不同藍(lán)莓品種果實(shí)花青素苷研究

楊雅涵，李建賓，和加衛(wèi),楊燕林，楊正松，畢海林，和文佳，蘇澤春，楊洪濤*

(1.云南大學(xué)，云南 昆明 650504；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高山經(jīng)濟(jì)植物研究所，云南 麗江 674199；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224)

【研究意義】藍(lán)莓(Blueberry)為鵑花科(Ericaceae)越桔屬(VacciniumLinn.)植物，多年生落葉、常綠灌木或小灌木樹種[1]，藍(lán)莓由于其顯著的保健功能、特殊的果實(shí)風(fēng)味和富含營養(yǎng)成分等特點(diǎn)，一直以來倍受世人的青睞。果實(shí)顏色艷麗、表皮被白色果粉，果肉細(xì)膩種子細(xì)小，口感酸甜，氣味清香，為鮮食水果中的佳品。由于藍(lán)莓果實(shí)中含有豐富的營養(yǎng)保健成份，世界各國均作為營養(yǎng)保健果品進(jìn)行生產(chǎn)加工。而藍(lán)莓的最主要的保健價(jià)值主要是由于它富含花青素，花青素苷具有清除自由基、抗氧化、保護(hù)心血管、抗腫瘤、抗致突變活性等諸多生理功能[2-4]。所以，研究藍(lán)莓花青素苷具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣泛需求。【前人研究進(jìn)展】花青素是廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，它主要存在于植物細(xì)胞液中并隨細(xì)胞液酸堿性的變化而變化顏色，當(dāng)細(xì)胞液呈酸性時(shí)顏色偏近紅，細(xì)胞液呈堿性時(shí)顏色偏近藍(lán)。自然情況下游離狀態(tài)的花青素極少見，常與一個(gè)或多個(gè)半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖等通過糖苷鍵形成花青素苷也稱花色苷，而在植物的果實(shí)中都以糖苷的形式存在，已知天然存在的花青素苷有250多種[5-8]。有研究表明，氧化是機(jī)體產(chǎn)生自由基進(jìn)而導(dǎo)致衰老的主要原因，而且自由基與血栓、腫瘤等疾病的發(fā)生密切相關(guān)；而補(bǔ)充抗氧化物質(zhì)能有效減少機(jī)體產(chǎn)生的自由基數(shù)量或者加速自由基的清除速度。目前在食藥品、化妝品和保健品等領(lǐng)域花青素苷應(yīng)用非常廣泛，具有較大的市場(chǎng)開發(fā)潛力。不同的藍(lán)莓品種花青素苷的種類和含量都不同[9-11]，不同基因型的果實(shí)花青素苷含量差別比較明顯，且栽培地域、土質(zhì)、環(huán)境因子、采收期等都會(huì)使花青素苷的含量有很大差別[12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前針對(duì)于在高海拔地區(qū)云南麗江栽培的藍(lán)莓花青素方面的研究報(bào)道較少，特別是不同成熟度和不同收獲期的藍(lán)莓花青素苷的差異比較研究方面。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究不同品種、不同成熟度及不同收獲期的藍(lán)莓花青素苷的種類及含量變化，為不同品種的藍(lán)莓選擇適宜的采收期提供一些理論依據(jù)也為藍(lán)莓花青素的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本次試驗(yàn)采用的9個(gè)藍(lán)莓品種為奧尼爾、密斯迪、雙豐、普魯、藍(lán)金、奧林匹亞、公爵、瑞卡、波尼法西。9個(gè)藍(lán)莓品種種植于麗江市古城區(qū)，2014年3月采用開溝起壟種植，用硫磺粉來調(diào)土壤pH值，草炭土進(jìn)行土壤改良，壟面用松殼、鋸末灰和松針等覆蓋，在同等條件下進(jìn)行日常管理，采樣時(shí)植株已到盛果期掛果良好。

