黃 犀，王歡利，嚴靈君，羅會婷，湯詩杰

(江蘇省中國科學院植物研究所， 江蘇 南京 210014)

南京椴(TiliamiquelianaMaxim)屬椴樹科椴樹屬，是少數(shù)以南京命名的樹種之一，為我國特有種[1-2]。南京椴應(yīng)用價值廣泛，不僅可用于園林觀賞，作為蜜源，還具有一定的生態(tài)價值和文化價值[3-4]。然而，南京椴資源十分有限，國內(nèi)主要集中在江蘇、安徽和浙江等地，呈點狀分散分布，群體數(shù)量較少，自然更新能力差，種群結(jié)構(gòu)呈衰退型，部分種群僅有少數(shù)單株散生于林間，種群極不穩(wěn)定；加之南京椴生境受人為破壞嚴重，群體數(shù)量及個體數(shù)量不斷減少[5-8]。目前，南京椴的育苗繁殖工作仍處于起步階段，其研究主要集中于種子發(fā)芽[9-10]、扦插繁殖[11-12]與直接器官發(fā)生的組織培養(yǎng)[13-15]方面。國內(nèi)椴屬植物研究中，僅有少量關(guān)于南京椴愈傷組織誘導(dǎo)的研究報道[16]。究其原因，主要是南京椴分布范圍不斷縮小，社會認知度不高，其應(yīng)用價值沒有被充分挖掘和利用，而批量化繁育南京椴種苗的企業(yè)則傾向于通過簡單增加播種量的方式提高育苗量，對其他繁育方式關(guān)注度不高。本研究旨在通過摸索植物生長調(diào)節(jié)劑、光照和外植體等條件，簡化并明確南京椴胚性愈傷組織誘導(dǎo)所需的條件，為種苗繁育和遺傳轉(zhuǎn)化提供技術(shù)支持，為種質(zhì)資源的保存和創(chuàng)新打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 外植體選擇試驗

試驗材料選取江蘇省中國科學院植物研究所繼代保存的南京椴組織培養(yǎng)無菌幼苗[15]。在長勢良好的無菌苗高度5 cm左右時，分別剪下葉片、莖和葉柄。選取的葉要盡量大，以便后續(xù)切割，選取的莖段應(yīng)盡量長且粗壯。同批次無菌苗的葉片、莖和葉柄以手術(shù)刀分離后，將葉片切成大小為1.5 cm2左右的小塊，葉柄和莖段則切成長1.5 cm左右的小段。將各外植體分別接種于培養(yǎng)基上，置培養(yǎng)瓶于紙箱中進行愈傷組織誘導(dǎo)的暗培養(yǎng)，溫度在24 ℃左右。待有愈傷組織長出后，轉(zhuǎn)入相應(yīng)強度的光照下培養(yǎng)。根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果及他人研究結(jié)果[16]，選擇在光照培養(yǎng)后第20天進行統(tǒng)計，并對出愈率、褐化率和死亡率分別進行統(tǒng)計分析(n>30)。出愈率(%)=(誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體個數(shù)/接種的外植體個數(shù))×100；褐化率(%)=(褐化的外植體個數(shù)/接種的外植體個數(shù))×100；死亡率(%)=(死亡的外植體個數(shù)/接種的外植體個數(shù))×100。

1.2 植物生長調(diào)節(jié)劑篩選試驗

愈傷組織誘導(dǎo)及其繼代培養(yǎng)在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進行，培養(yǎng)基添加30 g/L蔗糖與8 g/L瓊脂后，分別加入對應(yīng)質(zhì)量濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，pH調(diào)整在5.8—6.0，每個培養(yǎng)瓶中分裝40 mL，在121 ℃下滅菌20 min。植物生長調(diào)節(jié)劑配比見表1。

