金花茶組植物種質(zhì)資源遺傳多樣性的iPBS分析

盧家仕，黃展文，李先民，孫明艷，余海娟，周錦業(yè)，李春牛，卜朝陽

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】金花茶(CamellianitidssimaChi.)是山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaL.)金花茶組植物，其天然種群主要分布在我國廣西南部和越南北部，云南、貴州、四川也各分布1種[1-2]，是茶花家族中唯一具黃色花瓣的種類，屬于國家一級(jí)珍稀保護(hù)植物，也是世界上的珍稀觀賞植物，被譽(yù)為“茶族皇后”、“植物界中的大熊貓”和“幻想中的黃色山茶”。此外，金花茶還具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、降血脂[5]、降血糖[6]和降血壓[7]等多種藥用價(jià)值。通常，以金花茶為母本、其他各色山茶為父本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交育種是培育黃色山茶新品種的有效途徑[8-9]。分子標(biāo)記技術(shù)在分子輔助育種中發(fā)揮著重要作用，且不受外界環(huán)境因素影響，分子標(biāo)記輔助育種相對(duì)于傳統(tǒng)育種省工省時(shí)，可根據(jù)育種目標(biāo)提前檢測(cè)后代是否具有相應(yīng)的目標(biāo)基因[10]，其中iPBS分子標(biāo)記技術(shù)是一種基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子技術(shù)，具有操作簡單、重復(fù)性好、多態(tài)性高等特點(diǎn)[11]，已成功應(yīng)用于牡丹[12]、枸杞[13]、菊花[14]等園藝植物的遺傳多樣性分析，但在金花茶遺傳多樣性分析上的應(yīng)用至今未見報(bào)道。因此，利用iPBS分子標(biāo)記技術(shù)分析金花茶種質(zhì)資源的遺傳多樣性，進(jìn)一步了解其遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，對(duì)其異地保護(hù)、雜交親本選育和開發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在金花茶遺傳多樣性的分子研究方面應(yīng)用較多的分子標(biāo)記技術(shù)主要有RAPD、ITS序列、ISSR、AFLP、SSR和SNP標(biāo)記技術(shù)。施蘇華等[15]以RAPD分子標(biāo)記技術(shù)分析11種金花茶植物間的遺傳相似性，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。唐紹清等[16]應(yīng)用ITS序列探討了金花茶組植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。肖政等[17]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)將南寧金花茶公園29份資源劃分為三大類群，其中扶綏中東金花茶聚為一類，頂生金花茶和龍州金花茶聚為一類，其余金花茶聚為一類。李辛雷等[18]以AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)金花茶4個(gè)天然種群進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金花茶天然種群的遺傳變異主要存在種群內(nèi)，種群間遺傳變異較小。Xu等[19]應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定金花茶雜交種的真?zhèn)?，結(jié)果顯示除H2外其余雜交種均為來自于相應(yīng)父母本的真雜種。唐健民[20]運(yùn)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)4個(gè)東興金花茶野生居群進(jìn)行遺傳多樣性和結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示各居群的多態(tài)百分率為100 %，且遺傳多樣性較豐富，遺傳分化主要在居群內(nèi)部。劉凱等[21]利用開發(fā)的SNP分子標(biāo)記技術(shù)從基因組水平進(jìn)行了不同金花茶種質(zhì)遺傳關(guān)系分析。與傳統(tǒng)分子標(biāo)記技術(shù)(RAPD、ISSR和AFLP)相比，iPBS分子標(biāo)記的品種鑒別能力更強(qiáng)[22]。【本研究切入點(diǎn)】目前，未見利用iPBS分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)金花茶種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用iPBS分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)金花茶組植物不同種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，了解其遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，為其品種鑒定和雜交親本選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試24份金花茶組植物種質(zhì)資源主要種植在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所金花茶種質(zhì)資源圃內(nèi)，其信息見表1。采集供試材料的嫩葉，用蒸餾水清洗后提取其基因總DNA。

