張今君,夏慧麗,高海波

(臺州市食品檢驗檢測中心,浙江臺州 318000)

豆芽是頗受百姓喜愛的芽菜類蔬菜之一,富含維生素C、礦物質(zhì)、酚類化合物、游離氨基酸及微量元素,具有豐富的食用價值[1]。但豆芽在生產(chǎn)過程中極易滋生酵母、假單胞菌、大腸桿菌等微生物,易腐爛變質(zhì)[2],因此一些不法商販為了縮短豆芽生長周期、增強(qiáng)抗菌能力、改善外觀品相,往往在豆芽生長過程中違規(guī)濫用植物生長激素、農(nóng)藥、抗生素等藥劑,致使問題豆芽事件層出不窮。

目前,針對豆芽中赤霉素、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2,4-2氯苯氧乙酸等植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測,我國已經(jīng)發(fā)布了相關(guān)補(bǔ)充檢驗方法[3];針對多菌靈、涕滅威、咪鮮胺等農(nóng)藥殘留的檢測也有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等多個標(biāo)準(zhǔn)方法[4-6];針對喹諾酮類等抗生素藥物的檢測標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)多以動物源性食品為主[7-14],適用范圍主要是畜禽肉、水產(chǎn)品及動物內(nèi)臟等。而專門針對豆芽等植物源性食品中喹諾酮類等藥物殘留的文獻(xiàn)相對較少,檢測目標(biāo)物相對單一,前處理方法主要是固相萃取、液液萃取等傳統(tǒng)方法[15-21],成本較高,操作過程耗時、繁瑣。因此,建立簡便快速、經(jīng)濟(jì)有效,適于推廣的豆芽中多種喹諾酮類藥物殘留的測定方法,對于解決當(dāng)前豆芽行業(yè)濫用藥物問題具有重要意義。

分散固相萃取法[22-24]簡單、快速、廉價、高效、安全,是近年來發(fā)展較快的農(nóng)產(chǎn)品檢測樣品前處理方法,本文應(yīng)用分散固相萃取,結(jié)合兼具高靈敏度、高選擇性的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),建立豆芽中6種喹諾酮類藥物殘留檢測方法。探討了提取條件、凈化填料用量、儀器條件參數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)等影響因素,以期為豆芽中喹諾酮類等藥物殘留的檢測標(biāo)準(zhǔn)建立提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

陰性豆芽樣品 參照DB33 625.1-2007豆芽生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程自培,綠豆(黃豆)經(jīng)過清洗、殺菌(70～80 ℃熱水燙豆1～2 min)和浸豆(20～25 ℃的清水,綠豆3 h,黃豆6 h)后進(jìn)行培育(溫度23～25 ℃,4 h淋水一次),4～6 d后采集豆芽樣品;80批次測試樣品 隨機(jī)采集于菜市場、農(nóng)貿(mào)市場和超市;恩諾沙星(Enrofloxacin,純度99.0%)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,純度94.8%)、氧氟沙星(Ofloxacin,純度99.3%)、諾氟沙星(Norfloxacin,純度97.2%)、洛美沙星(Lomefloxacin,純度99.4%)、培氟沙星(Pefloxacin,純度93.9%)、恩諾沙星-d5(Enrofloxacin-d5)、環(huán)丙沙星-d8(Ciprofloxacin-d8)、氧氟沙星-d3(Ofloxacin-d3)、培氟沙星-d5(Pefloxacin-d5)、洛美沙星-d5(Lomefloxacin-d5)、諾氟沙星-d5(Norfloxacin-d5) 純度均大于95%,標(biāo)準(zhǔn)品,德國Dr.Ehrenstrorfer公司;乙腈、甲醇、甲酸 色譜純,美國Merck;去離子水 Milli-Q系統(tǒng)純凈水;N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18)、無水硫酸鎂(MgSO4)、石墨化碳(GCB)分散固相萃取吸附劑 上海安譜實驗科技股份有限公司;氯化鈉 分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

QTRAP 5500三重四極桿-線性離子肼質(zhì)譜系統(tǒng) 美國AB Sciex公司;UPLC液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司;Microfuge 20離心機(jī)、Allegra X-30R冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特公司;渦旋混勻器 德國IKA;2150 TH超聲波儀 上海安譜;PR 1602 ZH/Z電子天平 奧豪斯電子天平有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取每種標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg(精確至0.1 mg),分別置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,配制成濃度各為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液,-18 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液:準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品及同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液各25 μL置于25 mL容量瓶中,甲醇稀釋至刻度,配制成濃度均為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,-18 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液10、50、100、500、1000 μL于10 mL容量瓶中,加入同位素內(nèi)標(biāo)中間液50 μL,用50%乙腈水稀釋至刻度得各目標(biāo)物濃度為1、5、10、50、100 μg/L,內(nèi)標(biāo)物濃度為5 μg/L,現(xiàn)配。

