何祖宇，李普旺，楊子明，王 超，劉運(yùn)浩，姚金勝，宋書(shū)會(huì)，周 闖

(1. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，海南省熱帶園藝產(chǎn)品承后生理與保障重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524091； 2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 湛江 524001)

0 引 言

丁香精油具有抑菌成分丁香酚，是一種天然、高效的抑菌劑[1]。據(jù)報(bào)道，丁香精油具有抗細(xì)菌、抗真菌和抗氧化等作用，作為廣譜殺菌劑，因其作用高效性和長(zhǎng)效性，已逐漸應(yīng)用于食品保鮮中[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，丁香精油對(duì)引起藍(lán)莓腐爛的灰葡萄孢菌具有較好的抗菌性[4-5]，但由于其水溶性差，穩(wěn)定性低，限制了其實(shí)際應(yīng)用。納米微膠囊化技術(shù)是指采用壁材將芯材活性成分包埋起來(lái)，避免芯材受到外界環(huán)境的不良影響而對(duì)其起到保護(hù)作用，具有靶向遞送以及控制釋放等優(yōu)點(diǎn)，而逐漸受到廣泛關(guān)注[6-8]。采用天然高分子材料作為基材，對(duì)丁香精油進(jìn)行包埋，制備具有智能響應(yīng)型的丁香精油載藥納米微膠囊，可以解決克服丁香精油固有的確定，提高其抑菌性能，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。

殼聚糖是甲殼素脫乙酰的產(chǎn)物，具有生物可降解、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，是目前納米微膠囊壁材的研究熱點(diǎn)[9-10]。由于殼聚糖是剛性直鏈分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其溶解性低，但是可通過(guò)引入一些官能團(tuán)對(duì)齊進(jìn)行修飾，以提高其水溶性。具有親水鏈和疏水鏈的兩親性殼聚糖可作為疏水性藥物的載體，在水中自組裝成為納米膠束的研究也引起了廣泛的關(guān)注[11-12]。殼聚糖的疏水鏈與藥物接觸形成疏水內(nèi)核，親水鏈與外部水接觸形成穩(wěn)定的核殼結(jié)構(gòu)。例如，Zhou等[13]通過(guò)在殼聚糖鏈上接枝聚乙二醇和桐油酸，合成了兩親性殼聚糖衍生物，接著以?xún)捎H性殼聚糖衍生物作為壁材，采用超聲自組裝的方法制備了多殺菌素納米膠束，該納米膠束具有優(yōu)秀的持效性和pH響應(yīng)性，并極大地提高了多殺菌素的光穩(wěn)定性。

本研究采用化學(xué)偶聯(lián)法，將軟脂酸(PA)和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)分別接枝到殼聚糖鏈上，以合成兩親性殼聚糖衍生物，并通過(guò)傅里葉紅外光譜和核磁共振氫譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。同時(shí)采用超聲自組裝法，制備了丁香精油-殼聚糖載藥納米膠束，并對(duì)納米膠束的理化特性進(jìn)行了表征，并研究了其對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌性能。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

殼聚糖(CS，粘度>200 mPa·s，脫乙酰度>98%)，軟脂酸(PA)，N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購(gòu)自阿拉丁公司。丁香精油從上海源葉生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi)?；移咸焰呔芍袊?guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。實(shí)驗(yàn)用常規(guī)化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

傅里葉紅外光譜儀，Tensor 27，Bruker公司；核磁共振儀，DPX300，Bruker公司；熒光分光光度計(jì)，F(xiàn)7000，日本日立公司；動(dòng)態(tài)光散射儀，Zetasizer Nano ZS，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；高效液相色譜儀，1260 infinity II，美國(guó)安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 軟脂酸接枝殼聚糖(PA-CS)

殼聚糖的溶解：準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g殼聚糖加入三口燒瓶中，接著加入70 mL 1%的乙酸溶液，在加熱攪拌的條件下至殼聚糖完全溶解。