表1 試驗(yàn)材料名稱及來源

1.2 DNA提取與檢測(cè)

參照Biospin全能型植物基因組DNA提取試劑盒說明提取金花茶組植物DNA。用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop One核酸蛋白測(cè)定儀(美國NanoDrop產(chǎn)品)檢測(cè)DNA的濃度和純度，DNA濃度用ddH2O統(tǒng)一調(diào)整為10 ng/μl后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物篩選與PCR擴(kuò)增

50條iPBS引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用毛瓣金花茶和夏石金花茶DNA樣品(2份)對(duì)其進(jìn)行初步篩選，從中選取擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、多態(tài)性好的引物對(duì)本研究24份金花茶組植物種質(zhì)資源進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20.0 μl：2×ExTaqMix 10.0 μl，ddH2O 7.5 μl，iPBS引物1.0 μl，DNA
1.5 μl。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，39.0～43.5 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min，4 ℃保存。取7.0 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用于1.2 %瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)(美國)檢測(cè)，并拍照保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

人工讀取和統(tǒng)計(jì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果，有條帶的記為1，無條帶的記為0，用POPGEN
1.32導(dǎo)入[0，1]數(shù)據(jù)矩陣計(jì)算多態(tài)性比率(%)、觀察等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon多樣性信息指數(shù)(I)和Nei基因多樣性指數(shù)(H)，并把[0，1]數(shù)據(jù)矩陣從Excel 2003中導(dǎo)入NTsys 2.10e，用DICE法計(jì)算遺傳相似系數(shù)，用UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

參照Biospin試劑盒說明提取的金花茶組植物DNA無蛋白質(zhì)和RNA污染，無拖尾現(xiàn)象(圖1)。經(jīng)檢測(cè)，金花茶組植物DNA濃度在40～70 ng/μl間，純度較高，即DNA提取符合iPBS分子標(biāo)記試驗(yàn)要求。

M：DNA marker DL2000；1～24與表1的金花茶種質(zhì)編號(hào)對(duì)應(yīng)，下同 M： DNA marker DL2000；1-24 corresponded to numbers of C. sect. chrysantha Chang germplasm resources in table1.The same as below圖1 24份金花茶組植物種質(zhì)資源的DNA電泳結(jié)果Fig.1 The electrophoresis map of genomic DNA in tested 24 C. sect. chrysantha Chang germplasms resources

表2 10個(gè)iPBS引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 PCR擴(kuò)增與引物篩選結(jié)果

用2份金花茶基因組DNA對(duì)50條iPBS引物進(jìn)行初步篩選，獲得10條擴(kuò)增效果較理想的引物(表2)，利用該10條引物對(duì)所有供試材料分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共統(tǒng)計(jì)到清晰條帶280條(平均每條引物擴(kuò)增條帶數(shù)為28條)，其中多態(tài)性條帶268條，多態(tài)性比率為92.68 %；擴(kuò)增條帶數(shù)最多的引物為iPBS 2076，共擴(kuò)增出41條條帶，最少的為iPBS 2080，僅擴(kuò)增出13條條帶。說明供試材料間的異質(zhì)性較高，遺傳多樣性豐富。圖2和圖3分別是引物iPBS 2078和iPBS 2251對(duì)所有供試材料DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果。

2.3 金花茶組植物的遺傳多樣性分析結(jié)果

Na、Ne、H和I是衡量遺傳多樣性水平的常用指標(biāo)。用POPGENE
1.32計(jì)算得到多態(tài)性比率為92.68 %，24份金花茶組植物種質(zhì)資源的平均Na、Ne、H和I分別為1.9571、1.3544、0.2332和0.3767(表3)。利用10條引物擴(kuò)增的位點(diǎn)建立24份金花茶種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)矩陣，計(jì)算獲得遺傳相似系數(shù)為0.543～0.836(表4)，其中，小花金花茶與庫克芳金花茶間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.543，說明其親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而毛籽金花茶與弄崗金花茶間的相似系數(shù)最大，為0.863，說明其親緣關(guān)系最近。

圖2 引物2078對(duì)24份金花茶組植物種質(zhì)資源iPBS分子標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of 24 C. sect. chrysantha Chang germplasm resources with primer 2078 by iPBS molecular marker

