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1140-500）;伊紅（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1100-500）;無水乙醇（北京化工廠，貨號(hào)：BH100535）;0.9%生理鹽水（雙鶴藥業(yè)，貨號(hào)：PB30164）;二甲苯（北京化工廠，貨號(hào)：1929462024）;中性樹膠（北化試劑，貨號(hào)：N861409）;飽和油紅O染液（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1260-100）。移液器[Eppendorf艾本德（中國），型號(hào)：Reference];電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號(hào)：AL204];生物組織包埋機(jī)（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號(hào)：YD-6L）;電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司，型號(hào)：DH-1000）;電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海-恒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：PH-101A）;珊頓全自動(dòng)切片機(jī)[Thermo賽默飛（中國），型號(hào)：HM-325];照相顯微鏡[Olympus奧林巴斯（中國），型號(hào)：BX53]。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

根據(jù)以往研究提出的“方-證要素對(duì)應(yīng)”組方規(guī)律[11]，將大柴胡湯按照所對(duì)應(yīng)的“證候要素”，拆方分成以下3個(gè)“方劑要素”，即與“肝膽疏泄失職”證候要素相對(duì)應(yīng)的疏肝利膽藥組，其方劑要素為柴胡、黃芩、芍藥;與“脾虛痰濕中阻”證候要素相對(duì)應(yīng)的健脾化痰藥組，其方劑要素為半夏、生姜、大棗;與“大腸濁熱”證候要素相對(duì)應(yīng)的通腑泄?jié)崴幗M，其方劑要素為大黃、枳實(shí)。

按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組、模型組、鹽酸吡格列酮組、疏肝利膽組、健脾化痰組、通腑泄?jié)峤M、大柴胡湯組7組，每組15只，于SPF級(jí)動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)。

根據(jù)文獻(xiàn)[9]及預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，選定高脂高糖飼料配方為：52.5%維持飼料+30%蔗糖+10%豬油+2%膽固醇+5%蛋黃粉+0.5%膽酸鈉。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，正常組予以維持飼料喂養(yǎng)，其余組均予以高脂高糖飼料自由采食16周，以期建立NAFLD模型。造模結(jié)果判定：采用美國國立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)絡(luò)病理工作委員會(huì)2005年制定的指南（表1），進(jìn)行NAFLD活動(dòng)度積分（NAFLD Activity Score，NAS）評(píng)分，其中NAS>5分者明確診斷為非酒精性脂肪性肝炎（NASH），NAS<3分可排除NASH。

1.2.2?干預(yù)方法

鹽酸吡格列酮片參照文獻(xiàn)[10]予以10 mg/（kg·d）制成懸濁劑。大柴胡湯（柴胡15 g、黃芩9 g、白芍9 g、法半夏9 g、生姜15 g、大棗12 g、生大黃6 g、燙枳實(shí)9 g）劑量參照《方劑學(xué)》教材[12]，并按照體表面積法換算求得大鼠單位體質(zhì)量生藥量8.64 g/kg[13]：疏肝利膽組（柴胡15 g、黃芩9 g、白芍9 g）3.39 g/kg;健脾化痰組（法半夏9 g、生姜15 g、大棗12 g）3.70 g/kg;通腑泄?jié)峤M（生大黃6 g、燙枳實(shí)9 g）1.54 g/kg。第13～16周，分別給予各實(shí)驗(yàn)組大鼠相應(yīng)藥液灌胃，3 mL/只，1次/d，正常組、模型組同時(shí)予以等量蒸餾水。

1.2.3?檢測指標(biāo)與方法

第16周末次灌胃后，禁食12 h后取材，稱量肝臟濕重。取肝組織及腸組織進(jìn)行冰凍切片、石蠟切片及超薄切片。使用石蠟切片進(jìn)行HE染色及Masson染色，冰凍切片進(jìn)行油紅O染色，超薄切片觀察腸組織細(xì)胞間隙情況。其中，肝臟脂滴空泡狀面積率的計(jì)算使用圖像處理軟件Image pro plus 6.0（Media Cybernetics，美國）對(duì)各組油紅O染色的肝臟脂滴空泡狀面積率進(jìn)行計(jì)算，公式為：肝臟脂滴空泡狀面積率=100×脂滴空泡狀面積/圖片總面積，噪聲點(diǎn)的過濾閾值為200，以3×3的像素進(jìn)行面積計(jì)算，H：0～20[14]。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用IBM SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組間的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組腸組織細(xì)胞間隙的寬度與肝臟脂滴空泡狀面積率數(shù)據(jù)等計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?大體觀察

