李天才，趙晴云，江 瑞，付 梅，蘇勝齊*

(1.西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶 400700；2.西南大學(xué)漁業(yè)資源環(huán)境研究中心，重慶 400700；3.雅礱江流域水電開發(fā)有限公司，四川 成都 610000)

【研究意義】隨著漁業(yè)養(yǎng)殖集約化程度的不斷提升，高密度投飼精養(yǎng)池塘中殘餌糞便在塘泥中持續(xù)累積使得營養(yǎng)物質(zhì)不斷升高[1-2]，最終造成水體富營養(yǎng)化、氨氮中毒、疾病爆發(fā)等系列養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)健康問題也越來越顯著[3]。采用藥物對塘泥進行改良、改造只是暫時性措施，生態(tài)調(diào)節(jié)才是解決問題的可持續(xù)手段。因此，研究池塘生態(tài)系統(tǒng)中塘泥微生物群落特征具有非常重要的意義。【前人研究進展】塘泥微生物不僅是池塘生態(tài)系統(tǒng)的組成部分，也是生態(tài)修復(fù)的功能菌庫[4]，其在生長繁殖過程可消耗有機質(zhì)，同時產(chǎn)生的多種酶是有機質(zhì)分解的催化劑[5]，甚至可直接同化或降解有毒、有害物質(zhì)[6]。塘泥微生物雖對環(huán)境修復(fù)有積極作用，但也常常是水產(chǎn)品的病原菌或條件致病原庫[4]，甚至部分種類會直接降低水產(chǎn)品品質(zhì)[7]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中占據(jù)著特殊的地位。紫色土形態(tài)獨特，肥力豐富，是我國重要的農(nóng)業(yè)土壤資源[8]。四川盆地集中分布著我國51.53 %面積的紫色土[8]，其中四川盆地中的川渝地區(qū)是我國重要的池塘養(yǎng)殖區(qū)域，池塘的建造基本以紫色土為基礎(chǔ)。目前關(guān)于紫色土的研究多集中于肥力、水土保持等方面[9-11]，而對紫色土池塘生態(tài)系統(tǒng)的研究目前較少?！颈狙芯壳腥朦c】本試驗以蓬萊鎮(zhèn)組微堿性紫色土為底質(zhì)模擬紫色土池塘養(yǎng)殖過程，測定春、夏和秋季塘泥環(huán)境因子，鑒定塘泥微生物種類，旨在解析紫色土塘泥微生物群落特征及其與環(huán)境因子之間的關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為紫色土池塘“泥—水”相調(diào)控提供依據(jù)和指導(dǎo)，同時為深入開展不同紫色土的宜漁性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗系統(tǒng)構(gòu)造

試驗用紫色土取自大足區(qū)重慶市大足區(qū)(N 29.7264°，E 105.9689°)，分類上屬蓬萊鎮(zhèn)組(J3s)，取土?xí)r將表層土壤刨去，挖取風(fēng)化而未經(jīng)耕作的0～20 cm土壤。把50 kg紫色土轉(zhuǎn)入不透明水族缸(豎切面為梯形，r1= 30 cm，r2= 40 cm，h=80 cm)中，加入曝氣自來水，土水比為1∶5[12]，土層厚12 cm[13]，覆水60 cm。每缸放養(yǎng)全長(69.7±1.2) mm的湘云鯽7尾[14][尾均重為(9.57±0.08) g]，每天投喂3 %體重飼料，設(shè)置3個重復(fù)，水族缸充氧，每月22日換水1/3。系統(tǒng)設(shè)置在室外有頂通風(fēng)平臺下。試驗進行時間為2016年4月10日至9月22日，為期160 d，分別于5月22日、7月22日、9月22日使用柱狀采泥器收集塘泥樣本，將原始紫色土和試驗收集的3組樣品分別編號為S0、春、夏和秋。

1.2 塘泥環(huán)境因子測定方法[15]

溫度：每天傍晚直接用溫度計測定塘泥溫度；pH：水土比為2.5∶1混合后使用phs-3c型pH計測量；氧化還原電位(O.R.P)：塘泥樣本取出后迅速用O.R.P計直接測量。