1.2 樣品采集

不同成熟度果實(shí)樣品采摘：從藍(lán)莓果實(shí)著色第1天開始，每天采摘1次，采摘7次后果實(shí)成熟；不同成熟批次果實(shí)采摘：藍(lán)莓每個(gè)品種的掛果期在近1個(gè)月，每個(gè)星期可成熟1批果實(shí)，每隔1個(gè)星期采摘1次成熟的果實(shí)，分別于2018年5月23日(第1批)、5月29日(第2批)、6月5日(第3批)、6月12日(第4批)共計(jì)采摘4個(gè)收獲期的藍(lán)莓果實(shí)；其它果實(shí)采摘：均在盛果期采摘成熟度一致的果實(shí)；采摘植株的選擇：選擇健壯、盛果期的植株且每次固定植株進(jìn)行采摘。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花青素苷提取 精確稱量2 g左右的藍(lán)莓鮮果，用剪刀剪碎果實(shí)后放入試管，往試管內(nèi)加入4 mL左右酸性花青素苷提取液，沒過剪碎后的果實(shí)，用封口膜封口，搖勻至樣品完全浸泡在提取液中，浸提24 h后，用漏斗口放置棉花的漏斗過濾后，濾液過0.45 m濾膜放置于樣品瓶中，用于HPLC分析[13]。

酸性提取液制備：甲醇∶水∶甲酸∶三氟乙酸=70∶27∶2∶1。

1.3.2 藍(lán)莓果實(shí)花青素苷組分和含量的測(cè)定 采用高效液相色譜法(HPLC)[14]測(cè)定各個(gè)藍(lán)莓品種果實(shí)中的花青素苷組分，花青素苷的含量以矢車菊素3,5-二葡萄糖苷(Cy3G5G)為標(biāo)準(zhǔn)樣品，通過HPLC外標(biāo)法測(cè)定。采用可變梯度法進(jìn)行分析，洗脫相為B相。 A相為1.5 %磷酸水溶液，B相為1.5 %磷酸+20 %甲酸+25 %乙腈+5 %四氫呋喃水溶液。

分析時(shí)間35 min，用70 %甲醇洗柱10 min，穩(wěn)定5 min。檢測(cè)波長525 nm；進(jìn)樣量10 μl；流速1 mL/min；色譜柱：ODS-C18柱，柱溫度控制在40 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel2010進(jìn)行處理，用DPS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，在P<0.05的水平上。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藍(lán)莓品種果實(shí)花青素苷組分研究

從圖1可見，9個(gè)藍(lán)莓品種的果實(shí)中至少有17種以上的花青素苷。其中奧林匹亞和密斯迪果實(shí)中花青素苷組分最多，至少含有15種花青素苷；雙豐、波尼法西、公爵和普魯果實(shí)中含有的花青素苷組分最少，只有13種。

從表1可見，供試的9個(gè)藍(lán)莓品種果實(shí)中的總花青素苷含量各不相同，其中果實(shí)中總花青素苷的含量藍(lán)金最高，達(dá)58.35 g/100mg；其次是奧尼爾和雙豐，分別為44.05和37.14 g/100mg；普魯最低，僅為17.00 g/100mg，最高值是最低值的3倍多。9個(gè)供試品種除了密斯迪、公爵和奧林匹亞之間果實(shí)中的總花青素苷含量差異不顯著外，其它品種之間差異顯著。

從單個(gè)花青素苷組分含量來看，奧林匹亞、瑞卡、普魯、密斯迪、奧尼爾5個(gè)品種果實(shí)中都是組分1的含量最多分別為6.77、3.40、3.24、4.94和11.01 g/100mg；藍(lán)金、波尼法西、公爵3個(gè)品種果實(shí)中組分12的花青素苷含量最多，分別為12.35、12.61和9.89 g/100mg；而雙豐果實(shí)中組分13的含量最多，為5.93 g/100mg。

2.2 不同著色時(shí)間藍(lán)莓果實(shí)中花青素苷比較

藍(lán)莓果實(shí)開始著色后，隨著果實(shí)著色度增加，果實(shí)逐漸成熟。奧尼爾和雙豐在果實(shí)著色的1～7 d每天采摘，觀察其著色和成熟狀況，果實(shí)著色第7天其正反面都基本著色完全，果實(shí)已成熟。

從圖2可看出，奧尼爾著色第1天果實(shí)中的花青素苷的組分最少測(cè)出峰值有4種，著色第2天增加到10種，著色第3天測(cè)到12種，從著色第4天開始一直到第7天都可以測(cè)出所含有的14個(gè)花青素苷組分；每個(gè)花青素苷組分的含量都隨著著色天數(shù)的增加而增加，所以總花青素苷含量也隨著增加。