正常組大鼠肝臟外觀形態(tài)正常，呈紅褐色，表面光滑有光澤，邊緣銳利、質(zhì)地韌;模型組大鼠肝臟體積明顯增大，呈黃褐色，表面粗糙，包膜緊張，邊緣變鈍，質(zhì)地較軟，切面有油膩感;鹽酸吡格列酮組大鼠肝臟呈紅黃相間，邊緣較銳利，質(zhì)地偏軟;疏肝利膽組、健脾化痰組、通腑泄?jié)峤M及大柴胡湯組大鼠肝臟呈淺黃色，表面較模型組細(xì)膩，稍有包膜緊張，邊緣稍鈍，質(zhì)地偏軟。

2.2?光鏡觀察

2.2.1?肝組織HE染色

如圖1所示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰，匯管區(qū)界線清楚，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀分布，肝竇清晰可見;模型組大鼠肝細(xì)胞腫脹，部分細(xì)胞呈氣球樣變，細(xì)胞核被擠向一邊，多數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不等、數(shù)量不一的脂滴空泡，肝索排列紊亂;鹽酸吡格列酮組大鼠呈輕度脂肪變，部分細(xì)胞內(nèi)可見細(xì)小脂滴空泡，肝索排列較亂;疏肝利膽組、健脾化痰組、通腑泄?jié)峤M大鼠肝組織均可見不同程度彌漫性肝細(xì)胞脂肪變，但脂肪變程度較模型組呈不同程度減少;大柴胡湯組大鼠肝細(xì)胞彌漫性脂肪變較模型組顯著改善，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，遠(yuǎn)離中央靜脈細(xì)胞可見小泡型脂滴空泡，肝索排列紊亂。

2.2.2?肝組織油紅O染色

如圖2所示，正常組大鼠肝組織中無染色脂滴;模型組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴呈彌漫性、顆粒狀堆積，融合成片狀;鹽酸吡格列酮組、疏肝利膽組、健脾化痰組、通腑泄?jié)峤M、大柴胡湯組大鼠肝細(xì)胞脂滴數(shù)量均較明顯減少，較為稀疏，脂滴體積相對(duì)較小，呈小顆粒狀不均勻分布。表2為肝臟脂滴空泡狀面積率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。結(jié)果顯示全方組效果呈優(yōu)于其余拆方組的趨勢。

2.2.3?肝組織Masson染色

如圖3所示，各組大鼠肝組織均未出現(xiàn)增多膠原纖維分布，即未形成肝纖維化。

2.2.4?電鏡觀察

腸細(xì)胞緊密連接情況如圖4所示，模型組較正常組腸細(xì)胞間隙擴(kuò)大，給藥組腸細(xì)胞間隙見不同程度減小。每組隨機(jī)取15處腸間隙，測量該間隙最大值。見表3?？梢娔Ｐ徒M與其余各組比較，腸細(xì)胞間隙明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;大柴胡湯組與除疏肝利膽組外各組比較，腸細(xì)胞間隙減小顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3?討論

3.1?造模情況分析

NAFLD動(dòng)物模型大致可分為3類：營養(yǎng)型脂肪肝模型、藥物中毒型脂肪肝模型和特殊種系動(dòng)物的先天性遺傳性脂肪肝模型[15]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M臨床NAFLD常見病因，采用東方人群尤其是中國人多見的高脂高糖飲食喂養(yǎng)SD雄性大鼠建立營養(yǎng)型NAFLD大鼠模型。根據(jù)NAFLD活動(dòng)度積分（NAS）評(píng)分，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M病理評(píng)分NAS=4分，說明本實(shí)驗(yàn)通過高脂高糖飼料喂養(yǎng)建立的大鼠模型已明確達(dá)到非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic Fatty Liver，NAFL）階段，為向非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis，NASH）進(jìn)展階段，證明NAFLD模型建立成功。

3.2?大柴胡湯及其拆方對(duì)NAFLD療效分析

腸黏膜屏障主要由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障、生物屏障等組成[16-17]。其中，機(jī)械屏障由腸道黏膜上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞間緊密連接和黏液凝膠層等構(gòu)成[18]。最直接、最準(zhǔn)確評(píng)價(jià)腸黏膜屏障功能的量化指標(biāo)是腸黏膜通透性，腸黏膜通透性取決于腸黏膜上皮細(xì)胞是否受到損傷以及細(xì)胞間緊密連接是否完整。研究表明，肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）是細(xì)胞收縮的關(guān)鍵酶，可使肌球蛋白輕鏈磷酸化（MLC），促使肌動(dòng)蛋白收縮，破壞細(xì)胞間的緊密連接蛋白，使細(xì)胞骨架收縮，進(jìn)而使腸上皮通透性增加，腸黏膜機(jī)械屏障遭到破壞，致使NAFLD的病情進(jìn)一步發(fā)展[19]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，藥物及其有效成分可提高緊密連接蛋白的表達(dá)[20-24]，從而減小腸細(xì)胞間隙，降低腸黏膜通透性，保護(hù)腸黏膜屏障。