取回的塘泥先陰干，之后進行碾磨并過0.25 mm篩網(wǎng)，收集100 g塘泥粉末用于測定營養(yǎng)成分。有機質(zhì)、TN、TP、TK分別采用重鉻酸鉀法、重鉻酸鉀-硫酸消化法、氫氧化鈉堿熔-鉬銻抗比色法、火焰光度法進行測定。

1.3 塘泥微生物培養(yǎng)與鑒定方法

微生物(指好氧或兼性厭氧微生物，下同)培養(yǎng)：挑取0.5 g塘泥37 ℃溶解于0.9 % NaCl溶液中制成2.5·10-4g/mL塘泥混合液，吸取0.5 mL混合液涂布于LB培養(yǎng)基上[16]，設(shè)置3個重復(fù)，37 ℃無光培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計菌落數(shù)n[17]。

微生物總DNA提取[18]：稱取1 g土樣與提取液于5 mL離心管中渦旋混合，之后迅速至于-81 ℃冷凍30 min，取出并65 ℃水浴融化，如此反復(fù)進行裂解3～5次；加入8 μl蛋白酶K(25 mg/mL)，于37 ℃搖床上震蕩30 min(225 r/min)；加入1.5 mLSDS(200 g/L)，65 ℃水浴2 h，每15 min左右顛倒混勻；微微離心(20 g，20 s)后將液相轉(zhuǎn)入新的5 mL離心管中繼續(xù)室溫離心10 min(6000 g)；土樣繼續(xù)加入提取液和0.5 mL SDS，渦旋混合后65 ℃水浴10 min，接著室溫離心20 min(6000 g)，上清液與前次上清液合并；上清液加入等體積氯仿-異戊醇(24∶1)進行抽提，之后室溫離心5 min(6000 g)；將液相轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，加入0.6體積異丙醇后室溫沉積1 h，之后再進行室溫離心10 min(10 000 g)收集核酸；用冷的700 mL/L乙醇洗滌沉淀，吹干，溶于50 μl滅菌超純水中， -20 ℃保存。

PCR[16]：于冰上向PCR管中加入40.5 μl去離子水、5 μl 10×PCR反應(yīng)緩沖液、1 μl模板、1 μl核酸、2 μl上下游引物(V3V4引物：341F 5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′,806R 5′-GGACNNGGGTATCTA AT-3′)、0.5 μlTaq-DNA聚合酶后渦旋混合；設(shè)置94 ℃預(yù)變性2 min，97 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，30輪循環(huán)，最后1循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。

檢測條帶：取10 μl擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，若無條帶則調(diào)節(jié)PCR反應(yīng)條件或再次提取微生物總DNA，直至檢測出現(xiàn)條帶。

高通量測序：樣品委托深圳市恒創(chuàng)基因科技有限公司代為進行高通量測序(Illumina MiSeq測序平臺)工作。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

微生物密度公式C=8n×103cfu/g使用SPSS19.0軟件對獲得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Duncan多重比較法檢驗組間差異，設(shè)置重復(fù)的處理以均值(E±SD)為結(jié)果，在Excel2016軟件中制作圖表；塘泥微生物群落特征與環(huán)境因子之間的關(guān)系使用CANOCO4.5軟件進行分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 塘泥環(huán)境因子

由表1可知，塘泥溫度春季最低，夏季最高，總體在19.3～33.4 ℃；塘泥試驗初期由堿性快速轉(zhuǎn)變?yōu)橹行裕蟠?、夏、秋季均穩(wěn)定在7.09～7.20；塘泥O.R.P持續(xù)升高，但始終保持強還原性；塘泥有機質(zhì)、TN、TP、TK等營養(yǎng)成分含量均呈升高趨勢。綜合比較，夏、秋季塘泥環(huán)境因子數(shù)值相近，與春季差異較大。

2.2 塘泥微生物群落特征季節(jié)變化

2.2.1 塘泥微生物群落多樣性季節(jié)變化 由表2可知，春季塘泥微生物密度顯著高于夏季和秋季(P<0.05)，分別為2.954×106、1.587×106和1.504×106cfu/g；春、夏、秋季3次取樣過程中，塘泥Shannon、Chao和Observed species等群落多樣性指數(shù)均持續(xù)升高，而塘泥Simpson Index和Pielou Index多樣性指數(shù)夏季均為最低，但均接近于1。

