黃瑞芳,王紅玲,施士爭(zhēng)*

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153；2.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇 南京 210014)

鉛污染是我國(guó)普遍存在的土壤重金屬污染類(lèi)型之一，生物修復(fù)是近年來(lái)研究較多的清除土壤污染物的原位修復(fù)技術(shù)。鉛污染物不能被生物代謝所分解，初期大多停留在表層土壤[1-2]。灌木類(lèi)柳樹(shù)，適應(yīng)性強(qiáng)，速生，生物量大，可扦插造林，造林成本極低，且灌木類(lèi)柳樹(shù)為水平根系，根系發(fā)達(dá)，主要分布在0—40 cm土層，恰恰位于鉛主要分布層[3-5]，非常適合修復(fù)初期鉛污染土壤；柳條還可用作工業(yè)原料、編織工藝、生物能源和園林觀賞等，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，且不直接與食物鏈相聯(lián)系，與草本相比，優(yōu)勢(shì)明顯，是植物修復(fù)的理想材料[6-9]。

目前關(guān)于柳樹(shù)修復(fù)重金屬污染的研究越來(lái)越多。歐美等國(guó)已開(kāi)展提高灌木柳生物量的育種和栽培研究以及應(yīng)用速生的柳樹(shù)修復(fù)Cd，Pb等重金屬污染，具有顯著的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益[10]，在利用柳樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系培育能源林和環(huán)境保護(hù)林方面也有較大的發(fā)展[11]。江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院分別于2005，2011年對(duì)喬木柳和灌木柳進(jìn)行了鎘脅迫水培試驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)，雖然鎘處理對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育有抑制作用，但其枝條和葉中吸收積累的鎘含量較高，各無(wú)性系間鎘含量差異顯著，可培育鎘高富集量新品種[12-14]。中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院和廣西大學(xué)進(jìn)行了復(fù)合重金屬污染脅迫柳樹(shù)的研究，結(jié)果表明旱10(Salixmatsudana‘10’)、旱34(S.matsudana‘34’)、金絲垂柳(S.albavartristis)、61-1(S.jiangsuensisCL‘61-1’)對(duì)重金屬有較強(qiáng)的耐性和一定積累能力，適合修復(fù)造林[15-17]。

但是如何快速地篩選出鉛積累能力強(qiáng)的優(yōu)良無(wú)性系，能否從生物量性狀進(jìn)行直觀篩選，生物量是否與鉛積累特性存在相關(guān)性？本研究以20個(gè)高生物量灌木柳樹(shù)無(wú)性系為試驗(yàn)材料，以項(xiàng)目組前期確定的適宜鉛污染濃度(300 μM)[18]，采用水培法進(jìn)行鉛脅迫處理，進(jìn)行生長(zhǎng)表現(xiàn)觀察、生物量及鉛含量的測(cè)定，旨在分析灌木柳樹(shù)無(wú)性系對(duì)鉛的積累特性，以及生物量是否與鉛富集能力具有相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為筆者從江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院國(guó)家柳樹(shù)良種基地柳樹(shù)種質(zhì)資源圃現(xiàn)有的灌木型柳樹(shù)中挑選的20個(gè)高生物量型灌木柳樹(shù)(見(jiàn)表1)，分別隸屬于毛枝柳(S.dasyclados)、簸箕柳(S.suchowensis)、杞柳(S.integra)、二色柳(S.alberti)、黃花柳(S.caprea)、蒿柳(S.viminalis)、歐洲紅皮柳(S.sinopurpurea)、粉枝柳(S.rorida)、綿毛柳(S.erioclada)等的雜交后代。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采取水培法。所有無(wú)性系于2020年3月從江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院柳樹(shù)種質(zhì)資源圃采穗，均選取無(wú)病蟲(chóng)害的健壯枝條剪成長(zhǎng)15 cm、直徑為1 cm的插穗，清水培養(yǎng)14 d后，挑選生長(zhǎng)勢(shì)一致的柳樹(shù)苗，置于定植籃中，每籃10株。試驗(yàn)設(shè)置處理組和對(duì)照組，處理組使用改良Hoagland′s培養(yǎng)液培養(yǎng)28 d后,進(jìn)行鉛處理14 d，對(duì)照組使用改良Hoagland′s培養(yǎng)液培養(yǎng)42 d后,收獲植株。Pb2+以Pb(NO3)2的形式加入，濃度為300 μM。設(shè)置3次重復(fù)，試驗(yàn)過(guò)程中每7 d換1次培養(yǎng)液。為避免鉛產(chǎn)生沉淀，鉛脅迫開(kāi)始后，培養(yǎng)液中不再加入KH2PO4。

