乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中survivin與NF-κB的表達(dá)及其臨床意義

（鄭州人民醫(yī)院 病理科，河南 鄭州450003）

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率有上升趨勢(shì)，侵襲和轉(zhuǎn)移是死亡的主要原因，腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多基因多步驟的復(fù)雜過(guò)程，研究腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。凋亡抑制基因生存素（survivin）是目前已知的最強(qiáng)凋亡抑制基因，在多數(shù)腫瘤中過(guò)表達(dá)，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[1-3]，其高表達(dá)可以作為腫瘤不良預(yù)后的獨(dú)立因子[4]。最近研究表明，survivin的檢測(cè)有助于乳腺癌預(yù)后的判斷[5]。核因子κB（NF-κB）是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞分化和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的分化和凋亡，在細(xì)胞癌變過(guò)程中發(fā)揮重要作用，許多腫瘤包括血液腫瘤和實(shí)體瘤中均發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)通路的持續(xù)激活。最近研究表明，在乳腺癌中，多種基因如NF-κB受體激活因子配體c（receptor activator of NF-κB ligand c，RANKL-c）、NF-κB相互作用的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（NF-κB interacting long noncoding RNA，lncRNA-NKILA）等[6-7]可以通過(guò)抑制NF-κB的激活減弱乳腺癌的侵襲，STAT3基因能夠激活NF-κB促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展[8]。乳腺癌組織中survivin和NF-κB的相關(guān)性尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，國(guó)內(nèi)在腎癌[9]、卵巢癌[10]、胃癌[11]及膠質(zhì)瘤[12]中有文獻(xiàn)報(bào)道，且研究表明survivin和NF-κB表達(dá)呈正相關(guān)，乳腺癌組織中survivin和NF-κB的關(guān)系尚不清楚。乳腺癌的預(yù)后與其分子亞型密切相關(guān)，survivin和NF-κB蛋白的表達(dá)與分子亞型有何關(guān)系？由于浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌占據(jù)乳腺癌的大部分，為了解乳腺癌中survivin和NF-κB的表達(dá)情況，以及兩者是否存在相關(guān)性，因此本研究分析80例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中survivin和NF-κB表達(dá)的臨床病理學(xué)特征的關(guān)系及兩者的相關(guān)性，旨在觀察survivin和NF-κB在乳腺癌發(fā)生發(fā)展的作用，以拓展和豐富對(duì)乳腺癌分子標(biāo)志物的認(rèn)識(shí)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

選擇2015年5月—2017年5月在鄭州人民醫(yī)院乳腺外科行手術(shù)治療、術(shù)后經(jīng)病理確診且病歷完整的患者作為研究對(duì)象。研究樣本為80例乳腺原發(fā)浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌病理活檢標(biāo)本及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織。按照2012年WHO乳腺癌組織病理分級(jí)分類法，對(duì)其進(jìn)行分組。根據(jù)12屆St．Gallen專家共識(shí)的乳腺癌分子分型標(biāo)準(zhǔn)，在80例乳腺癌患者中，luminal A型23例，luminal B型17例，HER-2過(guò)表達(dá)型占19例，基底樣亞型占21例。有完整5年隨訪資料的患者71例，患者無(wú)病生存期從手術(shù)之日開(kāi)始計(jì)算，終止日期為腫瘤復(fù)發(fā)日期或末次隨訪日。所有標(biāo)本均經(jīng)10%的甲醛固定，石蠟包埋，并經(jīng)鄭州人民醫(yī)院病理科診斷確診。

1.2 主要試劑

survivin和NF-κB一抗兔抗人單克隆抗體（即用型）、二抗及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）均為福州邁新公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

主要步驟如下：⑴ 石蠟組織切片、烤片、脫蠟并水化；⑵ 抗原修復(fù)；⑶ 一抗37℃孵育2 h；⑷ 二抗37℃孵育20～30 min；⑸ DAB顯色5～10 min；⑹ 脫水、透明和封片。用已知survivin和NF-κB陽(yáng)性的乳腺癌組織和PBS分別代替一抗作為陽(yáng)性和空白對(duì)照。

1.4 免疫組化結(jié)果判斷

根據(jù)染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分。低表達(dá)包括：⑴ 陰性即無(wú)陽(yáng)性著色；⑵ 弱陽(yáng)性（+或者++，細(xì)胞著色范圍＜30%）。高表達(dá)包括：⑴ 中等強(qiáng)度陽(yáng)性（++，細(xì)胞著色范圍≥30%或者+++，細(xì)胞著色范圍＜50%）；⑵ 強(qiáng)陽(yáng)性（+++，細(xì)胞著色范圍＞50%）。本研究中陽(yáng)性表達(dá)率=高表達(dá)樣本量/總樣本含量，免疫組化的判讀有兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行判讀。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析survivin和NF-κB陽(yáng)性表達(dá)率和病理因素的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法，并以Log-rank法檢驗(yàn)；采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素生存分析。兩者的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 survivin和NF-κB 在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)

survivin和NF-κB主要定位于細(xì)胞漿，在乳腺癌旁組織中低表達(dá)或不表達(dá)，在癌組織中呈明顯高表達(dá)。80例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中，survivin在癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)表達(dá)率53.75%（43/80），癌旁組織為11.25%（9/80），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=32.934，P=0.000）；NF-κB在癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為56.25%（45/80），癌旁組織為8.75%（7/80），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=41.140，P=0.000）（圖1）。