2.2.2 塘泥中微生物門類季節(jié)變化 經(jīng)取樣測序分析，春、夏、秋季塘泥中分別包括33、42、41門微生物，共歸屬44門，其平均豐度前15的門類占總微生物比例超過94.0 %。由圖1可知，在春、夏、秋季塘泥中變形菌門和擬桿菌門均為優(yōu)勢門類；酸桿菌門、梭菌、厚壁菌門和疣微菌門均為大量(大于1 %)微生物門類；綠彎菌門、Elusimicrobia、螺旋體、Latescibacteria、芽單胞菌門和纖維桿菌門等微生物門類在各季節(jié)豐度變化幅度較大；Saccharibacteria、硝化螺旋菌門和放線菌等3個微生物門類在各季節(jié)豐度均低于1.0 %。不同季節(jié)塘泥中優(yōu)勢和大量微生物門類相似。

2.2.3 塘泥中豐富前10微生物屬季節(jié)變化 對春、夏、秋3個樣本中塘泥微生物進行屬級統(tǒng)計分析，并將不同季度占比前10的屬繪制成圖2。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，3個樣本中共檢測到2783種微生物(OUTs)，其中大多數(shù)為尚未定義或研究的類群，可分類到屬的共有323屬，可分類到種的共有76種。由圖2可知，不同季度占比前10的屬共包括16個屬；未培養(yǎng)的腐螺旋菌科、噬氫菌屬、Draconibacteriaceae-uncultured和未培養(yǎng)的芽單胞菌科在春、夏、秋季占比均在前10之列；2個季節(jié)中占比均在前10之列的屬數(shù)量：春季和夏季有5個、春季和秋季有6個、夏季和秋季有8個。不同季節(jié)塘泥中占比前10的微生物屬差異明顯，相同的屬在不同季節(jié)占比也十分不同。

表1 塘泥環(huán)境因子季節(jié)變化

表2 塘泥微生物群落多樣性季節(jié)變化

圖1 塘泥中微生物門類季節(jié)變化(%)Fig.1 Accounted for the phylum taxa abundance of the pond mud in different season at phylum level

2.2.4 塘泥中功能微生物季節(jié)變化 在池塘養(yǎng)殖過程中，許多微生物對漁業(yè)生產(chǎn)有其獨特的功能和作用，于生產(chǎn)有利的可歸為益生菌，而不利的則可歸為有害菌。由表3可知，春、夏、秋季塘泥中出現(xiàn)益生菌包括硝化菌和放線菌，有害菌包括黃桿菌、腸桿菌、氣單胞菌和假單胞菌；硝化菌和放線菌在春、夏、秋季塘泥中均有一定豐度，夏季塘泥中兩種益生菌占比均為最高，春季均最低；春季塘泥中4種有害菌占比均大于0.01 %，夏季塘泥中前3種有害菌占比大于0.01 %，秋季塘泥中僅有黃桿菌和氣單胞菌占比大于0.01 %。

對主要微生物屬編號，以便下文RDA分析作圖Numbered the main genus for RDA analysis and plotting圖2 塘泥中主要微生物屬比例季節(jié)變化(%)Fig.2 Accounted for the genus taxa abundance of the pond mud in different season at genus level

2.3 塘泥微生物群落與環(huán)境因子的關(guān)系

在復(fù)雜情況下，微生物種群與多個環(huán)境因子之間的關(guān)系常使用Canoco軟件進行多元統(tǒng)計分析，該軟件可以對環(huán)境因子和群落信息進行綜合分析并分別指出它們間的相互關(guān)系[19]。

2.3.1 塘泥微生物群落多樣性與環(huán)境因子的關(guān)系 由圖1可知(Lengths of gradient<3)，微生物密度與塘泥環(huán)境因子均呈負(fù)相關(guān)性，O.R.P、SOM、TN和AP與微生物群落多樣性呈較強的相關(guān)性，其它環(huán)境因子則較弱。由Canoco分析數(shù)據(jù)表明，僅SOM(-0.90)、TP(-0.87)和AP(-0.94)與第一排序軸相關(guān)性系數(shù)絕對值大于0.85，即在春、夏、秋季中塘泥SOM、TP和AP是影響微生物群落多樣性的主要環(huán)境因子，且與微生物密度呈顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.05)。

