溫博雅,彭翠英,徐 暢,周翠蘭*

(1.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院,湖南 衡陽 421001;2.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院應(yīng)用解剖學(xué)與生殖醫(yī)學(xué)研究所，湖南 衡陽 421001;3.生態(tài)健康與人類重要疾病防控湖南省高校重點實驗室，湖南 衡陽 421001;4.生物毒理與生態(tài)修復(fù)衡陽市重點實驗室，湖南 衡陽 421001;5.有色金屬礦區(qū)耕地重金屬污染生態(tài)阻抗技術(shù)研究衡陽市重點實驗室，湖南 衡陽 421001)

Kirsten大鼠肉毒病毒原癌基因同源基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS)突變與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[1]。KRAS突變以點突變?yōu)橹鳎渲凶畛Ｒ娡蛔優(yōu)?2位氨基酸突變[2]，其次為13位氨基酸突變。KRAS基因點突變與否與腫瘤的大小，類型及手術(shù)后是否復(fù)發(fā)相關(guān)[3]。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，脫落的癌細(xì)胞與原發(fā)腫瘤組織癌細(xì)胞凋亡與壞死導(dǎo)致循環(huán)血液游離DNA含量增加[4]。經(jīng)典的藍(lán)白斑篩選原理認(rèn)為，當(dāng)外源DNA與含lacZ的載體連接時，會插入載體的多克隆位點(MCS)，使載體α肽鏈讀碼框破壞，此重組質(zhì)粒不表達(dá)α肽鏈，導(dǎo)入宿主缺陷菌株不能產(chǎn)生活性β-半乳糖苷酶，不可分解培養(yǎng)基中的X-gal，培養(yǎng)表型呈現(xiàn)白色菌落。有文獻(xiàn)報道[5]，當(dāng)插入不含終止密碼子的3N核苷酸片段(N<34)時，含插入片段的重組載體其α肽鏈讀碼框沒有被破壞，能產(chǎn)生活性β-半乳糖苷酶，因而形成藍(lán)色菌落;相反，當(dāng)插入含終止密碼子的3N核苷酸片段(N<34)時，由于其α肽鏈讀碼框因終止密碼子的存在而遭到破壞，因此不能產(chǎn)生活性β-半乳糖苷酶，則形成白色菌落。本文模擬游離DNA，采用“藍(lán)白斑篩選+酶切鑒定+Sanger測序”對KRAS基因12位密碼子熱點突變進(jìn)行檢測，以探討此技術(shù)在檢測稀發(fā)基因突變中的可行性，為腫瘤相關(guān)的部分體細(xì)胞基因突變檢測提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

PCR儀為朗基公司(中國杭州)生產(chǎn)，A200型。E Coli. DH5α菌株為天根(北京)生產(chǎn)，PspGI、BamHI、HindIII、PMD-19T為TaKaLa公司(大連)產(chǎn)品。質(zhì)粒DNA提取試劑盒、100 bp DNA Ladder、dNTP、MixTaq、DNA Polymerase、T4連接酶均為Thermo Scientific產(chǎn)品。IPTG、X-gal、Tris-bas等試劑購于佳和生物(長沙)。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)腫瘤體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)庫(COSMIC)提供的KRAS基因12位密碼子熱點突變及NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)提供的KRAS基因序列，利用引物設(shè)計軟件Premier 5.0設(shè)計引物S1(正向引物)、S2(反向引物)與S3(正向引物)。S1序列為5′-GTTAGCCAAGCTTTGACTGCATACAAACTTGT-3′，S2序列為5′-CGTCAGGATCCTTGGACCATATTCGTCCACA-3′，S3序列為5′-GTTAGCCAAGCTTTGACTGCATACAAACTTGTGGTAGTTGGAC-3′，其中S3中3′的C為引入的PspGI酶切序列的C。S1與S2擴(kuò)增得到產(chǎn)物雙酶切后用于克隆，雙酶切后獲得的插入片段長度為102 bp，插入片段的長度為3的倍數(shù)(3N)。S2與S3擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用于酶切鑒定，所有引物序列由上海生工合成。

1.3 藍(lán)白斑篩選檢測混合質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

測定WT野生型與M12突變型質(zhì)粒的OD值。M12突變型/WT野生型質(zhì)粒分別以1∶30，1∶100，1∶300，1∶1 000的比例進(jìn)行混合，WT野生型質(zhì)粒最終濃度為2 ng/μL。以混合質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如表1所示。

表1 PCR反應(yīng)體系

PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 1 min；變性95 ℃ 20 s，退火58 ℃15 s，延伸72 ℃20 s，共35 cycles；終延伸72 ℃ 5 min。

HindIII和BamHI酶切PMD-19T與PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物與線性化載體，紫外分光光度計測定OD值。