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度 mg/L

1.3 光照強度選擇試驗

待愈傷組織長出后，放入光照下培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為MS+ 0.1 mg/LBA+1.5 mg/L 2,4-D，光照度分別為低光照強度(500 lx)和高光照強度(2 000 lx)。使用不同層數(shù)的半透明黑塑料膜包裹培養(yǎng)瓶以獲得不同光照強度，使用光照強度計(HANNA,HI97500)測定相應(yīng)光照強度。比較在高光照強度下培養(yǎng)20 d后,再轉(zhuǎn)入低光照強度培養(yǎng)3，6，10 d時，愈傷組織的褐變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基配方中不同外植體來源的愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果

不同培養(yǎng)基配方中不同外植體來源的愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果見表2，其出愈率、褐化率、死亡率的結(jié)果統(tǒng)計分析如表3?？梢钥闯觯?,4-D和6-BA對于南京椴誘導(dǎo)愈傷組織是必需的。但是高質(zhì)量濃度或者低質(zhì)量濃度的2,4-D對于愈傷組織的誘導(dǎo)都會產(chǎn)生負面的影響。在2,4-D質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時，誘導(dǎo)愈傷組織的效果最佳。

表2 不同培養(yǎng)基配方中各種外植體愈傷組織誘導(dǎo)狀況

表3 不同培養(yǎng)基配方中出愈率、褐化率及死亡率 %

A配方為不含植物生長調(diào)節(jié)劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)階段各外植體均沒有任何愈傷組織形成，轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)階段后部分外植體死亡；在含植物生長調(diào)節(jié)劑的處理組中，D配方3種外植體的出愈率均為100.00%,且死亡率均為0，但其褐化率分別為葉柄7.46%、莖段10.94%及葉片7.69%;C配方出愈率略低，分別為葉柄100.00%、莖段96.97%(64/66)及葉片89.55%(60/67)，但愈傷褐化率均為0，死亡率分別為葉柄0、莖段0及葉片4.48%；B，E配方的出愈率接近，均未超過90%，C配方褐化率較低，死亡率較高，而E配方則相反，褐化率在所有配方中是最高的，但其愈傷死亡率均為0。

2.2 不同外植體對愈傷誘導(dǎo)的影響

由表4可以看出，3種外植體的誘導(dǎo)情況具有一定差異，葉柄的出愈率為73.25%，高于莖段和葉片，后2者出愈率接近，分別為68.13%和68.29%。而死亡率則相反，葉片最高為14.94%，其次為莖段13.13%，最低為葉柄12.77%。莖段褐化率最高，為5.00%，葉柄和葉片褐化率分別為3.65%和3.66%。

表4 不同外植體的誘導(dǎo)結(jié)果

2.3 光照條件對南京椴愈傷組織誘導(dǎo)的影響

試驗發(fā)現(xiàn)，在暗培養(yǎng)之后的光培養(yǎng)過程中，低光照強度(500 lx)的培養(yǎng)明顯減緩了愈傷組織的褐化(見表5)。直接轉(zhuǎn)入高光照強度(2 000 lx)的愈傷組織，在培養(yǎng)20 d后，褐化率為80%。隨著低光強度培養(yǎng)時間的增加，褐化率逐漸下降。3 d低光強度培養(yǎng)組的褐化率為26.67%，6 d后的褐化率為16.67%，9 d后的褐化率為13.33%。

表5 不同光照條件下愈傷組織褐化率

3 結(jié)論與討論

2020年度國家自然科學基金項目指南專門指出：一些重要領(lǐng)域如森林培育學、經(jīng)濟林學和林木遺傳育種學等未能凝練出本領(lǐng)域重要的基礎(chǔ)科學問題，林木遺傳育種研究缺少完善的輔助育種和早期選擇體系，關(guān)于基因同源克隆及異源功能驗證項目仍舊多屬跟蹤性研究，存在同質(zhì)化現(xiàn)象[17]。這一問題在南京椴遺傳育種及基礎(chǔ)研究里十分突出，目前已發(fā)表的各項研究僅限于對其生理生化方面的分析討論，分子生物學相關(guān)研究工作尚處于起步階段。雖然目前對南京椴的研究不夠深入，但及時建立一個成熟的南京椴同源轉(zhuǎn)化體系不僅可以方便分子生物學研究工作的開展與深入，完成對南京椴重要基因的功能驗證，更能加速種質(zhì)資源創(chuàng)新速度，成為南京椴林木育種的加速器。同時也可以在此基礎(chǔ)上為其他椴樹屬植物的同源轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建提供借鑒。而提供大量合格愈傷組織，則是建立南京椴同源轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)。

