陳萬(wàn)銀，顏一丹，欒曉瑾，王敏，方杰

研究報(bào)告

基因在果蠅睪丸生殖細(xì)胞中的功能分析

陳萬(wàn)銀，顏一丹，欒曉瑾，王敏，方杰

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，鎮(zhèn)江 212001

生殖細(xì)胞的自我更新及分化過(guò)程對(duì)于男性不育及生殖細(xì)胞腫瘤的發(fā)生至關(guān)重要，基因作為果蠅()睪丸生殖干細(xì)胞的調(diào)控因子之一，其功能機(jī)制尚不清楚。為了探討基因在果蠅睪丸生殖細(xì)胞中的生物學(xué)功能，本研究首先通過(guò)UAS-gal4系統(tǒng)介導(dǎo)的RNAi途徑，驅(qū)動(dòng)果蠅睪丸生殖細(xì)胞和包囊細(xì)胞中UAS-RNAi的表達(dá)，觀察后代雄性果蠅的生育能力；其次，通過(guò)免疫熒光染色方法檢測(cè)對(duì)照組和RNAi雄性果蠅睪丸中Vasa、IBI、鋅指結(jié)構(gòu)域1蛋白(Zn finger homeodomain 1, Zfh1)、眼缺陷蛋白(eyes absent, Eya)、DE-cad、FasIII以及磷酸化組蛋白H3 (phospho-histone H3, PH3)、TUNEL等表達(dá)模式；最后，使用小干擾RNA (siRNA)在果蠅 S2 細(xì)胞中將基因表達(dá)沉默，用PH3檢測(cè)對(duì)照組和siRNA組中果蠅S2細(xì)胞增殖能力，TUNEL及流式凋亡檢測(cè)技術(shù)分析果蠅S2細(xì)胞凋亡情況；通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)剪接體亞基的mRNA水平，觀察剪接體的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，與對(duì)照組果蠅比較，在生殖細(xì)胞和包囊細(xì)胞中缺失基因，雄性果蠅的生育能力降低甚至完全喪失；另外，nos-gal4驅(qū)動(dòng)UAS-RNAi的雄性果蠅中生殖細(xì)胞及生殖融合體消失，并且生殖細(xì)胞增殖能力減弱，而tj-gal4驅(qū)動(dòng)UAS-RNAi的果蠅睪丸中出現(xiàn)生殖細(xì)胞樣腫瘤；在果蠅S2細(xì)胞中敲減基因?qū)е录?xì)胞凋亡增加，增殖受到抑制；基因在果蠅S2細(xì)胞中沉默引起剪接體亞基的信使RNA水平升高?？梢?jiàn)，基因在果蠅睪丸生殖細(xì)胞的自我更新與分化過(guò)程中必不可少，其缺失可能導(dǎo)致生殖細(xì)胞存活受限甚至生殖細(xì)胞樣腫瘤的形成；并且基因可參與果蠅S2細(xì)胞的增殖和凋亡，對(duì)于細(xì)胞生命的維持至關(guān)重要，同時(shí)可競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)節(jié)剪接體亞基的mRNA水平。

基因；果蠅睪丸；生殖細(xì)胞；自我更新與分化；增殖與凋亡

通常認(rèn)為干細(xì)胞需要在特定的環(huán)境中才能保持自我更新及分化的性狀，對(duì)于組織穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞生長(zhǎng)至關(guān)重要[1,2]。果蠅()睪丸中存在有兩種干細(xì)胞類(lèi)型，包括生殖干細(xì)胞(germline stem cells, GSCs)和體細(xì)胞干細(xì)胞(cyst stem cells, CySCs)[3,4]，它們均與睪丸頂端的中心(Hub)細(xì)胞相連，共同構(gòu)成生殖干細(xì)胞微環(huán)境(stem cell niche)[5~7]。GSCs產(chǎn)生的一個(gè)子代細(xì)胞經(jīng)過(guò)4輪有絲分裂分化為16個(gè)精原細(xì)胞，繼而經(jīng)過(guò)精母細(xì)胞、圓形精子、長(zhǎng)形精子和成熟精子完成整個(gè)生精過(guò)程[8]。兩個(gè)由CySCs分化而來(lái)的包囊細(xì)胞包裹著生殖細(xì)胞并且支持著生殖細(xì)胞的生長(zhǎng)[3]。而Hub細(xì)胞主要維持著GSCs和CySCs的自我更新及分化[9,10]。