PCR產(chǎn)物與載體連接。反應(yīng)體系為10 μL，使插入片段含量為70 ng,載體的含量為20 ng,0.5 μL的T4 DNA Ligase，1 μL的10×T4 DNA Ligase Buffer。22 ℃反應(yīng)30 min。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E Coli. DH5α菌株。培養(yǎng)物涂抹于含有X-gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上，瓊脂平板置于二氧化碳培養(yǎng)箱(5%)37 ℃培養(yǎng)15 h，觀察結(jié)果并挑白色克隆進(jìn)行酶切鑒定，將酶切鑒定為陽性的克隆進(jìn)行Sanger測序。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒序列

2.1.1 重組質(zhì)粒序列 M12突變型質(zhì)粒與WT野生型質(zhì)粒為本實驗室構(gòu)建[6]，插入片段的長度均為3的倍數(shù)的核苷酸長度(3 N),M12突變型質(zhì)粒其TGG突變成TGA,序列見圖1。

圖1 質(zhì)粒DNA序列圖A:WT野生型質(zhì)粒插入片段序列；B:M12突變型質(zhì)粒插入片段序列

2.1.2 質(zhì)粒引入酶切位點 采用引物S2與S3，以WT野生型質(zhì)粒與M12突變型質(zhì)粒為模板，引入PspGI酶切位點。WT野生型質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物含酶切位點，M12突變型質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物不含酶切位點。將PCR產(chǎn)物送金唯智測序，其序列圖見圖2。

圖2 WT野生型與M12突變型質(zhì)粒引入酶切位點測序圖A：野生型質(zhì)粒引入酶切位點后的測序圖；B：M12突變型質(zhì)粒引入酶切位點后的測序圖

2.2 藍(lán)白斑篩選檢測KRAS基因12位密碼子稀有突變

2.2.1 藍(lán)白斑篩選技術(shù)檢測稀有突變 如圖3瓊脂培養(yǎng)皿中長出了明顯可見的白色克隆與藍(lán)色克隆，證明藍(lán)白斑技術(shù)能夠檢測KRAS基因12位密碼子熱點突變。通過改變閱讀框架，當(dāng)插入長度為3N的野生型片段至線性化載體，其閱讀框架不含終止密碼子，產(chǎn)生藍(lán)色克隆。長度為3N的突變型片段插入線性化載體，其閱讀框架含終止密碼子TGA，產(chǎn)生白色克隆。

圖3 藍(lán)白斑檢測KRAS基因稀有突變的克隆形成圖a,b,c,d分別為M12/WT的比例為1∶30,1∶100,1∶300,1∶1 000的克隆形成圖

2.2.2 藍(lán)白斑菌落計數(shù) 不同比例混合模板的PCR產(chǎn)物與載體連接后，轉(zhuǎn)化，接種到瓊脂培養(yǎng)基上，計數(shù)藍(lán)白菌落數(shù)量(表2)，藍(lán)白菌落數(shù)比值高于M12突變型質(zhì)粒/WT野生型質(zhì)粒比值，此可能為藍(lán)白斑篩選技術(shù)的假陽性造成。

2.2.3 白色菌落測序鑒定 在1∶1 000瓊脂培養(yǎng)板上挑取4個白色菌落，通過引入PspGI酶切位點的引物進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增、酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到2個陽性克隆(圖4)，即為突變型克隆，隨后采用Sanger測序?qū)Σ迦肫蔚男蛄羞M(jìn)一步驗證。由于野生型擴(kuò)增片段含有PspGI酶切位點，其擴(kuò)增產(chǎn)物消化為更短的DNA片段，在瓊脂糖凝膠電泳中檢測不出消化后的產(chǎn)物片段。

表2 不同比例M12突變型質(zhì)粒/WT野生型質(zhì)?；旌限D(zhuǎn)化培養(yǎng)后菌落計數(shù) (個)

圖4 菌液PCR產(chǎn)物酶切電泳圖

2.2.4 測序驗證酶切鑒定陽性克隆 酶切鑒定為陽性的2個克隆，搖菌，提取質(zhì)粒，送金唯智測序。經(jīng)BLAST比對，為KRAS基因12位密碼子突變型片段(圖5)。結(jié)果提示藍(lán)白斑篩選與Sanger測序相結(jié)合，可以檢測出千分之一的突變，且能夠消除藍(lán)白斑篩選造成假陽性的缺點。KRAS基因野生型片段的基因型為TGG，突變型片段的基因型為TGA(圖5)。

圖5 陽性克隆測序結(jié)果紅框內(nèi)標(biāo)注的為突變序列TGA，其相對應(yīng)的野生型序列為TGG

3 討 論

COSMIC數(shù)據(jù)庫是最大的癌基因數(shù)據(jù)庫，在數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)中查詢得知KRAS基因12位密碼子突變是肺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌等腫瘤中最常見的突變之一[2,7]。眾所周知，腫瘤的發(fā)生發(fā)展卷入了相關(guān)基因突變等分子事件，因此對腫瘤進(jìn)行早期的分子診斷為預(yù)防與治療腫瘤顯得尤為重要[8-10]。

