洪 宏，袁建芬，喻海忠

（南通市中醫(yī)院檢驗科,江蘇南通 226001）

近年來，乳腺癌的發(fā)病率及死亡率逐年增高，嚴重威脅女性的身心健康[1]。目前，臨床上常用的腫瘤標志物CA153特異度和靈敏度均不高，容易出現(xiàn)誤診及漏診,且單項腫瘤標志物的檢測在輔助診斷中有一定的局限性[2]。長鏈非編碼RNA-ATB (long non-coding RNA-ATB，lncRNA-ATB) 在多種惡性腫瘤組織或血清中異常表達，但在乳腺癌外周血表達水平的研究較少，且表達情況較傳統(tǒng)標記物CA153對乳腺癌的診斷價值也未見報道。本研究旨在對研究對象血清中l(wèi)ncRNA-ATB表達水平進行檢測，并探討聯(lián)合檢測CA153模式在乳腺癌診斷中的價值，現(xiàn)詳細報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2017年6月～2019年9月期間收治的乳腺癌患者37例，同期乳腺良性疾病患者30例及健康體檢者26例作為研究對象。乳腺癌組納入標準：病理檢查確診為乳腺癌，排除曾進行化療或放療、肝腎功能異常、過敏者等，年齡38～79歲，平均年齡51.2歲。乳腺良性疾病組為同期收治患者，年齡46～72歲，平均年齡53.2歲。另健康組為女性體檢者，均無肝腎、心血管及乳腺等疾病，年齡43～76歲，平均年齡52.4歲。各組在年齡、性別上差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 試劑和儀器 Trizol（Invitrogen 美國），TakaRa PrimeScript RT reagent kit，SYBR Premi ExTaq kit（大連寶生物工程有限公司），lncRNAATB及內(nèi)參引物（上海生工生物工程有限公司）。Cobas z 480實時熒光定量PCR儀(Roche 瑞士)，Cobas e 411電化學發(fā)光儀(Roche 瑞士)，CA153試劑及質(zhì)控品均為原裝配套試劑。

1.3 方法 術(shù)前空腹抽取靜脈血3 ml，1 h內(nèi)于4 ℃條件下，以12 000 g離心力離心10 min分離血清，用Trizol法提取血清中的總RNA。分光光度儀A260nm/280nm檢測吸光度，1.8～2.2 合格，進行下一步逆轉(zhuǎn)錄反應，按照TakaRa PrimeScript RT reagent kit試劑盒說明書操作，生成的cDNA置于-70 ℃保存。采用實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測血清lncRNA-ATB及內(nèi)參基因GAPDH表達水平。lncRNA-ATB上游引物：5’-TACAACCACTGCACTACCTG-3’，下游引物：5’-TGGAATGCTTGAAGGCTGCT-3’；GAPDH上游引物：5’-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3’，下游引物：5’-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3’ 反應體系為：cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl，SYBR 10 μl，H2O 6 μl，共20 μl；反應條件為：95 ℃預變性2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 25 s，40個循環(huán)，溶解曲線1個循環(huán)。用2-△△Ct表示lncRNA-ATB的相對表達含量。用羅氏Cobas e 411型電化學發(fā)光儀檢測CA153。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，首先用Kolmogorov-SmirnovZ檢驗進行正態(tài)性檢驗，呈非正態(tài)分布，用M(P25，P75)表示。多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，兩組間比較采用非參數(shù)Mann-WhineyU檢驗。聯(lián)合診斷采用二元Logistic回歸分析，受試者工作特征曲線(ROC曲線)下面積(AUC)，靈敏度和特異度評價指標的診斷價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組lncRNA-ATB相對表達水平比較 1ncRNAATB在乳腺癌組[1.82(1.19，3.74)]、乳腺良性疾病組[1.13(0.92，1.31)]和健康對照組[0.98(0.83，1.14)]血清中的表達水平差異有統(tǒng)計學意義(H=29.45，P＜0.01)。乳腺癌組血清lncRNA-ATB表達水平明顯高于乳腺良性病組(U=233，P＜0.01)和健康對照組(U=131，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。

