周 坤，高溫杰，李 宏

組織氧供減少或不能充分利用氧，導(dǎo)致組織代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)異常變化的病理過程稱為缺氧。當(dāng)健康人進(jìn)入高海拔或其他低氧環(huán)境時(shí)，時(shí)常發(fā)生缺氧[1,2]。不能迅速適應(yīng)缺氧會(huì)導(dǎo)致肺水腫、心腦血管功能障礙，甚至死亡[1,3-5]。肺的炎性反應(yīng)被認(rèn)為是缺氧肺損傷主要的病理生理機(jī)制之一。而H1受體介導(dǎo)的炎性反應(yīng)被認(rèn)為參與肺損傷的形成過程[6-8]，其機(jī)制可能為激活的H1受體能加速生成活性氧簇，并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞及多種炎性因子的聚集[9]。富馬酸氯馬斯汀(clemastine fumarate, CLE)作為H1受體拮抗藥已被證實(shí)在肺缺血再灌注損傷后可抑制多種炎性介質(zhì)的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，起到肺保護(hù)作用。但其在急性高原缺氧肺損傷中能否發(fā)揮同樣的作用目前仍沒有確切證據(jù)。因此，本實(shí)驗(yàn)擬將CLE用于大鼠急性高原肺損傷模型，以探討CLE對(duì)該模型的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 富馬酸氯馬斯汀注射液購(gòu)自華潤(rùn)雙鶴利民藥業(yè)(濟(jì)南)有限公司；地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司)；蘇木精-依紅染色試劑盒、Western配膠試劑盒、DAB濃縮試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；TRIzon總RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司)；山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗、IL-1β抗體、TNF-α抗體、TLR4抗體、NF-κB抗體(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司)；PCR引物序列由生工生物工程公司合成。NanoPhotometer-NP80超微量紫外分光光度計(jì)(德國(guó)implen公司)；ABI 7500 RT-PCR 儀(美國(guó)ABI 公司)；DS850-I動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙(山東濰坊華信氧業(yè)有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備 無(wú)特定病原體級(jí)8周齡雄性SD大鼠40只，單只體重200～220 g，由中國(guó)食品藥品檢定研究所提供，合格證號(hào)為SCXK(京)2017-0005。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將無(wú)特定病原體級(jí)8周齡雄性SD大鼠分為對(duì)照組(C組)、缺氧組(HH組)、地米組(DXM組)、治療組(CLE組)，每組10只。將HH組、DXM組、CLE組放入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙，設(shè)定海拔為7000 m、氧濃度為10%，DXM組從入艙前1 h開始以每6 h肌內(nèi)注射2 mg/kg DXM，CLE組入艙前2 h按0.9 mg/kg肌內(nèi)注射CLE，入艙10 h后追加一次用藥，劑量仍為0.9 mg/kg，完成造模。對(duì)照組不進(jìn)行任何干預(yù)。造模結(jié)束后立即處死大鼠，觀察肺組織大體情況，而后取肺組織留用。本研究已通過武警特色醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)審批。

1.3 肺濕/干重比測(cè)定 取右肺上葉，0.9%氯化鈉注射液沖洗后用濾紙吸去組織表面液體，稱重3次后取平均值即為濕重，隨后放入65 ℃恒溫烘箱中烘干48 h后稱重3次，取平均值即為干重，計(jì)算肺濕/干重比。

1.4 蘇木精-伊紅(HE)染色 取右肺下葉，4%多聚甲醛固定48 h。經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋后5 μm厚度切片，進(jìn)行HE染色并在光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.5 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 取100 mg肺組織，用Trizon提取細(xì)胞中的總RNA, 超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度，將RNA濃度標(biāo)定為1000～2000 ng/μl，A260/A280標(biāo)定在1.8～2.0，A260/A230>2；根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板,進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件:95 ℃條件下預(yù)變性10 min,然后95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸32 s,共計(jì)40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，以2-ΔΔCt來表示mRNA相對(duì)表達(dá)量。各引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot，WB) 在1 ml RIPA組織細(xì)胞裂解液中分別加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑各1 μl，取適量肺組織，提取總蛋白，用Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度并定量。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白，以80 V恒壓電泳45 min至上層膠結(jié)束后繼續(xù)以120 V恒壓電泳至下層膠結(jié)束。4 ℃層析冷柜中90 V恒壓下轉(zhuǎn)膜60 min，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。PVDF膜于3%脫脂奶粉中封閉3 h。漂洗后加一抗(β-actin 1∶1 000、IL-1β 1∶300、TNF-α 1∶500、TLR4 1∶500、NF-κB 1∶500)4 ℃條件下孵育過夜。TBST再次漂洗后室溫下加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)孵育2.5 h，漂洗后顯影。用Image Lab軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織濕/干重比結(jié)果比較 HH組大鼠肺組織濕/干重比明顯高于其余3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DXM組和CLE組大鼠肺組織濕干比比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 四組大鼠肺組織濕/干重比結(jié)果比較(n=10)

2.2 各組大鼠肺組織病理學(xué)改變 肺組織大體標(biāo)本觀察：C組大鼠肺組織表面光滑、完整；HH組大鼠肺組織可見水腫明顯，表面可見散在點(diǎn)、片狀出血灶：DXM組和CLE組大鼠肺組織標(biāo)本可見輕微水腫，表面偶見點(diǎn)狀出血灶。肺組織HE染色后觀察：C組肺組織無(wú)明顯病理改變；HH組肺組織可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血明顯，肺泡間隔增厚，肺泡結(jié)構(gòu)破壞無(wú)序、不張、融合、塌陷；DXM組和CLE組損傷程度較HH組輕(圖2)。