2.3.2 塘泥中微生物與環(huán)境因子的關(guān)系 由圖2可知(Lengths of gradient<3)，春、夏、秋季分別位于3個象限且距離較遠(yuǎn)，表明塘泥微生物群落季節(jié)差異十分明顯，而夏和秋季距離相對最近即塘泥微生物群落結(jié)構(gòu)相似性相對較高。從Canoco分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，僅T(0.87)、pH(0.89)和AP(0.86)與第一排序軸相關(guān)性系數(shù)絕對值大于0.85，即在春、夏、秋季中塘泥T、pH和AP是影響群落中豐度較高微生物分布的主要環(huán)境因子，而不同微生物與主要環(huán)境因子關(guān)系各有不同，總體上顯著負(fù)相關(guān)的微生物種類較多(Fluviicola、噬氫菌屬、Fluviicoccus、Lacibacter和env.OPS17，P<0.05)，顯著正相關(guān)的微生物種類較少(Hados.Sed.Eubac.3和硝化螺菌屬，P<0.05)。在春、夏、秋季中益生菌均與環(huán)境因子呈正相關(guān)性，有害菌中除腸桿菌屬與環(huán)境因子呈正相關(guān)性外，其它3種均與環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)性，且與主要環(huán)境因子顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。益生菌與夏季距離最短，與春季距離最長，表明夏季益生菌豐度較高，春季最低；總體上有害菌與春季距離最小，即春季有害菌豐度最高。

表3 塘泥中功能微生物比例季節(jié)變化

圖3 塘泥微生物群落多樣性與環(huán)境因子RDA分析Fig.3 Redundancy analysis (RDA) of seasonal variations of the microbial community diversity index with environmental factors

3 討論與結(jié)論

塘泥中營養(yǎng)物質(zhì)主要來自沉積和化能自養(yǎng)生物合成，而在養(yǎng)殖池塘中投飼殘餌、水產(chǎn)品排泄物和生物體沉積更為顯著，這是導(dǎo)致池塘塘泥營養(yǎng)物質(zhì)不斷增加的主要原因[20-21]。試驗中，春夏季期間營養(yǎng)物質(zhì)劇增，而夏秋季變化不顯著，這可能是因為春夏期間氣溫低且變化幅度大，魚攝食不積極且塘泥微生物和相關(guān)分解酶活性相對較低，導(dǎo)致殘餌大量沉積，而夏秋期間則氣溫較高，魚攝食積極且微生物和相關(guān)酶活性較高，使得沉積物變化不顯著。水體有機質(zhì)分解會大量消耗塘泥間隙和底層水的溶解氧，致使塘泥和底層水轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬醯倪€原環(huán)境，在這種條件下有機質(zhì)分解往往產(chǎn)生有機酸和無機酸，導(dǎo)致塘泥酸化，pH降低[13]。故而在養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖戶常向池塘投放生石灰以調(diào)節(jié)酸堿度。張金宗等[22]在研究廣東增城的池塘發(fā)現(xiàn)塘泥厚度以年均10～15 cm速度升高，這部分新增的淤泥含大量養(yǎng)殖殘餌、營養(yǎng)成分豐富，可在清塘過程中將此收集、曬(烘)干并加工成有機肥料[23]。

