金花茶微觀結(jié)構(gòu)鑒別及活性成分分析

程金生　李舒雅　萬(wàn)維宏　曾雪琪

摘要：為開(kāi)展金花茶微觀結(jié)構(gòu)鑒別及活性成分分析，應(yīng)用掃描電鏡獲得金花茶微觀結(jié)構(gòu)信息，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析金花茶的活性成分。研究表明，由電鏡可以觀察到金花茶葉子氣孔都分布在葉下表皮，每一片小區(qū)域都由中心氣孔從圓心向外延伸，像孔雀開(kāi)屏狀，外緣角質(zhì)膜呈細(xì)條紋狀。金花茶花朵的細(xì)胞則呈長(zhǎng)圓形，棱角圓滑，排列聯(lián)系緊密呈網(wǎng)狀。花粉的形態(tài)一般呈長(zhǎng)球形，少數(shù)從不同角度觀察可看到近似呈三角形，有明顯的孔溝，溝均細(xì)長(zhǎng)。從金花茶花、葉的總離子圖中可觀察到金花茶葉子有33種活性成分，金花茶花朵則觀察到60種活性成分，與Nist譜庫(kù)匹配分析出金花茶富含醇和酚類物質(zhì)，還包括酯類、有機(jī)酸類等，其中兒茶酚、天然維生素E等有效成分具有清除自由基的能力。說(shuō)明金花茶葉、花微觀結(jié)構(gòu)各異，并含有豐富的活性成分。這些研究數(shù)據(jù)有望為金花茶綜合利用提供一定借鑒，提高金花茶附加值。

關(guān)鍵詞：金花茶;微觀結(jié)構(gòu);活性成分;分析

中圖分類號(hào)：S685.140.1?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）19-0221-04

收稿日期：2020-01-14

基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：2016A030307013、2019A1515011163）;2018國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（編號(hào)：201810576005X）。

作者簡(jiǎn)介：程金生（1976—），男，博士，副教授，主要研究方向?yàn)槭称芳八幬锓治?、天然藥物化學(xué)、納米醫(yī)學(xué)等。E-mail：86839680@qq.com。

通信作者：萬(wàn)維宏，碩士，高級(jí)工程師，主要從事試驗(yàn)設(shè)計(jì)、管理。E-mail：86839680@qq.com。

金花茶（Camellia chrysantha）是唯一一種花朵為金黃色又晶瑩透潤(rùn)的山茶科植物，因胡先嘯博士的鑒定而得名 [1]。1984年，金花茶被列入國(guó)家一級(jí)保護(hù)植物之一，同時(shí)與其他3種珍稀植物齊名，它們分別是銀杉、桫欏、珙桐。金花茶在國(guó)內(nèi)和國(guó)外都有著諸多美譽(yù)： “植物活化石”“茶族皇后”“幻想中的黃色山茶”等[2-3]。金花茶具有很高的藥用價(jià)值。近年來(lái)，學(xué)者對(duì)金花茶的科學(xué)項(xiàng)目研究愈來(lái)愈深入。一些研究者發(fā)現(xiàn)，金花茶富含許多對(duì)人體具有重要保健作用的有效成分，其中包括人類所必需的氨基酸和維生素、總皂苷、茶多酚類、齊墩果酸、黃酮類，還有微量元素等營(yíng)養(yǎng)性或藥用活性成分[4-6]。

截至目前，尚無(wú)對(duì)金花茶葉、花等部位系統(tǒng)的微觀結(jié)構(gòu)及活性成分的研究。尤其是對(duì)金櫻子花朵、花粉的微觀結(jié)構(gòu)及活性成分的分析，目前尚未見(jiàn)任何文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察了金花茶葉、花朵、花粉的微觀結(jié)構(gòu)，并通過(guò)GC-MS分析了金花茶葉、花朵中脂溶性活性成分，為金櫻子種核綜合利用提供了一定借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-1，紹興市嚴(yán)氏風(fēng)機(jī)有限公司）、電子天平（XY600-2CS，常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）、萬(wàn)分之一分析天平（DF22A，蘇州多賽電子天平有限公司）、高速多功能粉碎機(jī)（YB-2000A，浙江永康市速鋒工貿(mào)有限公司）、超細(xì)微粉粉碎機(jī)（FSJ-501，上海有建電子科技有限公司）、氣相色譜聯(lián)用儀[Agilent6890-5973，津工儀器科技（蘇州）有限公司]、紫外分光光度計(jì)（WFH-2038，上海精密科學(xué)儀器有限公司）、超聲波清洗器（KQ3200E，昆明市超聲儀器有限公司）、恒溫水浴鍋（HH-6，江蘇金壇市金城國(guó)盛實(shí)驗(yàn)儀器廠）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA RV8，上海亞榮生化儀器廠）、臺(tái)式掃描電鏡（TM3030，上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 主要試劑