干細(xì)胞微環(huán)境內(nèi)的多條重要信號(hào)通路調(diào)控著干細(xì)胞的自我更新及分化過(guò)程[8,11]，許多研究表明，Hub細(xì)胞通過(guò)分泌Upd因子在GSCs和CySCs激活JAK-STAT信號(hào)通路，維持這兩類(lèi)細(xì)胞自我更新的能力[12,13]。另外，Hub細(xì)胞通過(guò)CySCs激活Hh信號(hào)通路來(lái)維持干細(xì)胞自我更新的性狀[14]。此外，大量研究證明多種細(xì)胞因子也參與調(diào)控干細(xì)胞微環(huán)境，其中，剪接體亞基與果蠅睪丸干細(xì)胞自我更新及分化之間存在密切關(guān)系。比如U2A剪接因子通過(guò)影響生殖細(xì)胞分化從而影響雄性果蠅生育能力[15]。PrP3作為PrP復(fù)合體中的關(guān)鍵剪接體成分，對(duì)于雄性果蠅生育及生殖系干細(xì)胞的自我更新及分化至關(guān)重要[16]。

果蠅遺傳學(xué)研究中常用UAS-gal4系統(tǒng)異位表達(dá)轉(zhuǎn)基因果蠅，用于激活UAS下游靶基因。Yu等[6]通過(guò)對(duì)2881個(gè)果蠅睪丸進(jìn)行RNA干擾(RNAi)，共鑒定到221個(gè)參與生殖細(xì)胞自我更新過(guò)程的調(diào)控因子，其中基因的表達(dá)具有差異性?；蛟诩?xì)胞周期進(jìn)程及信使RNA衰減等過(guò)程中發(fā)揮作用，通過(guò)Flybase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://flybase.org/)顯示基因與維持細(xì)胞壁完整性有關(guān)，起到凋亡調(diào)節(jié)劑的作用，而其對(duì)果蠅睪丸生殖細(xì)胞凋亡的影響尚不明確。因此，本研究分析了基因在果蠅睪丸生殖細(xì)胞中的生物學(xué)功能及基因?qū)塖2細(xì)胞增殖及凋亡的影響，探索了基因沉默與剪接體亞基之間的潛在聯(lián)系，為研究基因的作用機(jī)制提供方向。

1 材料與方法

1.1 果蠅品系及飼養(yǎng)

UAS-RNAi轉(zhuǎn)基因果蠅購(gòu)自清華果蠅中心(Tsinghua Fly Center, THFC)，該品系來(lái)源于TRiP RNAi轉(zhuǎn)基因果蠅庫(kù)(Transgenic RNAi Project)。gal4轉(zhuǎn)基因果蠅品系信息如下：nos-gal4 (BDSC, #4937)，tj-gal4 (DGRC, #104055)。WT品系果蠅為野生型果蠅，作為對(duì)照組，來(lái)源于THFC果蠅庫(kù)。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

所有果蠅均在溫度25℃、相對(duì)濕度60%的條件下飼養(yǎng)。

1.2 果蠅雜交策略

分別挑選nos-gal4、tj-gal4品系雄性果蠅與UAS-RNAi的處女蠅進(jìn)行雜交。在出生2 d內(nèi)的F1代中挑選特定基因型(nos>RNAi、tj>RNAi)的果蠅用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。nos>RNAi和tj>RNAi基因型分別指的是在生殖細(xì)胞和包囊細(xì)胞中敲減基因。

1.3 生育率測(cè)試

在F1代果蠅中挑選單只特定基因型(UAS-RNAi)的成年雄蠅與3只野生型處女蠅雜交，觀察其是否可以獲得后代果蠅。通過(guò)統(tǒng)計(jì)F1代成年雄性果蠅生育比例判斷雄性果蠅的生育能力。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

