全基因組預(yù)測哈茨木霉的效應(yīng)子

羅 梅，陳欣瑜,2，董章勇,2*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物健康創(chuàng)新研究院，廣東 廣州 510225)

【研究意義】哈茨木霉(Trichodermaharzianum)是木霉菌的一種，屬半知菌類(Fungi imperfecti)，絲孢綱(Hyphomycetes)，叢梗孢目，叢梗孢科，是一種目前廣泛應(yīng)用的重要生防菌。該屬廣泛分布于全球，在土壤及有機質(zhì)上均可發(fā)現(xiàn)[1]。哈茨木霉報道能夠與長孺孢屬(Helmisporiumspp.)、核盤菌屬(Sclerotiniaspp.)、輪枝孢屬(Verticilliumspp.)、黑星菌屬(Venturiaspp.)、蜜環(huán)菌屬(Armillariaspp.)、鐮刀菌(Fusariumspp.)、腐霉菌(Pythiumspp.)、疫霉菌(Phytophthoraspp.)、絲核菌(Rhizoctoniaspp.)、炭疽菌(Colletotrichumspp.)等多種植物病原菌競爭生長空間和營養(yǎng)物質(zhì)[2-4]，且能分泌產(chǎn)生一些抑菌物質(zhì)，具有重寄生作用，并可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性[5-7]。因此，其菌劑被廣泛應(yīng)用在植物病害的防治上[6-7]。以色列的哈茨木霉T39和美國T22 菌株等均已經(jīng)登記使用在多種植物病害的防治上?！厩叭搜芯窟M展】效應(yīng)子(effector)也稱效應(yīng)因子或效應(yīng)蛋白，廣義上是指能夠選擇性地結(jié)合其他目標蛋白及調(diào)節(jié)其生物活性的一類小分子蛋白。隨著對效應(yīng)子的研究，有學(xué)者凝煉出其具體的分析指標：①含有N-端信號肽；②無跨膜結(jié)構(gòu)域；③定位于細胞質(zhì)；④序列具有特異性；⑤富含半胱氨酸；⑥重復(fù)元件多；⑦氨基酸殘基數(shù)量大約在50～300 氨基酸[8-9]。哈茨木霉菌株的基因組測序的完成為高通量篩選效應(yīng)子提供前提。許僖等[10]根據(jù)哈茨木霉T677菌株的基因組預(yù)測了其分泌蛋白，但并未進行效應(yīng)子的分析。【本研究切入點】本研究在已公布的哈茨木霉CBS 226.95菌株全基因組信息的基礎(chǔ)上，根據(jù)效應(yīng)子的典型特征，利用生物信息學(xué)軟件對其候選效應(yīng)子進行了預(yù)測?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究結(jié)果為哈茨木霉效應(yīng)子的進一步篩選與驗證提供了重要的理論依據(jù)，并為探究效應(yīng)子在生防菌與病原菌互作過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基因組信息

哈茨木霉CBS 226.95菌株的蛋白序列從NCBI上下載，具體網(wǎng)址為：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/003/025/095/GCF_003025095.1_Triha_v1.0/GCF_003025095.1_Triha_v1.0_protein.faa.gz。該基因組共包含了14 065個蛋白序列(INSDC: MBGI00000000.1)。

1.2 分泌組蛋白預(yù)測

將14 065個蛋白序列先經(jīng)過SignalP v4.1分析；隨后將有信號肽的蛋白進一步用TMHMM v2.0進行分析，選取跨膜結(jié)構(gòu)域小于2 的蛋白；進一步用TargetP v1.1進行分析，篩選定位在胞外的蛋白；然后用ProtComp v9.0進行分析亞細胞定位。