防城港金花茶（南寧市田園之香食品店）、HF254硅膠（市售食品級(jí)，衡陽(yáng)市凱信化工試劑股份有限公司）、大孔樹(shù)脂（XAD-200，天津市海光化工有限公司），乙醚、乙醇、乙酸乙酯等試劑均為分析純（阿拉丁化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 試驗(yàn)地點(diǎn)及時(shí)間

試驗(yàn)地點(diǎn)：廣東省韶關(guān)市;試驗(yàn)時(shí)間：2018年11月至2019年6月。

1.4 主要研究方法

1.4.1 茶多酚浸提、濃縮和純化 采用超聲波輔助浸提技術(shù)提取金花茶茶多酚，超聲波浸提的頻率為180 W，浸提溫度為70 ℃，浸提20 min。將超聲后的金花茶浸提液置于70 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，蒸發(fā)濃縮后得到茶多酚的粗提液。用XDA-200大孔樹(shù)脂進(jìn)行茶多酚與雜質(zhì)的分離和純化。首先用95%的乙醇浸泡樹(shù)脂24 h;然后用去離子水漂洗至無(wú)醇味后用茶多酚的粗提液以2.5 BV/h的流速過(guò)柱，待粗提液的出口濃度達(dá)到進(jìn)口濃度的10%時(shí)，停止過(guò)柱，從而使大孔樹(shù)脂達(dá)到飽和狀態(tài);最后設(shè)置濃度梯度乙醇洗脫達(dá)到純化的效果，其濃度分別為10%和30%，過(guò)柱流速為2.5 BV/h，得到茶多酚純化液。

1.4.2 金花茶葉、花微觀結(jié)構(gòu)研究[7-8] 用掃描電鏡來(lái)觀察干燥后的金花茶的花朵和葉的微觀形態(tài)，以便觀察金花茶的組織結(jié)構(gòu)。將金花茶的花朵和葉都剪成適合的小片狀，放入機(jī)器內(nèi)，設(shè)置為真空狀態(tài)時(shí)觀察，并調(diào)整放大倍數(shù)與對(duì)焦，掃描出圖片。

1.4.3 金花茶活性成分GC-MS分析方法 氣相色譜柱程序升溫：第1步是從25 ℃的室溫以10 ℃/min 的速度來(lái)升溫，直到溫度升高到70 ℃為止，并在此溫度下保持2 min;第2步是將溫度升高到230 ℃，升溫速度為13 ℃/min;第3步是將溫度升高到280 ℃，升溫速度應(yīng)為5 ℃/min，當(dāng)溫度達(dá)到時(shí)在此溫度下保持12 min，并保持進(jìn)樣口和檢測(cè)器（FID）溫度均為250 ℃;分流比為50 ∶1，柱流量為1 mL/min，載氣為高純氮?dú)?。質(zhì)譜條件：高純氦氣，EI離子源，電離電壓70 eV;離子源溫度為250 ℃，傳輸線溫度為250 ℃;掃描范圍為35～500 amu;質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)為Nist譜圖庫(kù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 金花茶葉、花微觀結(jié)構(gòu)研究