從圖3可以看出，雙豐在著色第1天果實(shí)中的花青素苷組分最少測(cè)出峰值的有8個(gè)組分；著色第2天可測(cè)出11個(gè)花青素苷組分，到著色的第3天開始直到著色第7天都可以測(cè)出所含有的13個(gè)花青素苷組分；這些花青素苷組分的含量也是隨著著色天數(shù)的增加而增加，所以總花青素苷含量也隨著著色天數(shù)增加而增加。

表1 不同藍(lán)莓品種果實(shí)中花青素苷含量比較

從圖4可看出，隨著著色天數(shù)的增加，藍(lán)莓果實(shí)的顏色也逐漸增加，花青素苷的含量也增加，說明藍(lán)莓果實(shí)成熟度越高花青素苷的含量也越高。奧尼爾在果實(shí)著色的前3 d花青素苷的含量快速增加，到第4、5天花青素苷緩慢增加，到第6、7天出現(xiàn)反彈花青素苷又快速增加；雙豐則是在開始的第1、2天果實(shí)花青素苷含量增加緩慢，第3、4天快速增加，到第5天的時(shí)候增加又緩慢下來，到第6、7天又出現(xiàn)快速增加。在這著色的前5 d里奧尼爾果實(shí)的花青素苷含量始終比雙豐的高，在第6天雙豐又稍微反超奧尼爾，但是在第7天奧尼爾又超過了雙豐。

2.3 不同收獲期藍(lán)莓果實(shí)的花青素苷比較分析

藍(lán)莓每個(gè)品種的掛果期約1個(gè)月左右，每個(gè)星期可成熟1批果實(shí)，每隔1個(gè)星期采摘1次成熟的果實(shí)，共計(jì)采摘4個(gè)收獲期的藍(lán)莓果實(shí)。從圖5可看出，奧尼爾和雙豐不同收獲期果實(shí)花青素苷的組分都一樣，只是不同的收獲期花青素苷的每個(gè)組分含量不同，所以花青素苷總含量也不一樣。

圖2 奧尼爾不同著色時(shí)間果實(shí)中的花青素苷高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chart of anthocyanins in fruit of O’Neal with different coloring days

圖3 雙豐不同著色時(shí)間果實(shí)中的花青素苷高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chart of anthocyanins in fruit of Sweetheart with different coloring days

圖4 奧尼爾及雙豐不同著色時(shí)間果實(shí)花青素苷含量Fig.4 Anthocyanin content in the fruit of O’Neal and Sweetheart with different coloring days

從圖6可看出，同一藍(lán)莓品種不同收獲期的果實(shí)花青素苷含量各不相同，隨著時(shí)間的推移花青素苷含量先增加后下降最后又回升，其中雙豐回升后花青素苷含量到達(dá)最高值；奧尼爾的4個(gè)收獲期中第2個(gè)收獲期的果實(shí)花青素苷的含量最高達(dá)44.38 g/100mg，第1個(gè)收獲期的果實(shí)花青素苷含量最低僅為24.67 g/100mg；雙豐則第4個(gè)收獲期的果實(shí)花青素苷含量最高，為38.30 g/100mg，最低的同樣也是第1個(gè)收獲期，僅為22.45 g/100mg。

3 討 論

以9個(gè)在麗江種植的藍(lán)莓品種為供試材料，對(duì)藍(lán)莓果實(shí)進(jìn)行了花青素苷含量的測(cè)定，測(cè)定獲得了各項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)的數(shù)據(jù)。

(1)藍(lán)莓果實(shí)中富含花青素苷，且因藍(lán)莓品種不同，果實(shí)中花青素苷的種類和含量有較大差異。高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓果實(shí)中花青素苷至少含有17種，這一結(jié)果與周婷婷[11]測(cè)的另外幾個(gè)藍(lán)莓品種果實(shí)中至少含有13種的結(jié)果基本一致，因?yàn)槠贩N不同組分會(huì)有差異。但是公爵(Duke)這個(gè)品種的花青素苷成分韓雪等[9]只測(cè)得含11個(gè)種類，而本試驗(yàn)測(cè)得有13個(gè)種類，這可能與試驗(yàn)方法不同或是與材料的生長環(huán)境因子不同相關(guān)，具體原因還有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。本研究未對(duì)這17種主要花青素苷進(jìn)行定性及定量分析，尚需進(jìn)一步進(jìn)行和完善試驗(yàn)研究。