表1 供試無(wú)性系

1.3 測(cè)定方法

試驗(yàn)結(jié)束后，觀察各灌木柳樹(shù)在鉛脅迫下的生長(zhǎng)表現(xiàn)。將生長(zhǎng)狀況良好的系號(hào)分根、莖、葉采集，先用自來(lái)水沖洗，然后用去離子水反復(fù)沖洗干凈并用吸水紙擦干，根部用EDTA洗去表面附著的鉛，105 ℃殺青30 min后，烘干至恒重，分別稱(chēng)其生物量(即干物質(zhì)量，DW)。按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鉛的測(cè)定》(GB5009.12-2017)中的方法進(jìn)行植物根、莖、葉鉛含量的測(cè)定。鉛總量為該株植物體內(nèi)所吸收鉛的總量。耐性指數(shù)(tolerance index，TI)是表征植物忍耐重金屬脅迫生長(zhǎng)能力的指標(biāo)[19]，耐性指數(shù)的計(jì)算公式為T(mén)I=[DW(脅迫)/DW(CK)]×100%。得到的數(shù)據(jù)利用Excel 2010和IBM SPSS Statistics 19分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉛脅迫下不同無(wú)性系的表型差異

植物的生長(zhǎng)表現(xiàn)可以直觀反映出植物在受到脅迫時(shí)的影響。鉛脅迫處理后，部分系號(hào)2 d左右出現(xiàn)葉片萎蔫，4 d左右出現(xiàn)少量落葉，莖發(fā)黃，7 d左右落葉癥狀持續(xù)加重，有個(gè)別系號(hào)落葉達(dá)到80%，14 d時(shí)部分系號(hào)出現(xiàn)死亡(見(jiàn)圖1)。鉛脅迫處理明顯抑制了灌木柳樹(shù)生物量的積累和根系的生長(zhǎng)。這與之前報(bào)道的研究類(lèi)似[20]：楊樹(shù)在Cd脅迫后，65%的處理植物葉片出現(xiàn)壞死病灶，植株生長(zhǎng)顯著下降，表現(xiàn)出完全的生長(zhǎng)抑制。

注：a為系號(hào)H04、b為系號(hào)62-1的灌木柳樹(shù)的受害情況；左為對(duì)照組，右為處理組。圖1 部分受害嚴(yán)重的灌木柳樹(shù)

本文將成活率低于50%或生物量明顯降低至50%以下的系號(hào)排除。通過(guò)此方法，共有10個(gè)系號(hào)用來(lái)做后續(xù)試驗(yàn)分析。

2.2 鉛脅迫下不同無(wú)性系生物量積累及其分配特性

鉛是植物的非必需元素，會(huì)對(duì)植物體造成包括生物量降低、抑制根系生長(zhǎng)等一系列傷害，影響其正常的生長(zhǎng)發(fā)育[21]。植物在脅迫下的生物量反映了它的抗性和耐性，是衡量其是否適合進(jìn)行生物修復(fù)的一個(gè)重要指標(biāo)。10個(gè)灌木柳樹(shù)無(wú)性系的生物量見(jiàn)圖2。在鉛脅迫下，生物量顯著低于對(duì)照，對(duì)照組的生物量為9.98—21.05 g，其中17號(hào)顯著高于其他無(wú)性系，鉛脅迫下的生物量為7.07—12.14 g，其中13號(hào)顯著高于其他無(wú)性系。各無(wú)性系的耐性指數(shù)(見(jiàn)圖3)從40.15%(無(wú)性系17)到92.52%(無(wú)性系14)，其中無(wú)性系14、15和7的耐性指數(shù)均高于80%，分別為92.52%，89.52%和83.28%，表現(xiàn)出較好的耐性。