圖3 引物2251對(duì)24份金花茶組植物種質(zhì)資源iPBS的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification results of 24 C. sect. chrysantha Chang germplasm resources with primer 2251 by iPBS molecular marker

表3 24份金花茶組植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性指數(shù)

表4 24份金花茶組植物種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)

2.4 聚類分析結(jié)果

在獲得遺傳相似系數(shù)矩陣后，利用SHAN模塊UPGMA構(gòu)建24份金花茶組植物種質(zhì)資源的親緣關(guān)系樹狀圖。從圖4可看出，在遺傳相似系數(shù)0.680處，10條iPBS引物可將24份金花茶組植物種質(zhì)資源聚為3組，分別是Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組。其中，第Ⅰ組有9份金花茶種質(zhì)，在遺傳相似系數(shù)0.690處被分為a和b兩個(gè)亞組，a亞組包括防城普通金花茶、毛瓣金花茶、小花金花茶和東興金花茶4份種質(zhì)，b亞組包括中東金花茶、崇左金花茶、薄葉金花茶、凹脈金花茶和顯脈金花茶5份種質(zhì)；第Ⅱ組有11份金花茶種質(zhì)，在遺傳相似系數(shù)0.703處被分為c和d兩個(gè)亞組，c亞組包括隴瑞金花茶、天峨金花茶、檸檬黃金花茶和庫克芳金花茶4份種質(zhì)，d亞組包括夏石金花茶、毛籽金花茶、弄崗金花茶、平果金花茶、龍州金花茶、頂生金花茶和羅斯曼金花茶7份種質(zhì)；第Ⅲ組包括4份金花茶種質(zhì)，在遺傳相似系數(shù)0.712處被分為e和f兩個(gè)亞組，e亞組包括紅頂金花茶、多毛金花茶和隆安金花茶3份種質(zhì)，f亞組只有黃抱莖金花茶1份種質(zhì)。

圖4 24份金花茶組植物種質(zhì)資源的iPBS分子標(biāo)記樹狀聚類結(jié)果Fig.4 Dendrogram of 24 C. sect. Chrysantha Chang germplasms resources based on iPBS molecule marker

3 討 論

iPBS是Kalendar等[10]提出以LTR類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增的分子標(biāo)記技術(shù)，是對(duì)LTR類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中兩個(gè)PBS(引物結(jié)合位點(diǎn))區(qū)間進(jìn)行PCR擴(kuò)增，無需預(yù)先知道相關(guān)的LTR序列，比常規(guī)的分子標(biāo)記技術(shù)更有優(yōu)勢(shì)[23]。本研究中，以iPBS分子標(biāo)記分析24份金花茶組植物種質(zhì)資源的多態(tài)性比率為92.68 %，高于賓曉蕓[24]利用RAPD、ISSR和AFLP分子標(biāo)記分析的多態(tài)性比率及肖政等[17]以ISSR分析的多態(tài)性比率，說明iPBS分子標(biāo)記多態(tài)性高，擴(kuò)增條帶多，實(shí)驗(yàn)操作要求不高，利用瓊脂糖凝膠電泳即可觀察分析結(jié)果，而傳統(tǒng)分子標(biāo)記(ISSR、SCoT、SSR、RAPD和AFLP)雖較穩(wěn)定、可靠、操作簡便，不受外部環(huán)境條件干擾，但也存在一些缺點(diǎn)[25]，如AFLP分子標(biāo)記需高質(zhì)量的DNA模板及制膠技術(shù)，RAPD分子標(biāo)記重復(fù)性較差，SSR和cqSSR分子標(biāo)記的引物開發(fā)較困難。唐健民等[26]研究也認(rèn)為SSR分子標(biāo)記的引物開發(fā)步驟繁瑣，工作量大，費(fèi)用高。唐紹清等[16]研究顯示，用nrDNA ITS區(qū)引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物需純化和測(cè)序，最后經(jīng)序列分析，操作較iPBS繁瑣，且GC含量較高(超過70 %)。