利用快凍慢融的原理復(fù)蘇果蠅S2細(xì)胞后，放入DMEM+10%胎牛血清(以色列Bioind公司)配制的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為28℃恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度和狀態(tài)，及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞換液和細(xì)胞傳代，并以適當(dāng)密度重新接種至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)[17]。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%~90%密度后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟如下：由蘇州吉瑪基因公司設(shè)計(jì)并合成siRNA序列，使用Lipo2000脂質(zhì)體(美國(guó)Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞。使用250 μL Opti-MEM (美國(guó)Gibco公司)稀釋成15 μL的Lipo2000，輕輕混勻后室溫放置5 min，在250 μL opti-MEM中加入15 μL小干擾RNA (siRNA)，將兩管混合物充分混勻后，室溫放置20 min，使siRNA終濃度為150 nmol/L作為最終培養(yǎng)基加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，6 ｈ后更換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。siRNA序列見(jiàn)表1。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測(cè)

果蠅S2細(xì)胞總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)(日本TaKaRa公司)進(jìn)行。將目的DNA及相應(yīng)的引物與SYBRGreen染料配成10 μL反應(yīng)體系在反應(yīng)管中充分混勻，4℃短暫離心，置入熒光定量PCR儀(美國(guó)安捷倫公司)中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線(xiàn)分析：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s，60℃ 15 s。以作為內(nèi)參，以Folds=2–ΔΔCt表示目的基因在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中表達(dá)的倍比關(guān)系。qRT-PCR引物序列見(jiàn)表2。

1.6 免疫熒光檢測(cè)果蠅S2細(xì)胞的增殖與凋亡

將轉(zhuǎn)染24 h后的果蠅S2細(xì)胞放入六孔板中進(jìn)行種板，孵育24 h后在培養(yǎng)皿中進(jìn)行免疫染色。具體步驟如下：4%多聚甲醛固定30 min。在含有0.1%Triton X-100(PBST)的1×PBS中洗滌3次，并在5%牛血清白蛋白BSA (上海生工生物工程股份有限公司)中封閉30 min后，將樣品與一抗(Vasa購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，1B1、Zfh1、Eya、DE-cad、FasIII均購(gòu)自美國(guó)Developmental Studies Hybridoma Bank公司，PH3購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司)在室溫孵育1 h或4℃過(guò)夜。之后0.1%PBST中洗滌3次，每次10 min。然后將樣品在室溫下與二抗(包括488-兔二抗、cy3-小鼠二抗、647-大鼠二抗，均購(gòu)自美國(guó)Molecular Probes and Jackson Immunologicals公司)一起孵育1 h，之后在0.1%PBST中洗滌3次。用Hoechst 33342(美國(guó)Invitrogen公司)染色10 min，加入20 μL 80%甘油，蓋上蓋玻片封片。在奧林巴斯BX51熒光正置顯微鏡上捕獲圖像并使用Adobe Photoshop CS5軟件處理。使用Image J軟件對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。

表1 本研究所用的siRNA序列

表2 本研究所用的qRT-PCR引物序列

1.7 流式細(xì)胞分析果蠅S2細(xì)胞凋亡

將siRNA轉(zhuǎn)染48 h后的果蠅S2細(xì)胞，根據(jù)Annexin V-Alexa Fluor 647/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京福麥斯生物技術(shù)有限公司)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)取1×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行離心，用250 μL結(jié)合換緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，與2.5 μL Annexin V-Alexa Fluor 647和5 μL PI混合，然后將其在黑暗室溫下孵育15 min，每個(gè)樣品加入200 μL PBS，使用FACScan流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Biosciences公司)分析樣品。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad軟件(https://www.graphpad.com/)進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和分析，Student-檢驗(yàn)評(píng)估數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，定量結(jié)果表示為平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。0.05，0.01，0.001，n.s 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的實(shí)驗(yàn)生物學(xué)樣本重復(fù)至少3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 在生殖細(xì)胞與包囊細(xì)胞中敲減CG8005基因?qū)е滦坌怨壣氏陆?/h3>

為了探究基因與雄性果蠅生育能力的相關(guān)性，本研究分別在生殖細(xì)胞和包囊細(xì)胞中表達(dá)的gal4來(lái)驅(qū)動(dòng)UAS-RNAi。生育率測(cè)試(表3)結(jié)果表明，生殖細(xì)胞中敲減基因(nos>RNAi)導(dǎo)致雄性果蠅完全不育，生育率為0.00% (=59,<0.001)；包囊細(xì)胞中敲減基因(tj>RNAi)，雄性果蠅生育率下降至19.67% (=61,<0.001)。