注：不同小寫(xiě)字母代表不同無(wú)性系對(duì)照組生物量的顯著性差異(P<0.05)， 不同大寫(xiě)字母代表不同無(wú)性系處理組生物量的顯著性差異(P<0.05)。圖2 鉛脅迫下灌木柳樹(shù)的生物量

鉛脅迫對(duì)不同柳樹(shù)無(wú)性系生物量地上部分與地下部分比的影響不同(見(jiàn)圖4)。結(jié)果顯示，在鉛脅迫下，除了2號(hào)，各柳樹(shù)無(wú)性系的地上/地下生物量的比值都較對(duì)照組顯著或極顯著增加，這與前人的報(bào)道相似[22-23]。這說(shuō)明在受到鉛脅迫時(shí)，根部受到的傷害較地上部分更多，根系生物量下降明顯高于地上部分。其中，根系生物量較地上部分下降程度最大的為13號(hào)，最低的為2號(hào)。

注：不同小寫(xiě)字母代表不同無(wú)性系耐性指數(shù)的顯著性差異(P<0.05)。圖3 灌木柳樹(shù)無(wú)性系的耐性指數(shù)

注：不同小寫(xiě)字母代表不同無(wú)性系對(duì)照組地上生物量/地下生物量的顯著性差異(P<0.05)， 不同大寫(xiě)字母代表不同無(wú)性系處理組地上生物量/地下生物量的顯著性差異(P<0.05)。圖4 鉛脅迫下柳樹(shù)地上生物量/地下生物量

注：不同小寫(xiě)字母代表不同無(wú)性系根部鉛含量的顯著性差異(P<0.05)， 不同大寫(xiě)字母代表不同無(wú)性系莖和葉部鉛含量的顯著性差異(P<0.05)。圖5 鉛脅迫下柳樹(shù)不同部位(根、莖和葉)的鉛含量

2.3 鉛脅迫下不同無(wú)性系的鉛含量差異

對(duì)鉛脅迫下灌木柳樹(shù)無(wú)性系進(jìn)行鉛含量的分析如圖5。結(jié)果顯示：Pb2 +在柳樹(shù)體內(nèi)絕大部分積累在根部，遷移到莖部和葉部的數(shù)量極少。根部的鉛含量達(dá)到1 284.9—2 133.5 mg/kg，其中最高的14號(hào)，最低的為7號(hào)。而莖和葉部只達(dá)到33.5—77.8 mg/kg，其中15號(hào)顯著高于其他無(wú)性系。Pb2 +在根部的分配率為95.86%—98.21%。

2.4 鉛脅迫下不同無(wú)性系的鉛總量差異

對(duì)鉛脅迫下灌木柳樹(shù)吸收的鉛總量進(jìn)行比較，結(jié)果如圖6所示：灌木柳樹(shù)富集的鉛總量為746.63—2 449.35 μg，地上部分富集的鉛總量為262.54(5)—688.40 μg，占整株富集鉛總量的16.51%—35.62%，根部富集的鉛總量為480.68—1 760.95 μg，占整株富集鉛總量的64.38%—83.49%。其中無(wú)性系15號(hào)富集的鉛總量最多，達(dá)到2 449.35 μg，其地上部分和地下部分富集的鉛總量均為最多，地上部分占28.11%，地下部分占71.89%。

注：不同小寫(xiě)字母代表不同無(wú)性系根部鉛總量的顯著性差異(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母代表不同無(wú)性系莖和葉部鉛總量的顯著性差異(P<0.05)。圖6 鉛脅迫下柳樹(shù)不同部位(根、莖和葉)的鉛總量

