呂青蘭 薛源 史楊白

摘要 鱖魚（Siniperca chuatsi）、斑鱖（Siniperca scherzeri）及其雜交鱖（鱖♀×斑鱖♂）為研究對象，采用植物血球凝集素（PHA）和秋水仙素體內(nèi)注射獲得大量有絲分裂中期相的頭腎細胞，直接制片法制備染色體標本后進行染色體組型的研究和分析。結果表明：3種鱖魚染色體數(shù)目皆為2n=48，均未觀察到隨體、次縊痕或其他特殊標志的染色體。鱖、斑鱖和雜交鱖的核型公式分別為2n=8sm+10st+30t（NF=56）、2n=2m+8sm+10st+28t（NF=58）和2n=2sm+12st+34t（NF=50）。該研究鱖和斑鱖的染色體組型與其他水系種群相比有所差異，呈現(xiàn)多態(tài)性。首次報道的雜交鱖染色體組型與父母本皆有不同，顯示了雜交后代復雜的染色體變異。

關鍵詞 鱖;斑鱖;雜交鱖;染色體組型

中圖分類號 S917.4 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）21-0095-05

Abstract Taking Siniperca chuatsi，Siniperca scherzeri and their hybrids[S.chuatsi（♀）×S.scherzeri（♂）]as the research objects，a large number of head kidney cells in mitotic metaphase were obtained by PHA and colchicine injection in vivo，and then the chromosome samples were prepared by direct production method，the karyotypes were studied and analyzed.The results showed that the chromosome number of three species of mandarin fish were all 2n = 48，and no satellite，secondary constriction or other special markers were observed.The karyotype formulae of S.chuatsi，S.scherzeri and their hybrids were 2n=8sm+10st+30t（NF=56），2n=2m+8sm+10st+28t（NF=58） and 2n=2sm+12st+34t（NF=50），respectively.In this experiment，the karyotypes of S.chuatsi and S.scherzeri were different from those of other river populations，showing polymorphism.The karyotype of hybrid mandarin fish reported for the first time was different from that of its parents，which showed the chromosomal intricately mutated in hybrid offspring.

Key words S.chuuatsi;S.scherzeri;Hybrid mandarin fish;Karyotype

基金項目 江蘇省重點研發(fā)計劃（現(xiàn)代農(nóng)業(yè)）項目（BE2017311，BE2018398）;蘇州大學校級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（2019xj069）;江蘇省漁業(yè)科技項目（cx（18）2012-01）。

作者簡介 呂青蘭（1997—），女，江蘇鹽城人，從事魚類生物學研究。*通信作者，副教授，博士，從事水生生物學研究。

收稿日期 2020-05-06

鱖（Siniperca chuatsi）（也稱鱖魚）和斑鱖（Siniperca scherzeri）在分類學上均隸屬于鱸形目 （Perciformes）真鱸科（Percichthyidae）鱖亞科 （Siniperinae）鱖屬（Siniperca），廣泛分布于我國除青藏高原外的其他水系[1-2]。鱖生長速度快、味鮮肉嫩、營養(yǎng)價值高，但抗逆性較低，以活體小型魚蝦類為食。斑鱖營養(yǎng)味美，被譽為“淡水石斑”[3]，具有較強的抗病力，并能攝食冰鮮魚蝦，但生長速度較慢[1，3]。雜交鱖兼?zhèn)潆p親生長快、抗病力強、飼養(yǎng)簡單等優(yōu)良性狀[3-4]，且營養(yǎng)價值較雙親高[5]。