2.2 在生殖細(xì)胞中敲低CG8005基因?qū)е律臣?xì)胞缺失

本研究首先利用免疫熒光技術(shù)，并通過(guò)多種睪丸細(xì)胞相關(guān)抗體觀察基因在果蠅睪丸中的功能。其中，生殖細(xì)胞可以被Vasa抗體標(biāo)記，融合體(fusome)可用IBI蛋白標(biāo)記，其在睪丸頭部頂端呈點(diǎn)狀分布，隨著生殖細(xì)胞的分化，逐漸發(fā)展成樹(shù)杈狀；CySCs可被鋅指結(jié)構(gòu)域1蛋白(Zn finger homeodomain 1, Zfh1)標(biāo)記；成熟的包囊細(xì)胞被眼缺陷蛋白(eyes absent, Eya)標(biāo)記。通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，nos>RNAi組睪丸形態(tài)坍塌、內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，呈現(xiàn)小睪丸表型，此時(shí)生殖細(xì)胞及融合體均全部消失(圖1)。為了進(jìn)一步探索被DNA標(biāo)記的細(xì)胞核來(lái)源，利用體細(xì)胞相關(guān)免疫抗體進(jìn)行檢測(cè)，睪丸頂部的CySCs和包囊細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目明顯增多，Eya積累與Zfh1信號(hào)發(fā)生重合(圖1)。以上結(jié)果提示，基因在早期生殖細(xì)胞中導(dǎo)致生殖細(xì)胞缺失。

表3 敲減CG8005基因雄性果蠅生育率的測(cè)試結(jié)果

采用卡方檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 在生殖細(xì)胞中敲低CG8005基因生殖細(xì)胞增殖能力減弱

黏附蛋白DE-cad是中心細(xì)胞和體細(xì)胞的標(biāo)記物，生殖細(xì)胞中缺失基因，睪丸頭部頂端的中心細(xì)胞消失不可見(jiàn)，體細(xì)胞與增多的包囊細(xì)胞同步定位(圖2)，包囊細(xì)胞屬于種系而不是生殖系。磷酸化組蛋白 H3 (phospho-histone H3，PH3)作為增殖細(xì)胞的標(biāo)記物，在正常果蠅睪丸早期生殖細(xì)胞中僅存在1~3個(gè)。本研究進(jìn)一步利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)生殖細(xì)胞消失后其增殖能力的改變，結(jié)果顯示在對(duì)照組果蠅睪丸頭部頂端可檢測(cè)到PH3信號(hào)，而nos>RNAi組中未檢測(cè)到PH3表達(dá)(圖2)，提示生殖細(xì)胞缺失可能與其增殖能力減弱有關(guān)。

圖1 缺失CG8005基因生殖細(xì)胞的表達(dá)模式

Vasa抗體(紅色)標(biāo)記生殖細(xì)胞，IBI抗體(綠色)標(biāo)記生殖融合體。Zfh1抗體(紅色)標(biāo)記體細(xì)胞干細(xì)胞，Eya抗體(綠色)標(biāo)記包囊細(xì)胞，DNA標(biāo)記細(xì)胞核(灰色)。標(biāo)尺：20 μm。

圖2 生殖細(xì)胞中敲低CG8005基因?qū)ι臣?xì)胞增殖能力的影響

體細(xì)胞被DE-cad抗體(紫色)識(shí)別，Eya抗體(綠色)標(biāo)記包囊細(xì)胞。PH3抗體(紅色)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，F(xiàn)asIII抗體(綠色)標(biāo)記中心細(xì)胞，DNA標(biāo)記細(xì)胞核(灰色)。標(biāo)尺：20 μm。