軟脂酸的溶解：稱(chēng)取0.5 g軟脂酸，1 g EDC，0.5 g NHS，并溶解在30 mL無(wú)水乙醇中，室溫下避光反應(yīng)30 min，以活化軟脂酸的羧基。

將裝有殼聚糖溶液的三口燒瓶移入到80 ℃的水浴鍋中，然后逐滴滴加軟脂酸溶液，在避光條件下加熱攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)產(chǎn)物用乙醇離心洗滌，接著裝入透析袋中用乙醇和水交替透析2次，最后冷凍干燥得到軟脂酸接枝的殼聚糖，記作PA-CS。

1.2.2 合成N-乙酰-L-半胱氨酸接枝PA-CS(PA-CS-NAC)

PA-CS的溶解：稱(chēng)取1 g的PA-CS加入三口燒瓶中，接著加入70 mL 1%的乙酸溶液中，加熱攪拌至其完全溶解。

NAC的溶解：稱(chēng)取0.2 g NAC，0.6 g EDC，0.3 g NHS溶解在30mL水中，并在室溫下避光反應(yīng)30 min，以活化NAC中的羧基。

將裝有PA-CS溶液的三口燒瓶移入到50 ℃的水浴鍋中，然后逐滴滴加NAC溶液，在避光條件下加熱攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)完成后，產(chǎn)物用無(wú)水乙醇離心洗滌。將溶解在水中的產(chǎn)物裝入透析袋中透析三天，第一天的透析液為1 mmol/L鹽酸和含有1%氯化鈉水溶液，其后兩天用含有 0.2 mmol/L鹽酸水溶液透析。最后經(jīng)冷凍干燥得到兩親性殼聚糖，記作PA-CS-NAC-0.2。

其中，通過(guò)調(diào)節(jié)NAC的用量為0.4，0.6 g，按照以上實(shí)驗(yàn)步驟合成PA-CS-NAC-0.4和PA-CS-NAC-0.6，以進(jìn)一步考察NAC對(duì)兩親性殼聚糖衍生物的影響。PA-CS-NAC的合成機(jī)理如圖1所示。

圖1 PA-CS-NAC的合成機(jī)理圖Fig 1 Schematic image for the synthesis of PA-CS-NAC

1.2.3 茚三酮法測(cè)定PA的接枝率

本文采用茚三酮法測(cè)定PA的接枝率[14-15]。首先配制濃度為0.1，0.08，0.06，0.04，0.02 mg/mL的殼聚糖溶液，各取上述溶液0.5 mL分別加入0.5 mL的醋酸緩沖溶液和2 mL 0.05 mg/mL的茚三酮乙醇溶液，接著將混合液放置在90 ℃水浴鍋中并磁力攪拌15 min，最后采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定混合液在570 nm處的吸光度A，根據(jù)殼聚糖濃度C和吸光度A進(jìn)行線性擬合回歸方程。同理，按照上述茚三酮法測(cè)定PA-CS中氨基的含量，并擬合線性回歸方程。最后由兩線性回歸方程的斜率計(jì)算PA-CS中PA的接枝率。

1.2.4 Ellman’s method測(cè)定巰基接枝率

Ellman試劑可以與巰基反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在420 nm處有強(qiáng)吸收，因此本文通過(guò)Ellman’s method測(cè)定巰基的含量推算NAC的接枝率[16-17]。首先，以NAC作為標(biāo)準(zhǔn)品，得到巰基單體濃度的擬合曲線。具體地，先用0.5 mol/L pH為8.0的PBS溶液配置濃度為0.3 mg/mL的DTNB溶液，即為Ellman’s試劑；接著配置濃度為50，100，200，300，400 μmol/L的NAC溶液，并取1.5 mL上述NAC溶液加入到1.5 mL Ellman’s 試劑中，混合均勻后反應(yīng)2 h，測(cè)定420 nm處的紫外吸光度，根據(jù)吸光度與濃度的關(guān)系，得到擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。配置濃度為0.1 mg/mL的PA-CS-NAC溶液，根據(jù)上述Ellman’s method測(cè)定吸光度，并結(jié)合曲線方程，計(jì)算出PA-CS-NAC-0.2，PA-CS-NAC-0.4和PA-CS-NAC-0.6中巰基的接枝率，推算NAC的接枝率。