當(dāng)今有關(guān)腫瘤分子篩查技術(shù)層出不窮，但是這些技術(shù)均存在一定的技術(shù)局限，使其不能在臨床上普及使用[11]。如熔點曲線具有高靈敏度，不需對后續(xù)的PCR進(jìn)行處理，但并不是所有的突變都會有熔點曲線的變化[12-13]。位點特異性PCR靈敏度高，但有假陽性[14-15]。高保真聚合酶ON-OFF分子開關(guān)靈敏度高，同樣也有假陽性[16]。在眾多的方法中,測序分析是基因突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[17]?；驕y序，包括Sanger測序(一代測序)與高通量測序(二代測序)這兩種方法。當(dāng)突變超過15%時，幾乎所有的相關(guān)技術(shù)都可用于此類標(biāo)本的檢測，最為臨床接受的方法為Sanger測序[17-18]。當(dāng)突變高于1‰時，可以采用高通量測序進(jìn)行突變分析[18-21]。高通量測序雖然更適合于腫瘤切除術(shù)后監(jiān)控與靶向用藥，但是高通量測序費用高，設(shè)備昂貴，數(shù)據(jù)分析復(fù)雜，不能在基層醫(yī)院普及。Sanger測序雖然費用低廉，但是其檢測突變靈敏度應(yīng)在15%以上[18-19]，這限制了Sanger測序在基層醫(yī)院用于早期癌癥診斷的普及。

本實驗通過人工合成模板按比例混合模擬游離DNA，采用藍(lán)白斑篩選聯(lián)合Sanger測序技術(shù)，對KRAS基因12位密碼子突變進(jìn)行檢測，可以達(dá)到千分之一的靈敏度。藍(lán)白斑篩選技術(shù)具有高效性的優(yōu)點，假陽性的缺點。利用藍(lán)白斑技術(shù)的高效性可以克服一代測序技術(shù)對稀有突變檢測低靈敏度的缺點，這兩種技術(shù)相結(jié)合能相互揚(yáng)長避短。實驗挑取特定顏色的陽性克隆進(jìn)行酶切鑒定，再挑取陽性克隆進(jìn)行Sanger測序，對插入片段進(jìn)行驗證。通過藍(lán)白斑篩選、酶切與一代測序相結(jié)合對突變進(jìn)行分析，結(jié)果顯示此方法可以成功檢測KRAS基因12位密碼子熱點突變。本研究所采用的方法可以用于對臨床標(biāo)本游離DNA進(jìn)行KRAS基因12位密碼子熱點突變檢測。此方法有一些潛在的優(yōu)點，首先，作為一種無創(chuàng)性檢測，被患者接受的概率較高；其次，本方法只需簡單的設(shè)備及常規(guī)的分子生物學(xué)試劑，本技術(shù)操作方便，技術(shù)門檻低，可以在基層醫(yī)院推廣普及；第三，此方法檢測成本低，檢測費用低，普通百姓有能力支付相關(guān)檢測費用。通過此方法對腫瘤切除術(shù)后的患者血中游離DNA進(jìn)行監(jiān)測，可以為患者的預(yù)后提供腫瘤基因改變的信息，以指導(dǎo)臨床治療；同時，利用這一原理開發(fā)更多實用的突變檢測方法，未來有可能用于對臨床檢測疑似癌癥患者的篩查或具有癌基因家族的個體進(jìn)行預(yù)防性的早篩。

綜上所述，本實驗通過藍(lán)白斑篩選、酶切與一代測序技術(shù)相結(jié)合，利用人工模板模擬游離DNA對KRAS基因12位密碼子熱點突變進(jìn)行檢測，可以達(dá)到千分之一的靈敏度，且無假陽性。實驗結(jié)果提示通過對腫瘤突變基因循環(huán)cDNA進(jìn)行藍(lán)白斑篩選并結(jié)合一代測序，可以使基因突變檢測達(dá)到更高的靈敏度，此方法適應(yīng)于可轉(zhuǎn)化為終止密碼子的體細(xì)胞基因突變檢測。通過調(diào)整閱讀框架使之變?yōu)榻K止密碼子，可以采用此技術(shù)進(jìn)行檢測。藍(lán)白斑篩選與一代測序技術(shù)結(jié)合優(yōu)劣互補(bǔ)，它們的結(jié)合使用可成為一種高效、靈敏、特異、經(jīng)濟(jì)、無創(chuàng)傷性的稀有基因突變檢測新方法，可能具有廣闊的市場應(yīng)用前景。