2.4 在包囊細(xì)胞中敲低CG8005基因影響生殖細(xì)胞分化

為了探索果蠅睪丸中基因在包囊細(xì)胞中的功能，本研究利用tj-gal4在包囊細(xì)胞中敲低基因。免疫熒光結(jié)果顯示，對(duì)照組睪丸頂部的中心細(xì)胞被FasIII抗體識(shí)別，而實(shí)驗(yàn)組中FasIII信號(hào)消失，Zfh1和Eya染色結(jié)果顯示不存在CySCs和包囊細(xì)胞(圖3)。有研究表明，中心細(xì)胞參與調(diào)控生殖干細(xì)胞自我更新與分化過(guò)程，本研究結(jié)果顯示，tj>RNAi組睪丸失去了正常的形態(tài)，中心細(xì)胞缺失，并在果蠅睪丸中出現(xiàn)被Vasa抗體標(biāo)記的異常細(xì)胞團(tuán)塊，此時(shí)樹(shù)杈狀的融合體變成點(diǎn)狀(圖4)，最終導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖，形成生殖細(xì)胞樣腫瘤。這些未分化的生殖細(xì)胞團(tuán)塊被TUNEL(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP-生物素缺口末端)標(biāo)記，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示凋亡細(xì)胞比率近30% (圖4)，提示這些細(xì)胞具有凋亡能力，表明基因是生殖細(xì)胞形成所必需的。以上結(jié)果揭示了基因在包囊細(xì)胞中影響生殖細(xì)胞的分化過(guò)程。

圖3 在包囊細(xì)胞中敲低CG8005基因?qū)ι臣?xì)胞及體細(xì)胞的影響

Vasa抗體(紅色)標(biāo)記生殖細(xì)胞，F(xiàn)asIII抗體(綠色，放大)標(biāo)記中心細(xì)胞。Zfh1抗體(紅色，放大)標(biāo)記體細(xì)胞干細(xì)胞，包囊細(xì)胞被Eya抗體(綠色)識(shí)別。DNA標(biāo)記細(xì)胞核(藍(lán)色)。標(biāo)尺：20 μm。

2.5 CG8005基因缺失抑制果蠅S2細(xì)胞增殖

為了進(jìn)一步探究基因的體外功能，本研究使用兩個(gè)siRNA (si-1和si-2)將基因在果蠅S2細(xì)胞中表達(dá)沉默。通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)照組、si-1組和si-2組中信使RNA (mRNA)表達(dá)水平，結(jié)果顯示片段si-1敲減效率52%，而si-2敲減效率達(dá)70%，因此選用片段si-2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖5A)。在果蠅S2細(xì)胞中敲減基因，用檢測(cè)細(xì)胞增殖能力標(biāo)記物PH3進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，si-2組PH3陽(yáng)性細(xì)胞減少(圖5B)，對(duì)照組PH3陽(yáng)性信號(hào)百分比為5.8%，實(shí)驗(yàn)組下降至4.3%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖5C)。以上結(jié)果表明，在果蠅S2 細(xì)胞中敲減基因抑制細(xì)胞的增殖。

2.6 CG8005基因缺失導(dǎo)致果蠅S2細(xì)胞凋亡

運(yùn)用UAS-gal4系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)基因在睪丸中缺失，導(dǎo)致生殖細(xì)胞自我更新和分化異常。本研究進(jìn)一步分析基因?qū)塖2細(xì)胞存活的影響，利用TUNEL免疫熒光技術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，si-2組果蠅S2細(xì)胞中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞增加(圖6A)，實(shí)驗(yàn)組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比從2%上升至7% (圖6B)。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果與TUNEL免疫熒光結(jié)果一致(圖6C)，凋亡細(xì)胞增加存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6D)。反映基因敲減后，果蠅S2細(xì)胞凋亡增加。

圖4 在包囊細(xì)胞中敲低CG8005基因?qū)ι橙诤象w和細(xì)胞凋亡影響

IBI抗體(綠色)標(biāo)記生殖細(xì)胞間融合體，黃色箭頭表示點(diǎn)狀融合體，白色箭頭表示樹(shù)杈狀融合體。TUNEL末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP-生物素缺口末端。柱狀圖表示TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比。DNA標(biāo)記細(xì)胞核(藍(lán)色)。標(biāo)尺：20 μm。

2.7 CG8005基因沉默影響剪接體亞基的表達(dá)

剪接體在疾病的發(fā)生中具有重要的意義，主要的剪接體對(duì)于mRNA加工和細(xì)胞存活至關(guān)重要，剪接體亞基U2A的突變會(huì)損害精原細(xì)胞的分化，阻礙生殖細(xì)胞成熟為精子。為了初步探索基因與剪接體亞基之間的聯(lián)系，本研究主要利用qRT-PCR方法，對(duì)主要剪接體的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，剪接體亞基(、、、S、、和)的mRNA水平均在敲減基因的果蠅S2細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)(圖7)，提示基因沉默可能促進(jìn)了剪接體亞基的表達(dá)，從而影響它們的功能。