1.2.5 臨界膠束濃度測(cè)定(critical micelle concentration cmc)

以芘作為探針，測(cè)定PA-CS-NAC的臨界膠束濃度[18-19]。首先配置濃度為1 mg/mL的PA-CS-NAC標(biāo)準(zhǔn)液，標(biāo)記溶液A，以及濃度為0.1 mmol/L的芘丙酮溶液，標(biāo)記溶液B，取一定量的溶液B加入到溶液A中，加熱攪拌，除去丙酮，然后將定容，使得PA-CS-NAC的終濃度為0.1，0.07，0.05，0.03，0.01，0.005，0.003，0.001，0.0005 mg/mL, 芘的終濃度為50 μmol/L。在激發(fā)波長(zhǎng)為338 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為350～450nm的條件下，用F-7000熒光光譜儀對(duì)PA-CS-NAC-0.2，PA-CS-NAC-0.4，PA-CS-NAC-0.6三個(gè)樣品的熒光強(qiáng)度進(jìn)行了測(cè)量。選取第三個(gè)峰(393 nm)和第一個(gè)峰(373 nm)處的吸收峰強(qiáng)度比作為縱坐標(biāo)，濃度對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，作圖得到兩直線，其交點(diǎn)為CMC。

1.2.6 自組裝法制備載藥納米膠束及其包封率和載藥量測(cè)定

采用超聲自組裝的方法制備負(fù)載丁香精油的PA-CS-NAC載藥納米膠束。稱(chēng)取10 mg PA-CS-NAC溶解在20 mL去離子水中，攪拌至完全溶解，然后用超聲波儀超聲處理5 min，連續(xù)處理3次，制得空白納米膠束水溶液。取一定量溶解在甲醇中的丁香精油溶液(1 mg/mL)，加入上述空白納米膠束水溶液中，超聲處理5 min，連續(xù)處理3次，并攪拌5 h，然后用去離子水透析過(guò)夜，以除去甲醇，得到載藥納米膠束，記作NMs。根據(jù)巰基接枝率的不同，將3種載藥納米膠束分別記作NMs-0.6，NMs-0.4和NMs-0.2。

包封率(EE)和載藥量(DL)的測(cè)定：配置濃度為0.1，0.5，1，2，4，6，8，10 mg/mL的丁香精油標(biāo)準(zhǔn)液，采用Eclipse XDB-C18型色譜柱，以甲醇-水(70:30)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，流速為1.0 mL/min，在此條件下測(cè)定并擬合丁香精油標(biāo)準(zhǔn)液的曲線方程，其中以丁香酚峰面積A對(duì)濃度C進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：A=2.63×105C+0.047×105，R2=0.998。取5 mL PA-CS-NAC載藥納米膠束在10000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min，取上清液，通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定丁香精油的含量，并由此計(jì)算包封率(EE)和載藥量(DL)。

EE和DL按下式計(jì)算：

EE(%)=(m-m0)/m×100%

(1)

DL(%)=(m-m0)/(M+m-m0)×100%

(2)

在上述方程式中，m是加入丁香精油的總量，m0是上清液中丁香精油的量，M是PA-CS-NAC的總量。

1.2.7 體外釋放

取2 mL NMs至透析袋(截留分子量為3500 Da)內(nèi)，并浸泡在10 mL PBS(pH分別為6.0、7.5、8.5)溶液中透析，然后取不同時(shí)間點(diǎn)下的透析液2 μL進(jìn)行HPLC測(cè)定，累計(jì)釋放量計(jì)算公式如下：