按優(yōu)化后條件進(jìn)行測定,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.2 樣品前處理 提取:稱取粉碎均勻的豆芽樣品10.00 g,置于50 mL具塞離心管中,添加200 μL同位素內(nèi)標(biāo)中間液,加入10 mL 1%甲酸乙腈溶液,渦旋振蕩10 min,加入4 g氯化鈉,渦旋混合1 min,在4 ℃下6000 r/min離心5 min,將上清液傾入50 mL具塞離心管,殘渣再用10 mL1%甲酸-乙腈溶液重復(fù)提取1次,合并上清液于50 mL離心管。

凈化:移取上層乙腈溶液1 mL置于裝有PSA 50 mg、C18100 mg、GCB 10 mg、MgSO4150 mg的分散固相萃取凈化管中,渦旋混合2 min,以6000 r/min離心5 min,取上清液0.5 mL加入0.5 mL水,渦旋混勻,經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后上機(jī)測試。

1.2.3 儀器條件 色譜條件:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),柱溫:35 ℃,流速:300 μL/min,進(jìn)樣體積5 μL,流動相:A為含0.1%甲酸水溶液,B為甲醇。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI源);正離子掃描(ESI+);多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);電噴霧電壓(IS)5500 V;霧化氣壓力(GS1)50 psi;輔助氣壓力(GS2)50 psi;氣簾氣壓力(CUR)35 psi;離子源溫度(TEM)550 ℃,各化合物定性離子、定量離子對及其碰撞能量等參數(shù)見表2。

表2 化合物的質(zhì)譜參數(shù)

1.3 數(shù)據(jù)處理

各組分通過計算機(jī)在Multi Quant 3.0.2軟件上譜圖處理,通過各組分的離子比進(jìn)行定性確證,采取內(nèi)標(biāo)法計算各組分的相對含量。數(shù)據(jù)使用Micro-soft Excel 2007軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇 喹諾酮類化合物分子結(jié)構(gòu)中含有羧基和叔氨基,具有酸堿兩性性質(zhì),易溶于酸性或堿性溶液。本實驗采用乙腈、1%甲酸乙腈、1%乙酸乙腈、1%氨水乙腈各20 mL分兩次對6種化合物進(jìn)行提取,移取提取液0.5 mL,加入0.5 mL水渦旋混勻后過0.22 μm濾膜,檢測回收率。添加濃度20 μg/kg,結(jié)果顯示乙腈和氨水乙腈提取時各目標(biāo)物回收率明顯低于酸性乙腈,其中甲酸乙腈的回收率最高,均高于85%,結(jié)果見圖1。實驗選用1%甲酸乙腈作為提取溶劑。

圖1 提取溶劑對6種喹諾酮藥物回收率的影響

2.1.2 提取次數(shù)的選擇 本文用20 mL1%甲酸乙腈分20 mL 1次,10 mL 2次,7 mL 3次三個方案對豆芽樣品進(jìn)行提取,移取提取液0.5 mL,加入0.5 mL水渦旋混勻后過0.22 μm濾膜,檢測回收率。添加濃度20 μg/kg,結(jié)果顯示,提取次數(shù)為2、3次時回收率均在89.90%～102.32%之間,各化合物提取效率高,結(jié)果見圖2?？紤]操作簡便因素,選取10 mL 2次方案提取豆芽中化合物。

圖2 提取次數(shù)對6種喹諾酮藥物回收率的影響

2.2 凈化條件優(yōu)化

PSA、C18、GCB、MgSO4是分散固相萃取常用的4種填料。本文參照植物源性食品中農(nóng)藥及代謝物殘留量檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)[25-26]設(shè)計不同用量對各目標(biāo)物的回收率實驗。在1.2.2其它條件不變情況下單獨添加PSA、C18、GCB、MgSO44組填料各6個點進(jìn)行回收率實驗,添加濃度20 μg/kg,重復(fù)測定3次,填料用量及回收率見圖3。PSA去除樣品中的脂肪酸、糖等干擾物,對各目標(biāo)物也有一定的吸附,在使用量50 mg之后對目標(biāo)物吸附增加;C18去除樣品中脂肪等非極性干擾物,在25～150 mg范圍對各目標(biāo)物吸附量穩(wěn)定。GCB用量從10 mg上升至15 mg時各目標(biāo)物回收率下降至60%以下;MgSO4在50～300 mg范圍對各目標(biāo)物吸附量影響較小。綜合考慮回收率及除雜效果,選用PSA 50 mg、C18100 mg、GCB 10 mg、MgSO4150 mg組成分散固相萃取凈化管,各目標(biāo)物回收率較高。

圖3 4種凈化填料用量對6種喹諾酮藥物回收率的影響

2.3 儀器條件優(yōu)化

2.3.1 色譜條件的優(yōu)化 喹諾酮類藥物在正離子模式下進(jìn)行測定,流動相中加入甲酸可以提高離子化效率,選擇甲酸水溶液為水相流動相,對甲醇/甲酸水和乙腈/甲酸水進(jìn)行比較,結(jié)果表明甲醇/甲酸水峰形尖銳,信號更高,本實驗選擇甲醇/0.1%甲酸水作為流動相,對梯度條件進(jìn)行優(yōu)化,采用優(yōu)化后梯度洗脫方法,可以得到滿意的實驗結(jié)果。豆芽加標(biāo)樣品中提取離子色譜圖見圖4。

