ALP、AST、CK活性隨血痕經(jīng)過時(shí)間演變的實(shí)驗(yàn)性研究

趙媛中 李寶華 張 倩 殷 霞 張 苗 孫文平

山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2.公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 泰安 271016

血痕是涉及人體傷害案件現(xiàn)場(chǎng)常見的生物物證，其形成時(shí)間與犯罪發(fā)生時(shí)間密切相關(guān)，推斷血痕的經(jīng)過時(shí)間對(duì)判斷案發(fā)時(shí)間具有重要意義。由于血痕樣本的復(fù)雜性以及檢測(cè)分析手段的缺乏，使血痕分析成為生物化學(xué)表征的一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的目標(biāo)。揭示和評(píng)價(jià)血液成分的老化過程是法醫(yī)學(xué)研究中一個(gè)尚未解決的問題，有助于闡明犯罪細(xì)節(jié)。

血液成分復(fù)雜，含有遺傳物質(zhì)以及多種可作為生物標(biāo)記的蛋白質(zhì)和低分子量化合物。過去人們通過端?？s短或線粒體DNA缺失的積累程度，用遺傳方法來確定個(gè)體年齡和血痕遺留時(shí)間，但這些方法顯示出較低的準(zhǔn)確性，限制了其在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。有學(xué)者通過采用生物級(jí)聯(lián)催化方法對(duì)48 h內(nèi)血痕中ALT活性進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過建立回歸分析定量模型，能較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)干燥血痕的經(jīng)過時(shí)間，因此，檢測(cè)血痕中酶活性的改變?cè)陬A(yù)測(cè)血痕遺留時(shí)間推斷上可能具有較高的應(yīng)用價(jià)值[1]。本研究旨在探討實(shí)驗(yàn)室條件下血痕中堿性磷酸酶(ALP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)活性隨時(shí)間的演變規(guī)律，以期為推斷案發(fā)時(shí)間提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血液采集與樣本制備

隨機(jī)選擇40名健康志愿者(20～21歲，男女各半)，利用一次性采血針分別對(duì)其進(jìn)行肘靜脈取血，每人采血5 mL備用。從每個(gè)樣本取血0.3 mL分別滴加到12個(gè)載玻片上，標(biāo)記英文字母以對(duì)應(yīng)12個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)?？刂茖?shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度25 ℃，濕度60%，自然光照、干燥。

1.2 儀器與試劑

瑞士羅氏c311全自動(dòng)血生化儀，南京建成ALP、AST、CK酶活性檢測(cè)試劑盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與樣本檢測(cè)方法

本實(shí)驗(yàn)設(shè)定1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42 d共12個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。檢測(cè)前，將對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的載玻片血痕用0.3 mL蒸餾水重新溶解，移液器吸取加入到EP管內(nèi)，3 000 r/min離心5 min，取上清用于檢測(cè)。ALP、AST、CK活性檢測(cè)分別按照所對(duì)應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 不同經(jīng)過時(shí)間的干燥血痕中ALP的活性變化

在實(shí)驗(yàn)設(shè)定條件下對(duì)每個(gè)樣本12個(gè)時(shí)間點(diǎn)血痕中ALP的活性進(jìn)行檢測(cè)，可統(tǒng)計(jì)出ALP活性改變的趨勢(shì)。5 d內(nèi)血痕中ALP活性比較穩(wěn)定，隨后呈平緩下降趨勢(shì)，結(jié)果如圖1、表1所示。

圖1 不同經(jīng)過時(shí)間血痕中的ALP活性隨時(shí)間的變化趨勢(shì)

2.2 不同經(jīng)過時(shí)間的干燥血痕中AST的活性變化

在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的12個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)樣本血痕中AST的活性進(jìn)行檢測(cè)，可統(tǒng)計(jì)出AST活性變化的趨勢(shì)。血痕形成4 d內(nèi)，AST活性保持穩(wěn)定，5 d后呈明顯上升趨勢(shì)，4 w后變化趨于穩(wěn)定，結(jié)果如圖2、表1所示。

圖2 不同經(jīng)過時(shí)間血痕中的AST活性隨時(shí)間的變化趨勢(shì)

2.3 不同經(jīng)過時(shí)間的干燥血痕中CK的活性變化

在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的12個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)血痕中CK的活性進(jìn)行檢測(cè)，可統(tǒng)計(jì)出CK活性改變的趨勢(shì)。在血痕形成6 d內(nèi)，CK活性急劇降低，隨后下降趨勢(shì)減慢，14 d之后變化趨于平緩，結(jié)果如圖3、表1所示。

圖3 不同經(jīng)過時(shí)間的干燥血痕中CK的活性變化

表1 血痕CK、AST、ALP活性隨時(shí)間變化趨勢(shì)

3 討 論

作為法醫(yī)血清學(xué)的一個(gè)分支，血液、唾液、汗液等生物樣品的分析在提供有關(guān)犯罪的客觀事實(shí)方面為刑事訴訟作出了巨大貢獻(xiàn)。在涉及刑事犯罪的法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，命案現(xiàn)場(chǎng)往往會(huì)遺留大量血痕，判斷血痕的形成時(shí)間可為案件的偵破提供有價(jià)值的重要信息。血痕經(jīng)過時(shí)間的研究國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道，主要包括利用光譜技術(shù)(如拉曼光譜、紅外光譜等)進(jìn)行血痕來源種屬鑒定及分析全血中血紅蛋白及其他成分的降解規(guī)律[2-3]、利用智能手機(jī)分析血痕演化的形態(tài)特征[4]、PCR技術(shù)檢測(cè)分析血痕中RNA的降解[5]等方面。

本研究測(cè)定了在6周內(nèi)12個(gè)時(shí)間點(diǎn)血痕中ALP、AST、CK的活性改變，從以上結(jié)果可以看出，ALP活性在各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的變化較為平緩，總體呈緩慢下降趨勢(shì)；AST活性在前4 d變化不明顯，從5 d起明顯升高一直持續(xù)到35 d，維持在高活性狀態(tài)，隨后開始緩慢下降；CK活性在1周內(nèi)迅速下降，而2周后變化則趨于平緩。因此我們認(rèn)為，檢測(cè)AST和CK的活性改變能較好地反應(yīng)短期內(nèi)(1周)血痕經(jīng)過時(shí)間，而ALP活性變化比較適合血痕形成較久的時(shí)間推斷。本次研究表明，血痕中ALP、AST、CK等酶活性的改變可以作為確定犯罪現(xiàn)場(chǎng)血痕遺留時(shí)間的推斷工具。在真實(shí)的犯罪現(xiàn)場(chǎng)中，溫度、濕度、光照以及生物破壞等多種環(huán)境條件會(huì)不同程度地影響酶活性。在今后的研究中，可以設(shè)定多個(gè)變量因素條件下檢測(cè)不同酶活性的變化規(guī)律，期待建立相應(yīng)的回歸方程，為血痕經(jīng)過時(shí)間的法醫(yī)學(xué)推斷提供有實(shí)用價(jià)值的參考指標(biāo)。