染色體組型（也稱染色體核型，karyotype），一般是染色體數(shù)目、大小、形態(tài)、著絲點位置、隨體、次縊痕以及帶型（G帶、C 帶等）[6]所有染色體可測性狀的總稱。目前，已有對鄱陽湖鱖魚[7]、浙江烏溪江水庫斑鱖[8]等染色體組型的研究報道。研究表明，斑鱖自然群體遺傳多樣性較高，且因區(qū)域、水系的不同而存在明顯的遺傳分化現(xiàn)象，例如福建與廣西的斑鱖存在遺傳差異;鱖魚群體遺傳多樣性略低于斑鱖，但南北方鱖魚的遺傳差異也比較明顯[2，9]。筆者首次分別研究來自于長江水系鱖和黑龍江水系斑鱖及其雜交鱖（鱖♀×斑鱖♂）的染色體組型，以期較全面地掌握不同地域鱖魚、斑鱖的染色體組型特征，并了解種間雜交后代染色體組型的變異情況，進而為魚類雜交新品種的選育、種質鑒定等方面提供遺傳學基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗用魚均取自江蘇省淡水水產(chǎn)研究所常州水產(chǎn)良種繁養(yǎng)基地，鱖來自于長江水域，體長20～30 cm，體重360～400 g;斑鱖來自于黑龍江水域，體長15～20 cm，體重50～100 g;雜交鱖（鱖♀×斑鱖♂）是以上述2種魚為親本的雜交后代，體長22～26 cm，體重200～300 g。每種魚均隨機取樣4尾。水族箱內(nèi)恒溫（23 ?℃）、充氧暫養(yǎng)12 d后用于試驗。

1.2 方法

1.2.1 染色體玻片的制備。

采用林義浩[10]的體內(nèi)注射植物血球凝集素 （PHA） 、活體腎細胞直接制染色體玻片的方法，并參照朱健等[11]、Lu等[12]、劉良國等[13]的方法加以改進。分2次腹腔注射PHA溶液，第一次注射劑量為10 μg/g，繼續(xù)暫養(yǎng)15 h后進行第2次注射，劑量為8 μg/g;5 h后按3 μg/g的劑量注射秋水仙素。2.5 h后，剪斷魚尾、腮絲血管放血15 min，然后取頭腎組織于0.75%生理鹽水中破碎組織，用4層紗布將細胞懸液過濾入50 mL離心管中，加入適量生理鹽水，吹打均勻（100次以上），制成頭腎細胞提取液，2 000 r/min離心8 min，棄上層清液;用 8 mL預熱好的0.075 mol/L KCl低滲液吹打2次，置于37 ℃水浴中處理30 min;加入1 mL固定液預固定1 min;以1 500 r/min轉速離心10 min，棄上清液;加9 mL固定液在37 ?℃水浴中固定30 min;以1 500 r/min離心10 min，棄上清液;重復上述步驟固定3次;最后，棄去大部分上清液，留約1 mL制成細胞懸液，用滴管輕輕吹打均勻;用吸管吸取細胞懸液并從約1 m高處滴在經(jīng)預冷、傾斜30°的潔凈玻片上，輕吹玻片上的細胞懸液使之擴散;自然干燥后用10% Giemsa染色液染色10～15 min;蒸餾水沖洗干凈，空氣中自然干燥;顯微鏡觀察染色體形態(tài)。

1.2.2 染色體組型分析。

顯微鏡觀察后，選取50個分散良好、形態(tài)清晰的染色體中期分裂相進行染色體計數(shù)，統(tǒng)計染色體眾數(shù);選取狀態(tài)良好的中期分裂相的二倍體染色體，在油鏡下進行顯微攝影。選取3個染色體數(shù)目完整、形態(tài)清晰、分散良好的中期分裂相原始圖，放大并編號，并依據(jù)形態(tài)、大小等特征進行配對;使用Image J 1.8.0軟件將照片放大，進行染色體配對和數(shù)據(jù)測量，計算染色體相對長度[染色體相對長度=（每條染色體單體長度/染色體組總長度）×100%]和臂比（臂比=長臂長/短臂長），按照Levan等[14]的命名和分類方法（表1），對每對染色體進行分類、排列，銳化處理后獲得染色體組型圖。