本研究旨在通過摸索植物生長調(diào)節(jié)劑條件、光照條件和外植體條件，簡化南京椴胚性愈傷組織誘導(dǎo)需要的外部因素，從而能為下一步體胚誘導(dǎo)試驗生產(chǎn)合格愈傷組織。同類型工作之前僅劉芳在其碩士學位論文中進行了探索[16]。

不同植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度配比條件對南京椴愈傷誘導(dǎo)的影響有決定性作用。研究表明，許多木本植物的愈傷組織誘導(dǎo)需要2,4-D的參與[18-20]。本研究結(jié)果分析表明，MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基加上30 g/L蔗糖和8 g/L瓊脂后，植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度為 0.1 mg/L BA + 2.0 mg/L 2,4-D 的培養(yǎng)基配方對誘導(dǎo)南京椴愈傷組織的誘導(dǎo)率最高、死亡率最低，但褐化率在7.46%—10.94%。 0.1 mg/L BA+1.5 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基配方對誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)率次高，為89.55%—100%，但其褐化率均為0，且死亡率僅葉片有4.48%，其余2種外植體均為0。劉芳在試驗中使用了BA+2,4-D及BA+NAA植物生長調(diào)節(jié)劑組合，分別進行濃度梯度差異試驗，發(fā)現(xiàn)BA+NAA無法誘導(dǎo)愈傷形成；而BA+2,4-D組合中，2,4-D的最佳質(zhì)量濃度區(qū)間為0.5—1.0 mg/L。其2,4-D的最佳質(zhì)量濃度區(qū)間與本試驗結(jié)論略有差異，可能與使用外植體材料的生理狀態(tài)及物種基因型有關(guān)。

在外植體的選擇上，葉柄要比葉片和莖段在出愈率、褐化率上更加適合作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體。但組織培養(yǎng)生產(chǎn)的無菌葉片數(shù)量上要遠遠多于葉柄，大批量生產(chǎn)愈傷組織時，葉片也可作為外植體加以使用。劉芳試驗則選擇葉片、莖段及根尖作為外植體來源，認為葉片最適宜作為外植體，但其試驗中也發(fā)現(xiàn)葉片近葉柄部位誘導(dǎo)速度最快，愈傷組織質(zhì)量最好。

組織培養(yǎng)褐變的成因是復(fù)雜的，外植體材料的生理狀態(tài)、基因型、生長部位與大小，培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度與光照等多種因素，都會導(dǎo)致褐變的發(fā)生。多酚氧化酶(PPO)在受傷組織中的活性升高，通過作用于酚類物質(zhì), 將其氧化為醌類物質(zhì), 從而引起外植體和愈傷組織褐化[21-22]。在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑或吸附劑，是防止外植體褐變的有效方法。劉芳在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑 Vc，發(fā)現(xiàn)在暗培養(yǎng)條件下，Vc 的抗褐化效果較好，能夠有效控制愈傷組織褐化現(xiàn)象；但光培養(yǎng)條件下，基本不能發(fā)揮抗褐化的功效。研究表明，低溫馴化也可以顯著提高某些植物愈傷組織的抗氧化酶活性[23]。本試驗從簡化愈傷組織誘導(dǎo)的外部條件考慮，選擇2種不同光照度條件進行對比，發(fā)現(xiàn)過早、過高的光照培養(yǎng)，對愈傷組織的生長有顯著負作用，高光照度條件下，愈傷組織死亡率及褐化率均高于低光照度條件。

通過對試驗結(jié)果的分析，以葉柄為外植體，在MS+ 0.1 mg/L BA+ 1.5 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)10 d后在光照強度500 lx下光培養(yǎng)5—7 d，然后再轉(zhuǎn)到正常光照(2 000 lx)培養(yǎng)，為高效誘導(dǎo)南京椴愈傷組織的方法。