Cumulative release(%)=mt/m×100%

(3)

mt是t時(shí)刻釋放的丁香精油總量，m是被包埋的丁香精油總量。其中mt的計(jì)算公式如下：

mt=CtV

(4)

Ct是t時(shí)刻測(cè)定的釋放質(zhì)量濃度；V=12 mL，是NMs與透析液的總體積，其中取樣測(cè)試的體積忽略不計(jì)。

1.2.8 載藥納米膠束抑菌性能評(píng)價(jià)

用不同濃度的丁香精油載藥納米膠束和與馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基混合均勻，分別取直徑為8 mm的灰葡萄孢菌的菌塊，在溫度為30 ℃和濕度為95%的條件下，分別培養(yǎng)5和10 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌絲體徑向生長(zhǎng)的直徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，抑菌率按如下公式計(jì)算。

抑制率 (%)=[(空白對(duì)照菌落直徑-8)-(實(shí)驗(yàn)處理菌落直徑-8)]/(空白對(duì)照菌落直徑-8)×100

(5)

注：菌落直徑單位為mm，8為接入的菌餅直徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 PA-CS-NAC的紅外表征

采用化學(xué)偶聯(lián)法制備兩親性殼聚糖衍生物，通過(guò)傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)接枝基團(tuán)進(jìn)行表征，以確定殼聚糖衍生物的分子結(jié)構(gòu)。如圖2(a)所示，1 654 和1 600 cm-1處的吸收帶分別是殼聚糖酰胺I帶羰基的伸縮振動(dòng)吸收和氨基的彎曲振動(dòng)吸收。圖2(b)是軟脂酸PA的紅外光譜圖，其特征吸收峰是1 700 cm-1處的羧基振動(dòng)吸收。圖2(c)是軟脂酸接枝殼聚糖PA-CS的紅外光譜圖，對(duì)比圖(a)、(b)和(c)，可見(jiàn)隸屬于殼聚糖的吸收帶1 654 和1 600 cm-1和隸屬于軟脂酸的吸收帶1 700 cm-1均在圖(c)出現(xiàn)，因此說(shuō)明PA成功接枝在CS上。圖2(d)是NAC的紅外光譜圖，2 550 cm-1附近是歸屬于巰基的特征吸收帶。圖2(e)是的PA-CS-NAC的紅外光譜圖，含有巰基的特征吸收帶和碳基的吸收帶，因此NAC也成功接枝到殼聚糖鏈上。綜上，兩親性殼聚糖衍生物制備成功。

圖2 紅外光譜圖，CS(a)，PA(b)，PA-CS(c)，NAC(d)和PA-CS-NAC(e)Fig 2 Infrared spectra of CS, PA, PA-CS, NAC and PA-CS-NAC

2.2 PA-CS-NAC的核磁表征

為了進(jìn)一步確定兩親性殼聚糖PA-CS-NAC的結(jié)構(gòu)，采用核磁共振氫譜對(duì)其進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3所示。相對(duì)于CS的1H-NMR譜圖，PA-CS-NAC的1H-NMR譜圖在δ=1.19 ppm處出現(xiàn)新的化學(xué)位移峰，其為甲基(—CH3)和亞甲基(—CH2—)的質(zhì)子氫特征吸收峰，說(shuō)明軟脂酸PA接枝上殼聚糖鏈上；在δ=1.84 ppm處也出現(xiàn)新的化學(xué)位移峰，其為NAC中-SH的質(zhì)子氫特征吸收峰，說(shuō)明NAC也接枝上殼聚糖鏈上。另外，δ=4.11 ppm處也出現(xiàn)新的化學(xué)位移峰，其為酰胺基(-NH-CO-CH-)的質(zhì)子氫特征吸收峰，以上可以證明軟脂酸PA和NAC均已接枝到殼聚糖的支鏈上。因此，可以證明PA-CS-NAC已成功合成。