2 結果與分析

2.1 染色體數(shù)目

油鏡下分別統(tǒng)計鱖、斑鱖和雜交鱖染色體中期分裂相各50個。由表2可知，鱖、斑鱖和雜交鱖的染色體眾數(shù)分布率分別為86%、84%和78%，因而可確定鱖、斑鱖、雜交鱖這3種鱖魚的二倍體染色體數(shù)目皆為48。

2.2 染色體組型分析

2.2.1 鱖染色體組型。

根據(jù)鱖染色體大小和形態(tài)，結合臂比和相對長度進行同源染色體配對，共配成24對染色體（圖1，表3）。按照Levan命名法，鱖的染色體可分為3組，其中4對亞中部著絲粒染色體（sm組）、5對亞端部著絲粒染色體（st組）和15對端部著絲粒染色體（t組）（圖1，表3），其核型公式為2n=48=8sm+10st+30t，染色體臂數(shù)（NF）為56。

2.2.2 斑鱖染色體組型。

根據(jù)斑鱖染色體大小和形態(tài)，結合臂比和相對長度進行同源染色體配對，共配成24對染色體（圖2、表4）。斑鱖的染色體可以分為4組，其中1對中部著絲粒染色體（m組）、4對亞中部著絲粒染色體（sm組）、5對亞端部著絲粒染色體（st組）和14對端部著絲粒染色體（t組）（圖2、表4），其核型公式為2n=48=2m+8sm+10st+28t，染色體臂數(shù)（NF）為58。

2.2.3 雜交鱖染色體組型。

根據(jù)雜交鱖染色體大小、形態(tài)，結合臂比和相對長度進行同源染色體配對，共配成24對染色體（圖3、表5）。雜交鱖的染色體可以分為3組，其中1對亞中部著絲粒染色體（sm組）、6對亞端部著絲粒染色體（st組）和17對端部著絲粒染色體（t組）（圖3、表5），其核型公式為2n=48=2sm+12st+34t，染色體臂數(shù)（NF）為50。

3 討論

3.1 鱖、斑鱖染色體組型特征

鱖染色體組型在國內(nèi)外已有不少報道[7，11，15-18]。該研究結果顯示，鱖染色體眾數(shù)為2n=48，核型公式為2n=8sm+10st+30t（NF=54）。染色體數(shù)目、染色體配對與臂數(shù)的結果與已有報道的結論是一致或相似的，但在著絲點位置的確定和染色體分組上存在一定的差異。該研究的長江水系鱖核型公式與朱健等[11]報道的蘇州太湖鱖（同屬長江水系）染色體組型2n=48（6sm+12st+30t，NF=56）相似，但與楊春等[7]報道的鄱陽湖鱖染色體組型2n=48（24sm，st+ 24t，NF=72）差異較大，存在著sm 染色體減少的現(xiàn)象。這可能是由于鱖的地理差異引起的遺傳分化現(xiàn)象，但還有待采用分子遺傳學等方法做進一步驗證。其中臂數(shù)的巨大差異可能是由于與楊春等[7]報道的st組染色體臂數(shù)確定標準不一樣導致的。該研究結果表明黑龍江水系斑鱖染色體組型為2n=48（2m+8sm+10st+28t，NF=58），與張曉輝等[8]報道的浙江烏溪江水庫斑鱖染色體組型2n=48（4m+10sm+4st+30t，NF=62）相似，但與余先覺等[17]報道的斑鱖染色體組型2n=48（6sm+14st+28t，NF=54）相比存在m染色體增多的現(xiàn)象，這一較大的差異是否表明斑鱖存在亞種或地理種群有待進一步研究。李樹深[19]指出，在特定的分類階元中，具有較多中部著絲粒染色體（m）和亞中部著絲粒染色體（sm）為較特化類群，具有較多端部著絲粒染色體（t）為較原始類群，因此可認為鱖、斑鱖均屬于較特化類群。通過該研究的大量試驗以及查閱相關研究報道后發(fā)現(xiàn)，造成同種魚類染色體組型特征差異的原因是多方面的，主要包括：①觀察時間點差異。若染色體分裂相不處于中期，而是偏向染色體縮短的中后期時，就很容易把亞端部和端部著絲粒染色體錯誤分類，因此必須采用多時間點、多樣本采樣加以糾正。②不同研究者采用試驗方法、滴片方法、測量手段、確定著絲點的位置等方法的不同都可能造成實驗數(shù)據(jù)的差異。因此，需要制定統(tǒng)一標準，以便用于科學的種質分類。③地域環(huán)境差異。魚類在演化過程因地域環(huán)境差異，可能發(fā)生了染色體臂間易位、倒位等結構重排[20]，從而引起染色體多態(tài)性。因此，需要利用更多的生物學方法進行深入研究。該研究結果顯示，鱖和斑鱖的染色體組型公式較為相似，因此雜交親和性高，不存在生殖隔離，容易獲得正常發(fā)育的胚胎，并能培育出發(fā)育良好的雜交鱖。已有雜交鱖培育成功的報道[3-4，21]也證實了這一假設。