2.5 鉛積累與生物量的相關(guān)性

對(duì)無(wú)鉛脅迫時(shí)的生物量、根生物量和鉛含量、鉛總量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：生物量與鉛含量(P=0.426)、鉛總量(P=0.606)均沒(méi)有相關(guān)性，根生物量與鉛含量(P=0.521)、鉛總量(P=0.593)也沒(méi)有相關(guān)性。

對(duì)在鉛脅迫下的生物量、根生物量與鉛含量、鉛總量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：鉛脅迫下的生物量與鉛含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P=0.021<0.05)、與鉛總量(P=0.906)無(wú)相關(guān)性，鉛脅迫下的根生物量與鉛含量(P=0.569)無(wú)相關(guān)性，與鉛總量呈極顯著正相關(guān)(P=0<0.01)。

3 結(jié)論與討論

鉛脅迫改變了植物的生存環(huán)境，使得植物改變了某些生長(zhǎng)特征來(lái)適應(yīng)環(huán)境，灌木柳樹(shù)在受到鉛脅迫時(shí)，其生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，其中根部的生長(zhǎng)較地上部分被抑制的程度更高。植物的不同部位對(duì)重金屬的富集能力也不同[24]，灌木柳樹(shù)中鉛主要積累在根部，Pb2 +在根部的分配率達(dá)到95.86%—98.21%，莖和葉部的鉛含量較少。鉛在植物體內(nèi)的分布及其存在形態(tài)，都影響著鉛在植物體內(nèi)的運(yùn)輸，并進(jìn)而影響植物的耐性和積累能力。鉛在植物體內(nèi)多以絡(luò)合形態(tài)或者沉淀狀態(tài)存在根系中，故在植物體內(nèi)較難進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸[19]。

灌木柳樹(shù)無(wú)鉛脅迫時(shí)的生物量與鉛富集能力無(wú)相關(guān)性，在選擇優(yōu)良無(wú)性系時(shí)，不能以常規(guī)栽培條件下灌木柳樹(shù)的生物量作為直觀選擇依據(jù)；在鉛脅迫下，生物量與鉛含量呈顯著負(fù)相關(guān)，根系生物量與鉛總量呈極顯著正相關(guān)，在后期的生物修復(fù)工作中要注重提高根系生物量，可利用微生物、生根劑、水肥管理等手段促進(jìn)根系生長(zhǎng)，從而提高植物富集的鉛總量，提高植物修復(fù)效率。

根據(jù)灌木柳樹(shù)的生物量及其體內(nèi)的鉛含量，發(fā)現(xiàn)系號(hào)2513的耐性最好，耐性指數(shù)達(dá)到92.52%，且體內(nèi)鉛含量最高，為2 172.733 mg/kg，但由于根系生物量較低，導(dǎo)致固定的鉛總量不多；系號(hào)2513的耐性好，且體內(nèi)鉛含量高，后期可促進(jìn)根系生長(zhǎng)，提高其對(duì)鉛的吸收積累能力。系號(hào)2542耐性較好，耐性指數(shù)為89.52%，根系生物量較高，富集的鉛總量最多，可應(yīng)用于生物修復(fù)，于每年年底落葉前收割地上部分，從而減少枯枝落葉中的污染物回田，于第3年利用小型農(nóng)機(jī)翻耕土地收獲灌木柳樹(shù)根部，收獲的植物及其根部可通過(guò)燃燒成灰燼，再?gòu)幕覡a中提取出鉛，從而修復(fù)重金屬污染土壤，相應(yīng)縮短修復(fù)年限。

值得一提的是，目前人們發(fā)現(xiàn)土壤電動(dòng)修復(fù)是一種高效的原位修復(fù)技術(shù)。在重金屬污染土壤植物修復(fù)領(lǐng)域，未來(lái)研究重點(diǎn)可以放在超富集植物與生物聯(lián)合修復(fù)的機(jī)理方面[25]。