圖2 四組大鼠肺組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較(HE,×400)

2.3 IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)的比較 與C組相比，HH組中IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平均明顯升高(均P<0.05)。與HH組相比，DXM組和CLE組中IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB 的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低(均P<0.05，表2)。

表2 四組大鼠肺組織IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)量比較

2.4 IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB 蛋白表達(dá)的比較 與C組相比，HH組中IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB 蛋白表達(dá)水平均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HH組相比，DXM組和CLE組中IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB 蛋白表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3，表3)。

圖3 四組大鼠肺組織中IL-1β、TNF-α、

表3 四組大鼠肺組織IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB 蛋白表達(dá)量比較

3 討 論

本研究使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物艙模擬大鼠在7000 m海拔環(huán)境下機(jī)體缺氧狀態(tài)24 h后，肺組織W/D較C組明顯升高，病理學(xué)較C組發(fā)生明顯損傷性改變，提示造模成功。本研究根據(jù)CLE使用說明書所提供藥物使用劑量及血藥濃度達(dá)峰時(shí)間，按照體表面積進(jìn)行換算后，確定CLE的給藥劑量。本研究結(jié)果表明，給與CLE后，大鼠肺組織W/D較HH組明顯降低，肺組織病理?yè)p傷較HH組明顯減輕，缺氧引起的細(xì)胞通路蛋白及炎性因子的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低，提示CLE可減輕高原缺氧引起的肺損傷。而文獻(xiàn)[10]表明DXM是迄今為止預(yù)防和治療高原缺氧肺損傷炎性反應(yīng)最常用的藥物，本研究發(fā)現(xiàn)，DLE的治療作用與DXM相當(dāng)。

根據(jù)高原缺氧肺損傷的經(jīng)典病理生理學(xué)理論，急性缺氧引起肺部血管收縮，導(dǎo)致肺部血液重新流入收縮較小的血管(即導(dǎo)致“應(yīng)力衰竭”)和肺泡-毛細(xì)血管屏障的物理破壞。同時(shí)，缺氧可以通過激活肺泡巨噬細(xì)胞中的TLR4信號(hào)通路來加劇肺損傷的炎癥反應(yīng)，并在肺損傷的發(fā)展過程中進(jìn)一步破壞肺泡-毛細(xì)血管屏障[11]。

TLR4是一種跨膜蛋白，主要分布于單核巨噬細(xì)胞表面，屬于膜識(shí)別受體家族，活化后可介導(dǎo)并參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)炎性細(xì)胞出現(xiàn)相關(guān)免疫應(yīng)答，是參與免疫應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[12]。TLR4在橋接缺氧和炎癥之間的相互作用中起著至關(guān)重要的作用[11]。NF-κB作為TLR4通路下游的分子，是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可特異性結(jié)合多種基因啟動(dòng)子中的κB位點(diǎn)，調(diào)控免疫應(yīng)答及多種炎性介質(zhì)基因的表達(dá)[13]。NF-κB在生理狀態(tài)下與其抑制蛋白IκB結(jié)合以無(wú)活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中[14，15]，當(dāng)TLR4被激活后，使IκB激酶激活，促使激活的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核并激活炎癥信號(hào)通路，引起TNF-α、IL-1β等多種炎性因子表達(dá)[14]，啟動(dòng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。也有研究報(bào)道TLR4通過髓樣分化應(yīng)答基因依賴性通路的激活最終誘導(dǎo)NF-κB活化產(chǎn)生TNF-α、IL-1β等促炎因子加重肺損傷[16]。另有研究表明，NF-κB還可作為缺氧應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子[17]直接調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞反應(yīng)繼而參與肺損傷過程[18]。因此，TLR4/NF-κB通路作為組織缺氧和急性肺損傷的中央環(huán)節(jié)，在缺氧肺損傷后的炎癥發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。本研究結(jié)果也提示，HH組肺組織中IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平較C組明顯升高。

H1受體是組胺受體的一種亞型，在支氣管平滑肌和肺內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)。H1受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，其激活可通過Gαq/11和Gβγ亞基介導(dǎo)NF-κB活化，同時(shí)，還可通過上調(diào)TLR4的表達(dá)活化NF-κB[19，20]。CLE作為新型二代抗組胺藥已廣泛用于臨床。本研究試圖通過已知機(jī)制，來論證CLE是否具有減輕高原缺氧造成的肺損傷。研究結(jié)果顯示，CLE可以明顯減輕大鼠缺氧后肺水腫程度，IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平較HH組有明顯降低，且降低程度和DXM組相當(dāng)，CLE組和DXM組組間比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明CLE的療效和DXM相仿。

綜上所述，本研究通過構(gòu)造高原缺氧肺損傷大鼠模型，從抑制組胺受體活化以抑制炎性反應(yīng)的角度探討了CLE的肺保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)CLE可能是通過抑制TLR4/NF-κB通路從而抑制肺的炎性反應(yīng)。提示我們未來CLE作為高原缺氧肺損傷治療藥物的可能性。