圖3 殼聚糖(CS)及其衍生物(PA-CS-NAC)的核磁共振氫譜Fig 3 1HNMR spectra of CS and PA-CS-NAC

2.3 PA-CS-NAC中PA與NAC的接枝率

茚三酮試劑可以與殼聚糖鏈上的氨基反應(yīng)，因此采用茚三酮法測(cè)定PA的接枝率。濃度為0.1，0.08，0.06，0.04，0.02 mg/mL的殼聚糖溶液，與茚三酮乙醇溶液反應(yīng)，根據(jù)混合液在570 nm處的吸光度A，以及殼聚糖濃度C和吸光度A進(jìn)行線性擬合得到回歸方程為A=3.712C+0.0338,r2=0.997。同理，按照上述茚三酮法測(cè)定PA-CS中氨基的含量，最終得到的擬合方程為A=1.654C+0. 0281,r2=0.995。因此，由兩擬合方程的斜率計(jì)算得到PA-CS中PA的接枝率為44.56%。

Ellman試劑可以與巰基反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在420 nm處有強(qiáng)吸收，因此本文通過(guò)Ellman’s method測(cè)定巰基的含量推算NAC的接枝率。以濃度為50，100，200，300，400 μmol/l的NAC標(biāo)準(zhǔn)溶液與Ellman試劑反應(yīng)，測(cè)定420 nm處反應(yīng)物的紫外吸收強(qiáng)度，根據(jù)吸光度與濃度的關(guān)系，計(jì)算得到擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=9.38CSHμmol/mL-0.12,r2=0.994。配置濃度為0.1mg/mL的PA-CS-NAC溶液，通過(guò)Ellman’s method測(cè)定吸光度，并結(jié)合曲線方程，計(jì)算出PA-CS-NAC-0.2，PA-CS-NAC-0.4和PA-CS-NAC-0.6中NAC的接枝率為22.27%，38.65%，48.73%。

2.4 PA-CS-NAC的臨界膠束濃度

為了表征兩親性殼聚糖PA-CS-NAC在水溶液中的自組裝行為，以芘作為探針，采用熒光分光光度計(jì)法測(cè)定了兩親性殼聚糖的臨界膠束濃度。芘是一種疏水性熒光探針，當(dāng)其暴露于水環(huán)境時(shí)，其傾向于聚集在PA-CS-NAC的疏水結(jié)構(gòu)中，當(dāng)PA-CS-NAC的濃度達(dá)到一定高度，可行成包覆芘的膠束結(jié)構(gòu)，引起芘的熒光發(fā)射I1峰和I3峰的變化，通過(guò)分析其變化的突變點(diǎn)，即可確定臨界膠束濃度。不同接枝率的兩親性殼聚糖的膠束濃度與I1/I3值的關(guān)系圖如圖4所示，計(jì)算得到PA-CS-NAC-0.6(a)，PA-CS-NAC-0.4(b)， PA-CS-NAC-0.2(c)的臨界膠束濃度分別為8.317，7.395，5.833 μg/ mL，表明盡管三種兩親性殼聚糖PA-CS-NAC親水基團(tuán)的接枝率不盡相同，但都能在較低的濃度下可以自聚集成膠束，而且親水性基團(tuán)接枝率越低，臨界膠束濃度也越小。

圖4 PA-CS-NAC納米膠束的濃度與I1/I3值的關(guān)系圖，PA-CS-NAC-0.6(a)，PA-CS-NAC-0.4(b)和 PA-CS-NAC-0.2(c)Fig 4 The relationship between the concentration of PA-CS-NAC nanomicelles and I1/I3: (a) PA-CS-NAC-0.6; (b) PA-CS-NAC-0.4; (c) PA-CS-NAC-0.2