中醫(yī)學(xué)依據(jù)NAFLD患者臨床所見乏力、消化不良、肝區(qū)隱痛、肝脾大以及肥胖、空腹血糖增高、血脂代謝紊亂、高血壓等代謝綜合征相關(guān)表現(xiàn)，認(rèn)為其病機(jī)主要為肝脾不和、痰瘀互阻、濕熱內(nèi)蘊(yùn)。大柴胡湯為《傷寒雜病論》經(jīng)典名方，全方由“柴胡半斤，黃芩三兩，半夏半升，枳實(shí)四枚，芍藥三兩，大黃二兩，生姜五兩，大棗十二枚”組成，見于《傷寒論》103條：“嘔不止，心下急，郁郁微煩者，為未解也，與大柴胡湯下之則愈”;136條：“傷寒十余日，熱結(jié)在里，復(fù)往來寒熱者，與大柴胡湯”;165條：“傷寒發(fā)熱，汗出不解，心中痞硬，嘔吐而下利者，大柴胡湯主之”及《金匱要略·腹?jié)M寒疝宿食病脈證并治》第12條：“按之心下滿痛者，此為實(shí)也，當(dāng)下之，宜大柴胡湯”。其主治癥狀與NAFLD的臨床表現(xiàn)頗為相似。對(duì)其組方進(jìn)行分析：“柴胡配黃芩除少陽之邪;大黃配枳實(shí)以泄陽明熱結(jié);芍藥清膽，緩急止痛，與大黃相配，可治腹中實(shí)痛，與枳實(shí)相伍，可以理氣和血;半夏與生姜配，治嘔逆不止。大棗與生姜配，能和營衛(wèi)而行津液，并調(diào)和諸藥”[25]，可見全方以柴胡、黃芩、白芍調(diào)肝，半夏、生姜、大棗理脾，大黃、枳實(shí)通腑泄?jié)?、行氣活血、清熱化濕，故可針?duì)NAFLD核心病機(jī)起到良好的治療作用。

本實(shí)驗(yàn)中，正常組大鼠腸細(xì)胞間可見細(xì)胞連接復(fù)合體，且緊密連接結(jié)構(gòu)較長;造模后細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)局部出現(xiàn)異常，有些橋粒張力微絲稀疏，某些連接處出現(xiàn)空泡，可見造模導(dǎo)致腸黏膜屏障受損;各給藥組大鼠腸細(xì)胞間隙減小，說明各藥物均能在一定程度上減小腸黏膜間隙，且以大柴胡湯全方明顯優(yōu)于其拆方;肝細(xì)胞染色及相關(guān)數(shù)據(jù)亦清晰表明，用藥后肝內(nèi)脂滴數(shù)量有所減少，且全方組優(yōu)于各拆方組。分析其原因如下：NAFLD一病，以患者平素飲食無度為主要病因，肥甘厚膩之品助濕生痰，困阻脾胃，土壅木郁，則肝膽疏泄不利，氣機(jī)郁滯，血行不暢，久郁化熱，形成濕熱內(nèi)蘊(yùn)、痰瘀互結(jié)之證。大柴胡湯一方，以柴胡、黃芩為君藥，疏利肝膽，清少陽之邪，以大黃、枳實(shí)為臣藥，通腑泄?jié)?，泄陽明熱結(jié);芍藥柔肝緩急止痛，理氣和血;半夏、生姜相配，消痞散結(jié)，和胃止嘔;大棗、生姜相伍，健脾和胃，調(diào)和諸藥。全方以疏肝利膽為核心，故單用健脾化痰之半夏、生姜、大棗或通腑泄?jié)嶂簏S、枳實(shí)，效果不如疏肝利膽之柴胡、黃芩、白芍;同時(shí)，全方合用，君藥之疏肝利膽配以臣藥之通腑泄?jié)峒白羰怪∑⒒?，效果更佳?？梢?，針?duì)NAFLD一病，大柴胡湯方藥的君臣佐使之配伍亦不可忽視。

綜上所述，大柴胡湯及其拆方能減輕NAFLD模型大鼠腸黏膜屏障損傷，降低腸黏膜通透性，保護(hù)小腸黏膜及其屏障功能，同時(shí)亦能減輕NAFLD模型大鼠肝細(xì)胞脂肪變程度。大柴胡湯全方在調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝、保護(hù)腸道黏膜屏障方面作用優(yōu)于單純“疏肝利膽”“健脾化痰”“通腑泄?jié)帷钡纫?，說明3個(gè)方劑要素配伍具有協(xié)同作用，全方總效應(yīng)大于各要素單獨(dú)之效應(yīng)。大柴胡湯對(duì)NAFLD模型大鼠“肝-腸軸”形態(tài)學(xué)的影響，體現(xiàn)出其“肝腸同治”配伍組方的合理性和有效性。

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（2019-07-03收稿?責(zé)任編輯：楊覺雄）