1.3 分泌組蛋白序列分析

將1.2分析結(jié)果進行序列長度統(tǒng)計分析。

1.4 分泌組蛋白的半胱氨酸含量和multiple tandem repeats分析

將1.2分析結(jié)果的蛋白序列進行半胱氨酸數(shù)量及multiple tandem repeats分析。半胱氨酸數(shù)量采用perl工具進行計算。將具有高半胱氨酸的 (≥6) 的蛋白序列進行multiple tandem repeats分析。multiple tandem repeats采用T-Reks (http://bioinfo.montp.cnrs.fr/?r= t-reks/)進行預(yù)測。

1.5 候選致病相關(guān)效應(yīng)因子的確定

一般的效應(yīng)子都是小分子蛋白，因此，將1.4獲得的蛋白序列去除大于300個氨基酸的蛋白序列，剩余的為候選效應(yīng)子。將獲得的蛋白序列和PHI數(shù)據(jù)庫(Pathogen-Host Interaction database，http://www.Phi-bas e.org/downloadLink.htm)進行比對分析，分析其可能的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 分泌組蛋白預(yù)測

將14 065個哈茨木霉蛋白序列用SignalP v4.1進行分析，共獲得1288個蛋白具有信號肽；隨后進一步用TMHMM v2.0進行跨膜結(jié)構(gòu)分析，跨膜結(jié)構(gòu)域小于2的共有1186個蛋白；將這1186個蛋白用TargetP v1.1進行定位分析，共得到1138個蛋白在胞外表達；再進一步用ProtComp v9.0進行分析，得到709個蛋白。這709個蛋白為哈茨木霉CBS226.95菌株的分泌蛋白，占總蛋白的5.04 %。

2.2 分泌組蛋白序列分析

將709個蛋白氨基酸殘基序列特征進行分析，獲得序列長度統(tǒng)計數(shù)據(jù)(perl程序)。小于200個氨基酸的有199個，占28 %；201～400個氨基酸的有275個序列，占39 %；401～600個氨基酸的有149個序列，占21 %；601～800個氨基酸的有57個序列，占8 %；801～1000個氨基酸的有23個序列，占3 %；大于1000個氨基酸殘基的有6個序列，占1 %；沒有大于2000個氨基酸殘基的序列(圖1)。

圖1 709個哈茨木霉分泌蛋白的長度統(tǒng)計分析Fig.1 Sequence length statistics of 709 Trichoderma harzianum secretome genes

2.3 分泌組蛋白的cysteine含量和multiple tandem repeats分析

將709個蛋白序列進行cysteine含量及multiple tandem repeats分析。Cysteine含量采用perl工具進行計算。得到396個具有高cysteine含量的 (≥6) 的蛋白。其中6個半胱氨酸的有93個序列，占23.5 %，其次為8個半胱氨酸，有72個序列，占18.2 %；再次為7、10個，分別為45和47個，占11.4 %和11.9 %；其中1個序列(XP_024772708.1)擁有98個半胱氨酸位點(圖2)。

圖2 396個哈茨木霉分泌蛋白的半胱氨酸殘基數(shù)量分布Fig.2 Number of cysteine residues of the 396 Trichoderma harzianum secretome genes

將396個具有高cysteine含量的 (≥6) 的蛋白序列進行multiple tandem repeats分析。multiple tandem repeats采用T-Reks (http://bioinfo.montp.cnrs.fr/?r=t-reks/)進行預(yù)測。得到86個蛋白具有multiple tandem repeats (≥9)。

2.4 候選致病相關(guān)效應(yīng)因子的確定

一般效應(yīng)因子都是小分子蛋白，因此，將上述獲得的86個基因序列進行長度篩選，去除大于300個氨基酸的蛋白序列。剩余24個基因序列，被認為是候選致病相關(guān)效應(yīng)因子(表1)。其中有3個是碳水化合物結(jié)合模塊家族蛋白(carbohydrate-binding module family protein)，其余21個為假定蛋白。在PHI數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示，其中9個蛋白可能跟真菌的毒力相關(guān)(reduced virulence)，3個為效應(yīng)子(effector)，2個蛋白是致死蛋白(lethal)，6個為非致病相關(guān)(Unaffected pathogenicity)，1個蛋白為功能未知，1個蛋白為混合型(可能為非致病相關(guān)或引起毒力減弱)。