2.2 survivin和NF-κB 分別與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系

80例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中，survivin與NF-κB的表達(dá)均與組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，即在高分化、中分化、低分化癌組織表達(dá)依次升高；兩者的表達(dá)均為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；survivin與NF-κB的表達(dá)均與TNM分期有關(guān)，均為III+IV期組高于I+II期組；兩者的表達(dá)均與乳腺癌分子亞型有關(guān)，均為在HER-2過(guò)表達(dá)型和基底樣亞型中表達(dá)率高于luminal A型和luminal B型中，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。兩者的表達(dá)均與乳腺癌患者年齡、腫瘤位置和腫瘤直徑均無(wú)明顯關(guān)系（均P＞0.05）（表1）。

2.3 survivin和NF-κB 共表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

80例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中，survivin和NF-κB共表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及分子亞型有關(guān)。兩者共同高表達(dá)率在低分化乳腺癌、有淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移、TNM III+IV期組、HER-2過(guò)表達(dá)型和基底樣亞型中明顯升高，而兩者共低表達(dá)率中-高分化、無(wú)淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移、TNMI+II期、luminal A型與luminal B型組中較高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。兩者共表達(dá)與年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑無(wú)明顯關(guān)系（均P ＞0.05）（表2）。

表2 survivin和NF-κB 共表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table2 Relations of co-expression of survivin and NF-κB with clinicopathological characteristics of invasive ductal breast carcinoma [n (%)]

2.4 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中survivin和NF-κB的相關(guān)性

80例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中，survivin和NF-κB同時(shí)高表達(dá)者35例（43.75%），同時(shí)低表達(dá)者27例（33.75%），僅survivin高表達(dá)者8例（10%），僅NF-κB高表達(dá)者10例（12.5%）。采用Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示survivin和NF-κB表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.546，P=0.000）（表3）。

表3 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中survivin和NF-κB的相關(guān)分析（n）Table3 Correlation analysis of survivin and NF-κB in invasive ductal breast carcinoma (n)

2.5 survivin和NF-κB蛋白表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

71例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者5年總體無(wú)病生存率為66.2%。survivin蛋白高表達(dá)者的無(wú)病生存率低于低表達(dá)者（53.8%vs.81.3%，χ2=7.134，P=0.008）；NF-κB蛋白高表達(dá)者無(wú)病生存率低于低表達(dá)者（51.2%vs.89.3%，χ2=12.171，P=0.000）。survivin和NF-κB共同高表達(dá)、單一指標(biāo)高表達(dá)、survivin和NF-κB均低表達(dá)無(wú)病生存率分別為50.0%、70%、88.0%，三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.344，P=0.003）（圖2）。Cox回歸模型分析顯示，NF-κB、survivin與NF-κB共表達(dá)、腫物直徑、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05）（表4）。

圖2 survivin和NF-κB蛋白表達(dá)與乳腺癌患者無(wú)病生存期的關(guān)系 A：不同survivin 蛋白表達(dá)狀態(tài)患者無(wú)病生存曲線；B：不同NF-κB蛋白表達(dá)狀態(tài)患者無(wú)病生存曲線；C：不同survivin與NF-κB蛋白表達(dá)狀態(tài)患者無(wú)病生存曲線Figure2 Relations of survivin and NF-κB protein expressions with disease-free survival of breast cancer patients A:Disease-free survival curves of patients with different survivin expression statuses; B:Disease-free survival curves of patients with different NF-κB expression statuses; C:Disease-free survival curves of patients with different survivin and NF-κB expression statuses

表4 乳腺癌患者預(yù)后多因素生存分析Table4 Multivariate survival analysis of breast cancer patients