本研究結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)0.680處，10條iPBS引物可將24份金花茶組植物種質(zhì)資源聚為3組，其中，第Ⅰ組中a亞組由普通金花茶、毛瓣金花茶、小花金花茶和東興金花茶組成，b亞組的崇左金花茶與中東金花茶相聚，薄葉金花茶、凹脈金花茶與顯脈金花茶相聚，崇左金花茶與凹脈金花茶聚為同一亞組，與肖政等[16]的研究結(jié)果一致，但與其扶綏中東金花茶單獨(dú)為一組的研究結(jié)果不一致；凹脈金花茶與顯脈金花茶相聚與張宏達(dá)[27]的分類結(jié)果一致，二者的主要區(qū)別在于凹脈金花茶嫩枝和葉背有毛，而顯脈金花茶嫩枝和葉背無毛；毛瓣金花茶、薄葉金花茶與凹脈金花茶聚在一組的研究結(jié)果與葉創(chuàng)興和許兆然[28]的研究結(jié)果一致，主要區(qū)別是毛瓣金花茶和薄葉金花茶的鱗芽和子房均有毛，而凹脈金花茶的鱗芽和子房均無毛。第Ⅱ組中c亞組由隴瑞金花茶、天峨金花茶、檸檬黃金花茶和庫克芳金花茶組成，前3種為廣西種質(zhì)聚為一亞組的結(jié)果與肖政等[17]的研究結(jié)果相似，庫克芳金花茶為越南引進(jìn)種，聚類結(jié)果與前3種相近，不同點(diǎn)主要在于長勢(shì)很旺，一年可多次抽稍；d亞組由夏石金花茶、毛籽金花茶、弄崗金花茶、平果金花茶、龍州金花茶、頂生金花茶和羅斯曼金花茶(越南引進(jìn)種，主要特點(diǎn)是花黃色，花朵較小，嫩葉易焦枯[29])組成，其中毛籽金花茶和弄崗金花茶相似系數(shù)最大，為0.836，該2種與隴瑞金花茶共聚在第Ⅱ組，與閔天祿和張文駒[30]將毛籽金花茶、弄崗金花茶、大樣弄崗金花茶、大茶金花茶、隴瑞金花茶和多瓣金花茶歸并到淡黃金花茶的觀點(diǎn)一致；龍州金花茶和頂生金花茶聚在同一亞組的結(jié)果與肖政等[17]的研究結(jié)果一致；在施蘇華等[15]的研究中，龍州金花茶、毛籽金花茶、隴瑞金花茶和弄崗金花茶聚為一亞組，再與另一亞組的夏石金花茶等聚為一組，本研究結(jié)果與其相似。第Ⅲ組有4個(gè)金花茶種質(zhì)，除隆安金花茶為廣西種外，其他3個(gè)均為越南引進(jìn)種。其中，e亞組包括紅頂金花茶、多毛金花茶和隆安金花茶，紅頂金花茶與多毛金花茶的相似系數(shù)為0.725，區(qū)別在于紅頂金花茶花色金黃，花朵直徑大，單株花朵產(chǎn)量高，具有較好的耐曬性[31]，多毛金花茶花淡黃色，花瓣無蠟質(zhì)，嫩枝具有濃密絨毛[25，32]；隆安金花茶主要特點(diǎn)是花期較早，11月底至12月初始開；f亞組只有黃抱莖金花茶1種，與其他3種的區(qū)別在于花期略早，嫩葉紫紅色，葉基部呈耳狀抱莖，嫩枝光滑無毛[32]。

iPBS分子標(biāo)記是一種新型標(biāo)記，隨著金花茶種質(zhì)資源的不斷豐富，其聚類結(jié)果與現(xiàn)有分子標(biāo)記研究結(jié)果相比，一致的和相似的結(jié)果居多，同時(shí)也有部分聚類結(jié)果不一致。

4 結(jié) 論

iPBS分子標(biāo)記多態(tài)性高，重復(fù)性好，便于操作，能有效分析金花茶組植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性，是傳統(tǒng)分子標(biāo)記的有效補(bǔ)充，可供金花茶種質(zhì)資源的品種鑒別、親緣關(guān)系鑒定和分子輔助育種參考應(yīng)用。