塘泥營養(yǎng)物質(zhì)的變化受微生物及其分泌酶的影響，而微生物群落結(jié)構(gòu)也受到營養(yǎng)物質(zhì)在內(nèi)的環(huán)境因子的作用，通常微生物生長對養(yǎng)分的需要求始終趨向于較高的C、N、P含量[24]。這與試驗中Shannon、Chao、Observed species等多樣性指數(shù)均隨塘泥有機質(zhì)含量增大而升高現(xiàn)象相符。進一步分析發(fā)現(xiàn)環(huán)境因子中SOM、TP和AP對塘泥微生物群落多樣性綜合影響達到顯著，即在紫色土池塘中SOM、TP和AP是塘泥微生物群落多樣性的主要環(huán)境影響因子。試驗中培養(yǎng)的微生物密度逐季下降，即好氧或兼性微生物在塘泥中漸漸消亡，這表征出塘泥間隙和底層水環(huán)境中氧氣越來越低。所以在養(yǎng)殖過程中需注意天氣變化導(dǎo)致水層對流，避免底層水上升導(dǎo)致魚缺氧或中毒。主要及功能微生物屬與環(huán)境因子冗余分析發(fā)現(xiàn)，塘泥微生物群落差異表現(xiàn)為春季與夏、秋季間明顯，而夏、秋季間趨小，環(huán)境因子差異表現(xiàn)類似差異，這充分說明環(huán)境因子是微生物群落的影響因素，不同環(huán)境下相同微生物種群的豐度可能不同。本試驗表明溫度、pH和AP是影響塘泥主要微生物類群和功能微生物的主要因素，但這并不意味該4種環(huán)境因子一定是影響所有微生物的主要因素，同時其它環(huán)境因子仍然可能是影響某些微生物的主要因素[25]。從圖4可知，其它4種非主要環(huán)境因子與數(shù)種微生物屬之間的相關(guān)性同樣顯著。

圖4 塘泥微生物與環(huán)境因子的RDA分析Fig.4 Redundancy analysis (RDA) of pond mud microbial communities with environmental factors

研究[26-27]表明，硝化螺菌、亞硝化單胞菌和硝化螺旋菌等在底泥中仍可進行硝化作用，將氮素轉(zhuǎn)化為易溶解和利用的NO3-N。試驗中，硝化細(xì)菌與塘泥中TN含量變化趨勢一致，可能是與含氮有機物含量升高引起硝化細(xì)菌大量繁殖并將其氧化分解有關(guān)，這有利于池塘底泥的修復(fù)和緩沖能力的增強。放線菌在漁業(yè)養(yǎng)殖系統(tǒng)中可以起到一定的抑制致病微生物滋生和改善水質(zhì)的功能[28-29]。黃桿菌屬包括多種魚類致病細(xì)菌，其中柱狀黃桿菌可使幾乎所有淡水魚類感染柱形病[30]，病魚將呈現(xiàn)爛鰓、體表潰瘍、組織壞死及鰭條腐爛等癥狀，致死率幾乎達100 %，具有極高危害性。陳霞等[31]還指出柱狀黃桿菌易致病溫度溫度為25～30 ℃，幾乎完全覆蓋試驗過程中塘泥溫度區(qū)間，這提示紫色土池塘養(yǎng)殖過程中應(yīng)加強柱狀黃桿菌潛在致病管理。陰溝腸桿菌和阪崎腸桿菌是腸桿菌屬中常見的魚類致病菌，研究指出[32-33]該 2 種微生物也是人畜的致病原，可導(dǎo)致多種嚴(yán)重疾病，故而需對其進行嚴(yán)格管理，避免感染人畜。氣單胞菌屬隸屬于弧菌科，含多種可感染水產(chǎn)品的病原微生物，其中嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、溫和氣單胞菌等危害尤為顯著，可單獨或混合造成草魚腸炎、鰱打印病、鰱白皮病、草魚爛鰓、鰱出血感染及甲魚敗血癥等疾病，在預(yù)防和治療過程中應(yīng)注意精確診斷，聯(lián)合使用預(yù)防治療藥物[34]。銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌是假單胞菌屬在環(huán)境中常見的致病微生物，常造成赤皮病和爛鰓病，而沈錦玉等[35]研究指出惡臭假單胞菌還可造成網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚脾、腎臟出現(xiàn)大量白色結(jié)節(jié)而大面積死亡。以上對塘泥中功能微生物的分析表明，塘泥微生物既是塘泥生態(tài)修復(fù)功能菌庫，也是養(yǎng)殖水產(chǎn)品病原庫。試驗中春季塘泥益生菌豐度最低且有害菌豐度最高，所以在利用紫色土建造池塘進行養(yǎng)殖時應(yīng)做好春季疾病預(yù)防工作。