3.2 雜交鱖與其雙親染色體組型特征的比較 筆者首次報道了雜交鱖的染色體組型特征。結果顯示，染色體數(shù)目與雙親相同，且短臂上均未見隨體、次縊痕;但缺少父本斑鱖的中部著絲粒染色體，且比雙親少了3對亞中部著絲粒染色體;而比雙親多了1對亞端部著絲粒染色體，且分別比母本鱖和父本斑鱖分別多了2對和3對端部著絲粒染色體。這表明，雜交鱖的染色體組型是由2個親本的染色體經(jīng)過較復雜的遺傳重組后形成的。從雜交鱖的表型特征來看，除體型和生長速度更接近母本鱖魚外，其抗病力強、肉質細嫩、體色花紋等均較接近父本斑鱖[3]。這表明雜交鱖兼具雙親的遺傳性狀，顯示出良好的雜交優(yōu)勢。但是，關于雜交鱖與雙親更深入的親緣關系還有待進一步研究。

3.3 魚類有絲分裂中期分裂相的獲取

與哺乳動物相比，魚類有絲分裂中期染色體具有形態(tài)小、數(shù)量多、分裂少等特點。因此，制備具有大量、形態(tài)清晰、染色體數(shù)目完整的中期分裂相玻片具有較大難度。在該試驗過程中發(fā)現(xiàn)，將飼養(yǎng)水溫等環(huán)境條件控制在試驗魚的最適生理狀態(tài)下，并采用2次注射PHA的方法，可獲得較多理想的中期分裂相;此外，PHA和秋水仙素的作用劑量和時間也對染色體制片效果產(chǎn)生影響。據(jù)有關文獻記載[22]，PHA劑量在8～10 μg/g是安全的，超過20 μg/g可能會導致某些魚類死亡;秋水仙素通常的作用劑量范圍為1～5 μg/g，作用時間為2～3 h，若用量過大或處理時間過長，會導致染色體的過分凝縮或著絲點裂解，最終導致染色體形態(tài)不正常，甚至被破壞或溶解;濃度過低或處理時間過長，則分裂相過少[22]。該研究進行了預固定操作，因為預固定有利于細胞提前適應溶液的酸性環(huán)境，預先固定染色體形態(tài)，有利于獲得理想的染色體分裂相[23]。冰乙酸的純度以及甲醇與冰乙酸的配制比例對分裂相的獲得也有很大的影響。該研究所用固定液為甲醇∶冰乙酸（分析純）按1∶2（V/V）配比混合;若冰乙酸是優(yōu)級純，則甲醇∶冰乙酸應按3∶1（V/V）配制才可以獲得較多的分裂相[23]。另外，選取合適的組織是制備染色體標本的前提，該研究優(yōu)選了生命活動旺盛、分裂增殖較快的頭腎組織，取得了較滿意的效果。

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