圖4 20 μg/kg豆芽加標(biāo)樣品中MRM離子流圖

2.3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 質(zhì)譜條件優(yōu)化時,去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)這兩個參數(shù)與化合物性質(zhì)相關(guān)且影響較大。喹諾酮化合物中含有叔氨基,容易得到質(zhì)子,因此選擇正離子模式進(jìn)行檢測。實驗將0.1 μg/mL各標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)蠕動泵以7 μL/min流速進(jìn)入ESI源進(jìn)行質(zhì)譜分析。通過Q1全掃模式獲得分子離子峰,用子離子模式對分子離子峰進(jìn)行分析,從打碎的離子中選取兩個特征離子作為定性和定量離子。用MRM掃描模式優(yōu)化DP和CE值,使得定量與定性離子強(qiáng)度響應(yīng)最大,優(yōu)化后的6種喹諾酮藥物及同位素內(nèi)標(biāo)物質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)評價

質(zhì)譜分析中,由于流動相、目標(biāo)物與樣品中的其他成分同時進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng),進(jìn)而影響了目標(biāo)離子的離子化過程,使得目標(biāo)物的質(zhì)譜信號增強(qiáng)或者減弱,從而影響了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度[27]。本實驗采用Guedes等[24]報道的方法對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察,在建立的前處理方法和儀器測定條件下,測定空白基質(zhì)提取液與溶劑中同濃度目標(biāo)物的響應(yīng)值,通過目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比的相對比值評價?；|(zhì)效應(yīng)按照式(1)計算。6種喹諾酮藥物在豆芽基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)見表3,結(jié)果顯示各化合物基質(zhì)效應(yīng)在0.97～1.04之間。本實驗基質(zhì)效應(yīng)小,可選擇溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

表3 6種喹諾酮藥物的基質(zhì)效應(yīng)

式(1)

式中,ME表示基質(zhì)效應(yīng)的大小,當(dāng)ME大于1.0時為基質(zhì)增強(qiáng),當(dāng)ME小于1.0時為基質(zhì)抑制;Am為基質(zhì)提取液中化合物峰面積,Ami為基質(zhì)提取液中同位素內(nèi)標(biāo)峰面積,As為溶劑中化合物峰面積,Asi為溶劑中同位素內(nèi)標(biāo)峰面積。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 檢出限、定量限和線性范圍 將6種喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成不同的濃度,以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值對應(yīng)各自濃度進(jìn)行線性回歸,同時利用豆芽空白基質(zhì)進(jìn)行檢出限和定量限的考察,以3倍和10倍信噪比確定6種喹諾酮類藥物的檢出限和定量限。結(jié)果表明,6種喹諾酮藥物在1.0～100.0 μg/L的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.9982,檢出限為0.1～0.3 μg/kg,定量限為0.3～1.0 μg/kg,具體見表4。

表4 6種喹諾酮藥物的相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.5.2 回收率及精密度 在豆芽空白基質(zhì)中添加不同濃度的6種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實驗,分別添加2、4、20 μg/kg三個濃度水平,每個樣品平行測定6次,數(shù)據(jù)結(jié)果見表5。結(jié)果表明6種喹諾酮藥物回收率均在96.53%～106.94%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.73%～7.60%之間,符合GB/T 27404《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》標(biāo)準(zhǔn)[28]要求。

表5 6種喹諾酮藥物回收率及精密度(n=6)

2.5.3 實際樣品測定 用建立的方法對從市場采集的80批次豆芽樣品中的6種喹諾酮類藥物進(jìn)行測定,其中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星有檢出,檢出率分別為37.5%、26.2%、2.5%,氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星均未檢出,具體情況見表6。

表6 80批次豆芽中6種喹諾酮藥物檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本實驗采用1%甲酸乙腈提取,PSA 50 mg、C18100 mg、GCB 10 mg、MgSO4150 mg分散固相萃取凈化,同位素內(nèi)標(biāo)法定量,建立了同時測定豆芽中6種喹諾酮藥物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析檢測方法。結(jié)果表明,各藥物在1.0～100.0 μg/L濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.9982,三個添加水平的回收率范圍為96.53%～106.94%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.73%～7.60%,檢出限為0.1～0.3 μg/kg,定量限為0.3～1.0 μg/kg。80批次豆芽樣品中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星檢出率分別為37.5%、26.2%、2.5%,氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星均未檢出。本方法操作簡單,準(zhǔn)確度和精密度高,適合豆芽中喹諾酮類藥物的定性和定量檢測,可為芽菜類蔬菜中喹諾酮類藥物殘留的風(fēng)險評估提供一種快速高效的分析手段。