2.2 血清CA153含量和lncRNA-ATB相對表達量單獨與聯(lián)合檢測對乳腺癌的診斷價值 見圖1。結(jié)果顯示，lncRNA-ATB靈敏度為89.2%，特異度為67.9%，AUC為0.824（95%CI：0.735～0.914，P＜0.01），其臨床診斷臨界值（cutoff value≤1.104），而CA153靈敏度僅為67.6%，特異度為91.1%，AUC為0.809（95%CI：0.712～0.906，P＜0.01）。再以lncRNA-ATB，CA153為自變量，建立Logistic回歸模型，通過模型中的概率值來擬合聯(lián)合檢測的ROC曲線，CA153和lncRNA-ATB聯(lián)合檢測的靈敏度提高至83.8%，特異度為80.4%，AUC為0.876（95%CI：0.800～0.953，P＜0.01）。

3 討論

lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的RNA分子，能通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控等方面影響相關(guān)基因的表達，參與染色體修飾、基因沉默、轉(zhuǎn)錄激活等，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，其表達異常影響著腫瘤細胞的生物學行為[3-4]。由于不具有編碼蛋白質(zhì)的潛能，曾被認為是無用RNA或轉(zhuǎn)錄噪聲[5]。lncRNA-ATB全稱lncRNA actived by TGF-β,長度約為2.4kb,位于人類第14號染色體上，是首個被發(fā)現(xiàn)的能被轉(zhuǎn)化生長因子激活的長鏈非編碼RNA[6]。lncRNA-ATB在多種腫瘤中異常表達，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵調(diào)控分子[7-9]。lncRNAATB在曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌患者組織中及SKBR-3細胞系中呈高表達，其機制為lncRNA-ATB通過ceRNA結(jié)合miR-200c上調(diào)ZEB1和ZNF127的表達，高表達的ZEB1/ZNF127促進腫瘤細胞發(fā)生EMT和對曲妥珠單抗的耐藥，下調(diào)lncRNA-ATB可以顯著抑制SKBR-3細胞的生長,同時可促進曲妥珠單抗耐藥的SKBR-3細胞凋亡[10]。

本研究顯示，乳腺癌患者血清中l(wèi)ncRNA-ATB表達水平顯著高于乳腺良性疾病者和體檢健康者，提示lncRNA-ATB可能扮演著癌基因的角色，檢測乳腺癌患者血液中的循環(huán)核酸，lncRNA-ATB可能為乳腺癌輔助診斷的一個潛在的分子標志物。ROC曲線顯示，以lncRNA-ATB相對表達的臨床診斷臨界值（cutoff value≤1.104）用于診斷乳腺癌的靈敏度為89.2%，特異度為67.9%，AUC為0.824，與傳統(tǒng)標志物CA153的靈敏度僅為67.6%，特異度為91.1%，AUC為0.809相比，靈敏度有提高，特異度略低，但診斷價值較高。進一步通過建立Logistic回歸模型，模型中的概率值來擬合聯(lián)合檢測的ROC曲線顯示，聯(lián)合檢測的靈敏度提高至83.8%，特異度為80.4%，AUC為0.876。聯(lián)合檢測診斷乳腺癌的效能優(yōu)于單獨檢測，聯(lián)合診斷可提高診斷的準確性，但要注意假陽性問題。

綜上所述，lncRNA-ATB在乳腺癌患者血清中呈現(xiàn)高表達，在乳腺癌診斷中敏感度高，與傳統(tǒng)標志物CA153聯(lián)合檢測彌補了單一指標檢測的不足，可考慮為乳腺癌輔助診斷的一種潛在生物學標志物用于臨床，以減少漏診。不足之處在于本研究納入的病例數(shù)有限，診斷價值仍需大樣本進一步驗證，缺少對乳腺癌術(shù)前、術(shù)后的比較、與臨床病理特征的相關(guān)性及治療療效的觀察等方面的研究，在后續(xù)工作中將通過隨訪、功能研究等進一步驗證lncRNA-ATB的臨床應用價值。