3 討論

精子發(fā)生過(guò)程中任何障礙最終可能導(dǎo)致男性不育，其中生殖細(xì)胞的功能異常對(duì)于男性生育能力尤為重要。并且有證據(jù)顯示，生殖細(xì)胞腫瘤患者在年輕的時(shí)候存在生育相關(guān)問(wèn)題，提示不育癥可能是生殖細(xì)胞腫瘤發(fā)病的高危因素[17]。

圖5 在果蠅S2細(xì)胞中缺失CG8005基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響

A：qRT-PCR法檢測(cè)在果蠅S2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si1、si-2驗(yàn)證干涉效率；B：免疫熒光檢測(cè)在果蠅S2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-2細(xì)胞的增殖能力；C： PH3陽(yáng)性細(xì)胞百分比。*<0.05；***<0.001。標(biāo)尺：30 μm。

圖6 在果蠅S2細(xì)胞中缺失CG8005基因?qū)?xì)胞凋亡水平的影響

A：免疫熒光檢測(cè)在果蠅S2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-2細(xì)胞的凋亡情況；B：TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比；C：流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；D：流式各組細(xì)胞百分比。***<0.001；n.s 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。標(biāo)尺：30 μm。

圖7 CG8005基因沉默對(duì)剪接體亞基表達(dá)水平的影響

**<0.01；***<0.001)。

果蠅具有繁殖時(shí)間短、遺傳操作性強(qiáng)、靶基因的RNAi品系資源豐富等優(yōu)勢(shì)，在雄性生殖系統(tǒng)(特別是生殖細(xì)胞)的研究中具有優(yōu)勢(shì)。果蠅睪丸中GSCs是果蠅精子產(chǎn)生的源頭，CySCs為生殖細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)及分化提供環(huán)境，它們的自我更新與分化過(guò)程均需要Hub細(xì)胞的維持[18]。Yu等[6]運(yùn)用果蠅模型在睪丸中篩選到221個(gè)生殖干細(xì)胞調(diào)控因子，并進(jìn)一步對(duì)這些調(diào)控因子進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)一些調(diào)控因子可以通過(guò)包囊細(xì)胞影響生殖細(xì)胞的分化過(guò)程，最終形成生殖細(xì)胞樣腫瘤[6,19]。

CG8005蛋白是一種可能的脫氧蘇氨酸合酶，Bing在線(xiàn)工具分析基因參與細(xì)胞周期進(jìn)程、信使RNA衰減等過(guò)程，可催化亞精胺的NAD依賴(lài)性氧化裂解，與真核翻譯起始因子5A(elf-5A)的相互作用蛋白，它可能參與應(yīng)激反應(yīng)并維持細(xì)胞壁的完整性，充當(dāng)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)劑。然而，基因在果蠅睪丸生殖細(xì)胞中的研究報(bào)道十分少見(jiàn)。

本研究結(jié)果提示，缺失基因雄性果蠅盡管可以存活，但其生育能力明顯下降。更重要的是，nos-gal4主要在生殖干細(xì)胞和精原細(xì)胞中表達(dá)，并在生精過(guò)程中逐漸下降，RNAi組中睪丸形態(tài)縮小，生殖細(xì)胞及融合體消失，包囊細(xì)胞及CySCs代償性增加，盡管這些細(xì)胞具有一定的增殖能力，最終依然導(dǎo)致生殖細(xì)胞死亡。而tj-gal4主要在體細(xì)胞的包囊細(xì)胞中表達(dá)，有研究報(bào)道GSCs正常分化過(guò)程受到CySCs的調(diào)控，CySCs缺陷可以介導(dǎo)生殖細(xì)胞分化阻滯最終發(fā)展為生殖細(xì)胞腫瘤[1]。本研究運(yùn)用tj-gal4介導(dǎo)RNAi使用Vasa抗體觀察這些過(guò)度增殖細(xì)胞的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異常的細(xì)胞團(tuán)塊被生殖細(xì)胞信號(hào)捕捉，通過(guò)FasIII的表達(dá)模式中心細(xì)胞缺失，連接生殖細(xì)胞之間的融合體逐漸由樹(shù)杈狀變?yōu)辄c(diǎn)狀，CySCs和包囊細(xì)胞消失更進(jìn)一步的說(shuō)明細(xì)胞不受調(diào)控的增長(zhǎng)，形成生殖細(xì)胞腫瘤。S2細(xì)胞是果蠅中經(jīng)典的細(xì)胞模型，在果蠅S2細(xì)胞中敲減基因?qū)е录?xì)胞數(shù)目減少，抑制細(xì)胞增殖并加重細(xì)胞凋亡。最后，基因可能競(jìng)爭(zhēng)性地影響剪接體亞基的表達(dá)，已有證據(jù)表明剪接體復(fù)合物可能在無(wú)精癥和生殖細(xì)胞腫瘤中起關(guān)鍵作用[16]，使用種系干細(xì)胞模型將在未來(lái)的研究中進(jìn)一步評(píng)估。