分別對(duì)金花茶的葉、花等部位微觀形態(tài)進(jìn)行掃描電鏡觀察。由圖1-A可知，金花茶葉的顯微形態(tài)中，氣孔都分布在葉下表皮，每一片小區(qū)域都是由中心氣孔從圓心向外延伸，像孔雀開(kāi)屏狀，外緣角質(zhì)膜呈細(xì)條紋狀，在氣孔周圍無(wú)規(guī)則地連接著中心氣孔以及包圍著周圍的氣孔。從圖1-B可以看出，角質(zhì)膜呈條紋狀同時(shí)有些許的顆粒感。氣孔器由2個(gè)像月牙的細(xì)胞構(gòu)成，氣孔大多數(shù)呈橢圓形，表面平滑。從圖1-C、圖1-D可以看出，花朵的細(xì)胞呈長(zhǎng)圓形，棱角圓滑，排列聯(lián)系緊密呈網(wǎng)狀，外側(cè)由較粗的條紋狀連接，內(nèi)側(cè)為較細(xì)的條紋狀無(wú)規(guī)則的排列。從圖1-E、圖1-F可以看出，花粉的形態(tài)一般呈長(zhǎng)球形，少數(shù)從不同角度觀察可看到近似呈三角形;有明顯的孔溝，溝均為細(xì)長(zhǎng)，有些張開(kāi)呈梭狀，外壁飾紋為穴狀飾紋。綜合上述的微觀結(jié)構(gòu)分析可知，金花茶花、葉、花粉組織結(jié)構(gòu)聯(lián)系比較緊密，細(xì)胞多呈類球狀，能承受較大程度上的物理研磨，且其飾紋結(jié)構(gòu)單一，表面一般較光滑，在一定程度上會(huì)削弱外力的作用，因此在萃取活性成分時(shí)若僅靠機(jī)械研磨來(lái)使其內(nèi)容物溶于提取劑的方法是不夠理想的。所以先經(jīng)過(guò)多功能粉碎機(jī)研磨后再用超聲波萃取，能在一定程度上增加內(nèi)容物的流出并更易溶于提取劑中。

2.2 金花茶活性成分的GC-MS分析

利用上述試驗(yàn)方法對(duì)金花茶活性成分進(jìn)行GC-MS 分析，其中定性分析是通過(guò)人工圖譜解析與Nist譜圖庫(kù)檢索，來(lái)確定活性成分的種類。定量分析則是使用面積歸一化法，來(lái)確定活性成分的含量，得出匹配率最高的化學(xué)成分及各成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)?；钚猿煞值奶崛》椒ǎ簩⒔鸹ú璧娜~經(jīng)多功能粉碎機(jī)粉碎后，按料液比為1 g ∶3 mL的比值加入甲醇，為了能充分溶出活性物質(zhì)需用超聲波處理3 h，超聲波的頻率設(shè)為80 W，超聲后過(guò)濾得到甲醇提取液，將甲醇提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)濃縮，最后將試驗(yàn)所提取的濃縮液置于真空干燥箱中干燥12 h，溫度設(shè)置為40 ℃，得到其有效成分的萃取物。金花茶的花朵也用同樣的方法處理。

圖2為在上述條件下得出的金花茶葉的總離子圖，共檢測(cè)出33種活性成分，其中可與Nist譜庫(kù)匹配識(shí)別的活性物質(zhì)有3-甲基戊烷、異戊酸、N-甲基吡咯烷酮、鄰苯二酚、4-乙烯基-2-甲氧基、苯酚、2，4-二甲氧基芐醇、十五烷酸、4-異丁基苯酚、1，1′-聯(lián)-2-萘酚、4-甲基兒茶酚、天然維生素E、蝦青素（表1）。

圖3是在上述條件下得出的金花茶花朵的總離子圖，共檢測(cè)出60種活性物質(zhì)，其中可與Nist譜庫(kù)匹配識(shí)別的活性物質(zhì)有糠醇、縮水甘油、甲基呋喃醛、苯酚、（S）-（-）-檸檬烯、環(huán)丁烷、甲基草甘膦、3-辛炔-1-醇、2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、3-甲基-2，3，4，5-四氫-2，4-呋喃二酮、（S）-（+）-檸蘋酸、丁酸辛酯、1，6-脫水吡喃葡萄糖、對(duì)羥基苯甲酸、月桂酸、十五烷酮、鄰苯二甲酸二異丁酯、反式-2-十二烯酸、十二烷二醇、正十五酸、順式-十八碳烯酸、反油酸乙酯、豆固醇等（表2）。

3 結(jié)論

金花茶的組織結(jié)構(gòu)聯(lián)系緊密，應(yīng)先經(jīng)過(guò)多功能粉碎機(jī)研磨后再用超聲波萃取，能在一定程度上增加內(nèi)容物的流出并更易溶于提取劑中，有利于后續(xù)制粒的操作步驟。在GC-MS分析中，金花茶葉子可檢測(cè)出33種活性成分，而花朵可檢測(cè)出60種活性成分，其中包括一些具有較好抗氧化作用的有效成分，如兒茶酚、天然維生素E等，有望作為抗氧化制劑的良好原料。

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