2.5 PA-CS-NAC載藥納米膠束的粒度、zeta電位和形貌表征

采用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)定PA-CS-NAC載藥納米膠束的粒度和zeta電位，結(jié)果如表1所示?？梢钥闯觯琋Ms-0.6的粒徑和zeta電位最大，分別為128.61 nm和31.57 mV；NMs-0.4的粒徑和zeta電位次之，分別為96.04 nm和29. 31 mV；NMs-0.2的粒徑和Zeta電位最小，分別為82.83 nm和26.08 mV。這與兩親性殼聚糖上親水性基團(tuán)的接枝率有關(guān)，親水性基團(tuán)越多，親水基團(tuán)與水充分接觸的幾率大，形成納米膠束的粒徑也就越大。同理，zeta電位也隨著兩親性殼聚糖親水性基團(tuán)數(shù)量的增多而變高。

表1 PA-CS-NAC載藥納米膠束的粒度、zeta電位和載藥量數(shù)據(jù)

此外，利用掃描電鏡表征PA-CS-NAC載藥納米膠束的形貌，載藥納米膠束的電鏡圖如5所示?？梢?jiàn)，3種載藥納米膠束均呈現(xiàn)球狀，NMs-0.6載藥納米膠束的粒徑最大，大于100 nm，而NMs-0.4和NMs-0.2的粒徑均小于100 nm，掃描電鏡測(cè)試結(jié)果與動(dòng)態(tài)光散射的保持一致。

圖5 載藥納米膠束的掃描電鏡圖，NMs-0.6(A)，NMs-0.4(B)， NMs-0.2(C)Fig 5 SEM images ofNMs-0.6, NMs-0.4 and NMs-0.2

2.6 PA-CS-NAC載藥納米膠束的包封率和載藥量表征

通過(guò)高效液相色譜法研究芯材投料量對(duì)PA-CS-NAC載藥納米膠束丁香精油的包封率和載藥量的影響，以NMs-0.6載藥納米膠束為例，結(jié)果如圖6所示。隨著丁香精油加入量的增大，NMs-0.6載藥納米膠束的載藥量上升，包封率下降，當(dāng)加入1，2，3，4，5 mL丁香精油時(shí)，對(duì)應(yīng)的載藥量分別為7.59%，10.87%，14.25%，16.84%，18.06%，相應(yīng)的包封率分別為82.13%，61.15%，56.91%，50.62%，44.08%?？紤]到繼續(xù)加大芯材丁香精油的投入量，載藥量增加不大，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇芯材丁香精油的投入量為5 mL。如表1所示，當(dāng)丁香精油的投入量為5 mL時(shí)，NMs-0.4載藥納米膠束丁香精油的載藥量為22.15%，NMs-0.2載藥納米膠束丁香精油的載藥量為24.31%。

2.7 PA-CS-NAC載藥納米膠束的緩釋性能

通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定了丁香精油載藥納米膠束在不同pH環(huán)境下的緩釋性能，這里以NMs-0.6載藥納米膠束為例，結(jié)果如圖7A所示。從圖可以看出，3種pH環(huán)境(pH=6.0，7.5，8.5)下，都存在一個(gè)突釋過(guò)程，在前10h內(nèi)分別累計(jì)釋放32.13%，25.68%，和16.29%，然后釋放速度減慢。其中，載藥納米膠束在弱酸和偏中性環(huán)境下(pH=6.0，7.5)可以釋放出更多的藥物，這是由于在弱酸和中性環(huán)境中，弱酸的誘導(dǎo)效應(yīng)導(dǎo)致納米膠束的外層殼聚糖結(jié)構(gòu)疏松，有利于丁香精油從疏水性?xún)?nèi)核中釋放出來(lái)；而在堿性條件環(huán)境，由于改性殼聚糖中的氨基與堿性環(huán)境OH-的靜電作用，抑制了載藥膠束中丁香精油的釋放。另外，如圖7B所示，在pH=6.0的環(huán)境下，NMs-0.6, NMs-0.4, NMs-0.2三種載藥載藥納米膠束的緩釋速度依次減慢，這是因?yàn)闅ぞ厶擎溕嫌H水性基團(tuán)越多，越有利于載藥納米膠束的溶脹作用，因此載藥納米膠束的緩釋速度越快。上述數(shù)據(jù)表明，丁香精油載藥納米膠束具有一定的pH調(diào)控釋放的性能，這為載藥膠束在實(shí)際應(yīng)用中提供了參考依據(jù)。