綜上所述，本研究初步揭示了基因在果蠅睪丸生殖細(xì)胞中的生物學(xué)功能，基因是一個(gè)果蠅睪丸優(yōu)勢(shì)表達(dá)的生殖細(xì)胞作用因子，在生殖干細(xì)胞微環(huán)境中發(fā)揮重要的作用，主要影響生殖細(xì)胞的自我更新和分化過(guò)程。干涉效率驗(yàn)證篩選到siRNA片段，為制備RNAi果蠅提供靶向序列。而基因與剪接體亞基之間的競(jìng)爭(zhēng)性關(guān)系為未來(lái)的研究提供方向，為理解男性不育及睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的發(fā)病機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1] de Cuevas M, Matunis EL. The stem cell niche: lessons from thetestis., 2011, 138(14): 2861–2869.

[2] Fuller MT, Spradling AC. Male and femalestem cells: two versions of immortality., 2007, 316(5823): 402–404.

[3] Spradling A, Fuller MT, Braun RE, Yoshida S. Germline stem cells., 2011, 3(11): a002642.

[4] Chen DS, Zhu XX, Zhou LJ, Wang J, Tao XQ, Wang S, Sun FL, Kan XZ, Han ZQ, Gu YL. Gilgamesh is required for the maintenance of germline stem cells intestis., 2017, 7(1): 5737.

[5] Amoyel M, Anderson J, Suisse A, Glasner J, Bach EA. Socs36E controls niche competition by repressing MAPK signaling in thetestis., 2016, 12(1): e1005815.

[6] Yu J, Lan X, Chen X, Yu C, Xu YW, Liu YJ, Xu L, Fan HY, Tong C. Protein synthesis and degradation are essential to regulate germline stem cell homeostasis intestes., 2016, 143(16): 2930– 2945.

[7] Davies EL, Fuller MT. Regulation of self-renewal and differentiation in adult stem cell lineages: lessons from themale germ line.,2008, 73: 137–145.

[8] Roessler E, Ouspenskaia MV, Karkera JD, Vélez JI, Kantipong A, Lacbawan F, Bowers P, Belmont JW, Towbin JA, Goldmuntz E, Feldman B, Muenke M. Reduced nodal signaling strengthmutation of several pathway members including FOXH1 is linked to human heart defects and holoprosencephaly., 2008, 83(1): 18–29.

[9] Demarco RS, Uyemura BS, D'Alterio C, Jones DL. Mitochondrial fusion regulates lipid homeostasis and stem cell maintenance in thetestis., 2019, 21(6): 710–720.

[10] Chang YC, Tu H, Chen JY, Chang CC, Yang SY, Pi HW. Reproduction disrupts stem cell homeostasis in testes of aged malevia an induced microenvironment., 2019, 15(7): e1008062.

[11] Evans-Anderson HJ, Alfieri CM, Yutzey KE. Regulation of cardiomyocyte proliferation and myocardial growth during development by foxo transcription factors., 2008, 102(6): 686–694.

[12] Kiger AA, Jones DL, Schulz C, Rogers MB, Fuller MT. Stem cell self-renewal specified by JAK-STAT activation in response to a support cell cue., 2001, 294(5551): 2542–2545.

[13] Tulina N, Matunis E. Control of stem cell self-renewal inspermatogenesis by JAK-STAT signaling., 2001, 294(5551): 2546–2549.

[14] Zhang Z, Lv XD, Jiang J, Zhang L, Zhao Y. Dual roles of Hh signaling in the regulation of somatic stem cell self-renewal and germline stem cell maintenance intestis., 2013, 23(4): 573–576.