表1 哈茨木霉候選效應(yīng)因子

續(xù)表1 Continued table 1

3 結(jié)論與討論

分泌的胞外蛋白除了作為效應(yīng)子參與侵染寄主過程外，還可以作為毒力因子或者毒素改變寄主細胞的結(jié)構(gòu)或者功能，或者作為無毒因子或者激發(fā)子引發(fā)寄主防衛(wèi)反應(yīng)[11-12]。本研究通過對哈茨木霉CBS 226.95菌株的14 065個蛋白進行分析，共分析得到709個分泌蛋白，占總蛋白的5.04 %。而許僖等[10]根據(jù)哈茨木霉T677菌株基因組的11 498個蛋白中共分析得到分泌蛋白503個，占總蛋白的4.37 %。不同的植物真菌所含分泌蛋白占的比列不同，多數(shù)半活體營養(yǎng)型和死體營養(yǎng)型真菌編碼的分泌蛋白占總基因的比例高于活體營養(yǎng)型真菌[13]。本研究分析到的分泌蛋白的比例比許僖等[10]分析的略高，可能2個菌株來源不一樣的差異引起的。

本研究基于哈茨木霉CBS 226.95菌株基因組共篩選獲得24個效應(yīng)子，其中有3個是碳水化合物結(jié)合模塊家族蛋白(carbohydrate-binding module family protein，CBM)，其余21個為假定蛋白。雖然通過PHI數(shù)據(jù)庫對其功能進行了初步的注釋，但是相應(yīng)蛋白在哈茨木霉的具體功能還需要進一步進行確認。3個碳水化合物結(jié)合模塊家族蛋白中有1個是CBM50 亞家族，2個是CBM1亞家族。CBM作為碳水化合物酶類的一大類，在真菌的作用機制上發(fā)揮了重要作用。其中CBM50亞家族屬于CBM的一個亞家族，通常結(jié)合糖基水解酶家族(glycoside hydrolases，GH)發(fā)揮降解幾丁質(zhì)或者肽聚糖的作用(http://www.cazy.org/CBM50.html)。柳少燕等[14]分析表明拮抗菌中的CBM50相比病原菌來說可能發(fā)生了顯著的擴增，且有部分拮抗菌中的CBM50蛋白單獨聚為一支。本研究所分析獲得的CBM50亞家族基因具有1個LysM結(jié)構(gòu)域。LysM結(jié)構(gòu)域最早是在芽孢桿菌噬菌體溶菌酶中被發(fā)現(xiàn)其通過降解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的糖苷鍵來降解細胞壁[15]。LysM結(jié)構(gòu)域偏好出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的N端和C端，在中心位置出現(xiàn)較少[16]。本研究所分析的CBM50蛋白的LysM結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)在C端。由于拮抗菌與病原菌的細胞組分相似，拮抗菌需要解決如何識別“自我”與“非我”并避免自身受到影響的關(guān)鍵問題。LysM結(jié)構(gòu)域作為一類古老而又普遍存在的結(jié)構(gòu)域，對該類結(jié)構(gòu)域的研究有助于揭示拮抗真菌、病原真菌及植物防御之間的復(fù)雜聯(lián)系。Chen等[25]報道效應(yīng)子LysM幫助逃避昆蟲的免疫防御而致病昆蟲。

隨著基因組學(xué)以及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，大數(shù)據(jù)分析成為現(xiàn)代生物學(xué)研究的重要研究手段之一[10, 17-19]。通過高通量的方法進行效應(yīng)子的篩選，雖然可能不完全，但可以大大的縮小研究范圍，找到研究的切入口。而本研究篩選到的潛在的效應(yīng)子在哈茨木霉的拮抗作用以及在植物環(huán)境中的作用還需要進行進一步的功能研究才能得以驗證。