圖6 丁香精油投料量對(duì)包封率和載藥量的影響Fig 6 Effect of the dosage of clove essential oil on the EE and the DL

圖7 (a)NMs-0.6在不同pH下的緩釋曲線；(b)NMs-0.6, NMs-0.4, NMs-0.2在pH=6.0下的緩釋曲線Fig 7 Slow release curves of NMs-0.6 at different pH and slow release curves of NMs-0.6, NMs-0.4 and NMs-0.2 at pH=6.0

2.8 PA-CS-NAC載藥納米膠束的抑菌性能

通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)量了丁香精油載藥納米膠束對(duì)灰葡萄孢菌的抑真菌活性，結(jié)果如圖7(a)和(b)所示。當(dāng)丁香精油的藥物濃度為5 mg/L時(shí)(7a)，NMs-0.6的抑菌率最高，其對(duì)灰葡萄孢菌的5天和10天抑制率分別比丁香精油原藥的高出13.76%和10.24%。當(dāng)多丁香精油的藥物濃度為10 mg/L時(shí)(7b)，也是NMs-0.6的抑菌率最高，其對(duì)灰葡萄孢菌的5和10 d抑制率分別比丁香精油原藥的高出14.52%和9.74%。此外，從圖可知三種載藥納米膠束的抑菌率相當(dāng)，但是以NMs-0.6的抑菌率最高，這可能是因?yàn)镻A-CS-NAC-0.6的親水性基團(tuán)接枝率最高，有利于NMs-0.6附著于細(xì)菌的表面，使得丁香精油產(chǎn)生更佳的抗菌活性?？咕鷮?shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，三種載藥納米膠束的抑真菌活性都比丁香精油原藥的高，在相同劑量的丁香精油下，載藥納米膠束對(duì)灰葡萄孢菌具有更高的抗真菌活性。

圖8 丁香精油和載藥納米膠束的抑菌率，丁香精油藥物濃度分別為5 mg/L(A)和10 mg/L(B)Fig 8 Antibacterial rate of clove essential oil and NMs, the concentration of clove essential oil were 5 mg/L and 10 mg/L, respectively

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)法，在殼聚糖鏈上接枝了疏水基團(tuán)軟脂酸和親水基團(tuán)N-乙酰-L半胱氨酸，合成并表征了兩親性殼聚糖衍生物，并以此為壁材，制備了包埋丁香精油的載藥納米膠束，并探討了載藥納米膠束對(duì)灰葡萄孢菌的抗真菌活性。主要研究結(jié)果如下：

(1)本文采用偶聯(lián)反應(yīng)合成了兩親性殼聚糖衍生物(PA-CS-NAC)，接著采用紅外光譜儀和核磁共振儀表征了PA-CS-NAC的化學(xué)結(jié)構(gòu)，利用茚三酮法和Ellman’s method測(cè)定了其疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)的接枝率。

(2)以芘作為探針測(cè)定了不同接枝率PA-CS-NAC的臨界膠束濃度，兩親性殼聚糖衍生物中親水性基團(tuán)的接枝率越高，其臨界膠束濃度越大。

(3)通過(guò)超聲自組裝法制備了丁香精油載藥納米膠束，兩親性殼聚糖衍生物中親水性基團(tuán)的接枝率越高，載藥納米膠束的粒徑就越大，在相同條件下的緩釋速度最快。

(4)制備的載藥納米膠束具有pH響應(yīng)和持效緩釋性能，同一條件下，載藥納米膠束的抗菌能力較未包埋的丁香精油可提高10%以上。