[15] Yu J, Yan YD, Luan XJ, Qiao C, Liu YY, Zhao D, Xie B, Zheng QW, Wang M, Chen WY. Srlp is crucial for the self-renewal and differentiation of germline stem cellsrpL6 signals intestes., 2019, 10(4): 294.

[16] Chen X, Luan XJ, Zheng QW, Qiao C, Chen WY, Wang M, Yan YD, Xie B, Shen C, He ZY, Zhang J, Liu MX, Hu X, Li H, Zheng B, Fang J, Yu J. Precursor RNA processing 3 is required for male fertility, and germline stem cell self-renewal and differentiationregulating spliceosome function intestes., 2019, 9(1): 9988.

[17] De Meyts ER, McGlynn KA, Okamoto DK, Jewett MAS, Bokemeyer C. Testicular germ cell tumours.,2016, 387(10029): 1762–1774.

[18] Yu J, Yan YD, Luan XJ, Qiao C, Liu YY, Zhao D, Xie B, Zheng QW, Wang M, Chen WY, Shen C, He ZY, Hu X, Huang XY, Li H, Shao QX, Chen X, Zheng B, Fang J. Srlp is crucial for the self-renewal and differentiation of germline stem cellsRpL6 signals intestes., 2019, 10(4): 294.

[19] Fairchild MJ, Smendziuk CM, Tanentzapf G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for drosophila spermatogenesis.,2015, 142(2): 268–281.

Functional analysis ofgene intestis

Wanyin Chen, Yidan Yan, Xiaojin Luan, Min Wang, Jie Fang

The processes of self-renewal and differentiation of germ cells are crucial to the development of male infertility and germ cell tumors.gene is one of the regulatory factors of the testicular germ stem cells in, and its functional mechanism is still unknown. To explore the biological function(s) ofgene in the germ cell niche oftestis, first, the UAS-gal4 system was used to drive the expression of UAS-RNAi intesticular germ cells and cyst cells. Fertility tests were then performed to determine the fertility rate of male flies. Second, the expression patterns of Vasa, IBI, Zn finger homeodomain 1 (Zfh1), eyes absent (Eya), DE-cad, FasIII and Phospho-Histone H3(PH3), and TUNEL were analyzed by immunofluorescence staining in both control andRNAi testes. Lastly, small interfering RNA (siRNA) was used to silence thegene expression inS2 cells; and PH3 was used to detect the proliferation ability ofS2 cells in the control group andsiRNA group. Apoptosis ofS2 cells was analyzed with TUNEL and flow cytometry. To observe the relative expression of the spliceosome, the mRNA levels of the spliceosome subunits were detected by fluorescence quantitative RT-PCR. As compared with the control group, the results showed that deletion of thegene in the germ cells and cyst cells of the testis reduced or even completely abolished the fertility of male fruit flies. In addition, nos-gal4 driven UAS-RNAi led to loss of fusomes and reduce the proliferative ability of germ cells. Noticeably, tj-gal4-directed UAS-RNAi knockdown ofgene in the testis led to germ cell tumor development. Knockdown ofgene inS2 cells resulted in increase in apoptosis and inhibition of proliferation. Further, the silencing of thegene inS2 cells caused increases in the mRNA levels of the spliceosome subunits. Hence,gene is essential for the self-renewal and differentiation of germ cells intestis. Its deletion may lead to restricted germ cell survival and the formation of germ cell-like tumors.gene can participate in the regulation of proliferation and apoptosis ofS2 cells, which is essential for the maintenance of cell life, and might competitively regulate the mRNA levels of spliceosome subunits.

;testis; germ cells; self-renewal and differentiation; proliferation and apoptosis

2020-06-01;

2020-08-11

鎮(zhèn)江市社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(編號(hào)：SH2018065)資助[Supported by the Zhenjiang Social Development Project(No.SH2018065)]

陳萬(wàn)銀，在讀碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向：婦科腫瘤。E-mail: 1031693689@qq.com

方杰，博士，副教授，主任醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤。E-mail: fangjie070@163.com

10.16288/j.yczz.20-163

https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20201106.0928.002.html

URI: 2020/11/9 10:25:56

(責(zé)任編委: 史慶華)