(2)隨著藍(lán)莓果實(shí)的成熟，所含花青素苷的種類和含量顯著增加；不同時(shí)期收獲的藍(lán)莓果實(shí)中花青素苷含量有差異。積累細(xì)胞內(nèi)含物可溶性糖、激素、可溶性蛋白質(zhì)與花青素苷的形成密切相關(guān)[15-16]。隨著藍(lán)莓果實(shí)成熟度的變化細(xì)胞內(nèi)含物也隨著變化，所以奧尼爾和雙豐2個(gè)藍(lán)莓品種果實(shí)隨著著色天數(shù)的增加，果實(shí)顏色也逐漸增加，花青素苷的含量也增加，說明藍(lán)莓果實(shí)成熟度越高花青素苷的含量越高。該結(jié)果與Yang Lin、沈維治等[17-18]研究的藍(lán)莓及桑椹果實(shí)花青素含量變化規(guī)律一致，果實(shí)成熟度越高花青素含量越高。著色第7天的果實(shí)用肉眼看剛好完全著色，花青素苷含量也最高果實(shí)具有較高的保健價(jià)值，口感也是比較好，所以這一天比較適合采摘。由于本次試驗(yàn)只測(cè)定了著色7 d內(nèi)的花青素苷含量，7 d后會(huì)繼續(xù)增加還是下降有待進(jìn)一步試驗(yàn)。

圖6 奧尼爾及雙豐不同收獲期果實(shí)花青素苷含量(2018年)Fig.6 Anthocyanin content of in the fruit of O’Neal and Sweetheart with different harvest period(in 2018)

環(huán)境因子也是影響花青素苷合成的因素之一，有研究表明，較低的溫度可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)花青素苷的合成，尤其在果實(shí)生長發(fā)育期間，低溫更有利于花青素苷的積累，尤其是夜低溫[15,19-21]。在所有影響花青素苷合成的因素中，光是最重要的一個(gè)，是花青素苷合成的先決條件或是促進(jìn)花青素苷合成的因子[15,22]。而自然光中可產(chǎn)生的紫外線輻射能促進(jìn)花青素苷的形成，對(duì)花朵和果實(shí)的著色，增加花卉的觀賞價(jià)值和果實(shí)的營養(yǎng)價(jià)值，并且對(duì)花卉和果實(shí)的抗氧化能力的增強(qiáng)也具有重要的作用[23]。本試驗(yàn)雙豐和奧尼爾2個(gè)品種不同收獲期果實(shí)花青素苷含量不同，也正好驗(yàn)證了這一理論。由于不同時(shí)期藍(lán)莓果實(shí)受到的溫度、光照和紫外線的積累程度不一致，導(dǎo)致了不同收獲期花青素苷的含量不一致，該結(jié)果與趙豐玲等[24]甘薯不同收獲期花青素苷含量不同的結(jié)果一致。2018年5月29日麗江進(jìn)入初夏，雨季還未到來所以氣溫是全年最高的，光照充足所受到紫外線輻射也最強(qiáng)，所以雙豐和奧尼爾果實(shí)花青素苷含量最高，這與沈?qū)W善等[25]紫色馬鈴薯的花青素含量強(qiáng)光照地區(qū)種植的高于弱光照地區(qū)種植的結(jié)果也一致。

4 結(jié) 論

雙豐和奧尼爾這2個(gè)早熟及口感較好比較受消費(fèi)者喜愛的藍(lán)莓品種，同一收獲期的藍(lán)莓果實(shí)成熟度越高花青素苷含量越高；在同一年度第1季產(chǎn)果期內(nèi)，奧尼爾和雙豐的第1批成熟的果實(shí)花青素含量最低，奧尼爾第2批果實(shí)花青素含量最高，而雙豐則第4批也就是最后一批成熟的果實(shí)花青素含量最高。藍(lán)金的花青素苷含量最高，但是鮮食口感欠佳可以作為保健品的加工品種進(jìn)行開發(fā)利用。