3 討 論

研究[3,13-15]表明，survivin在惡性腫瘤組織中如肝內(nèi)膽管癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等腫瘤中高表達(dá)，而在正常分化的成人組織中無(wú)表達(dá)，對(duì)惡性腫瘤的診斷和治療有重要應(yīng)用意義。survivin在腫瘤組織發(fā)揮作用主要是通過(guò)腫瘤細(xì)胞凋亡異常使得細(xì)胞逃脫正常的監(jiān)控機(jī)制，從而發(fā)生細(xì)胞分裂異常以及對(duì)放療、化療的耐受，以survivin為靶點(diǎn)的腫瘤治療成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[16-18]。Tanaka等[19]研究乳腺癌中survivin表達(dá)率70.7%（118/167）明顯高于本研究中的53.75%（43/80），原因可能跟樣本含量或者免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。本研究對(duì)80例乳腺癌組織檢測(cè)了survivin的表達(dá)情況，通過(guò)分析survivin的表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)低分化及TNM分期越高，survivin的表達(dá)增加，這提示survivin的高表達(dá)與乳腺癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。survivin在乳腺癌中的表達(dá)與與臨床病理特征的關(guān)系與以往文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13,15,19]。不同的是有文獻(xiàn)報(bào)道survivin與腫瘤的直徑相關(guān)，即在腫瘤直徑＞2 cm，survivin表達(dá)較高[13]。本研究發(fā)現(xiàn)survivin與腫瘤直徑無(wú)關(guān)，分析其原因如下：⑴ 本研究選取的乳腺癌標(biāo)本是乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；⑵ 本研究樣本含量對(duì)臨床分期沒(méi)有限制，而該文獻(xiàn)中選取的是臨床I～I(xiàn)II期乳腺癌樣本；⑶ 免疫組織化學(xué)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)不同。survivin在浸潤(rùn)性乳腺癌的各分子亞型中的表達(dá)文獻(xiàn)報(bào)道較少見(jiàn)。本研究中survivin陽(yáng)性表達(dá)率在HER-2過(guò)表達(dá)型和基底樣型較luminal A型和luminal B型表達(dá)率較高，生存分析表明survivin蛋白表達(dá)越高，其無(wú)病生存率越低，這表明survivin在一定程度可以反映乳腺癌的分子分型及預(yù)后判斷。國(guó)內(nèi)張緒良等[20]報(bào)道浸潤(rùn)性乳腺癌呈現(xiàn)為survivin高陽(yáng)性表達(dá)情況，以luminal B型分子亞型最為多見(jiàn)，與本研究報(bào)道存在一定的差異。因此尚需要大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)一步觀察survivin在乳腺癌不同分子亞型中的表達(dá)及臨床意義。

近年來(lái)，NF-κ B 通過(guò)炎癥誘發(fā)腫瘤受到研究者關(guān)注，它可作用于微環(huán)境，通過(guò)促進(jìn)炎癥反應(yīng)激活腫瘤干細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制凋亡[21-22]。在人的乳腺癌[23]、胃癌[24]、結(jié)腸癌[25]等腫瘤的研究中也顯示NF-κB的活化或表達(dá)發(fā)生改變，提示細(xì)胞在惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中NF-κB起著重要作用。國(guó)內(nèi)趙鳳輝等[26]報(bào)道102例浸潤(rùn)性乳腺癌中NF-κB陽(yáng)性率（89.2%，91/102）顯著高于癌旁組織（10.8%，11/102），其高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與分化程度無(wú)關(guān)。本研究顯示，NF-κB在乳腺癌中的陽(yáng)性率顯著高于在癌旁組織，腫瘤分化低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期晚的病例，NF-κB表達(dá)較高，提示NF-κB與乳腺癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究顯示NF-κB與組織學(xué)分化有關(guān)與以往文獻(xiàn)報(bào)道[27]存在差異，其原因如下：⑴ 免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)不一；⑵ 樣本的組織學(xué)類型不同，本研究只包括浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，而該文獻(xiàn)中研究對(duì)象除了浸潤(rùn)性性導(dǎo)管癌外，還包括小葉癌、乳頭狀癌等特殊亞型的癌。NF-κB在浸潤(rùn)性乳腺癌的各分子亞型中的表達(dá)尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究中NF-κB陽(yáng)性表達(dá)率在HER-2過(guò)表達(dá)型和基底樣型較luminal A型和luminal B型表達(dá)率高，生存分析表明NF-κB蛋白表達(dá)越高，其無(wú)病生存率越低，這表明NF-κB在一定程度可以反映乳腺癌的分子分型及預(yù)后判斷。

乳腺癌survivin和NF-κB的相關(guān)性尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，國(guó)內(nèi)在腎癌、卵巢癌、胃癌、膠質(zhì)瘤、肝癌等[9-12,27]腫瘤中有文獻(xiàn)報(bào)道，且上述文獻(xiàn)研究表明survivin和NF-κB表達(dá)呈正相關(guān)，乳腺癌組織中survivin和NF-κB的關(guān)系尚不清楚。本研究表明，survivin和NF-κB共表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及分子亞型有關(guān)，兩者共同高表達(dá)在HER-2過(guò)表達(dá)型和基底樣亞型表達(dá)率較高，Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，survivin和NF-κB兩者共表達(dá)患者預(yù)后更差，Cox回歸模型分析兩者共表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素之一，Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示80例乳腺癌中survivin和NF-κB表達(dá)呈正相關(guān)，這提示兩者在乳腺癌中可能存在協(xié)同作用，共同促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步文獻(xiàn)研究表明，survivin能夠通過(guò)減弱p53對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中NF-κB表達(dá)產(chǎn)生抑制作用[28]。Cui等[29]研究表明在膀胱癌中，NF-κB通過(guò)上調(diào)survivin的表達(dá)抑制腫瘤的凋亡，促進(jìn)腫瘤的增殖。最近的研究表明在食管癌中survivin短發(fā)夾RNA表達(dá)下調(diào)能夠抑制NF-κB的磷酸化[30]。因此，對(duì)乳腺癌中survivin和NF-κB兩者相互作用的機(jī)制，有必要在分子水平進(jìn)一步探討。

綜上所述，免疫組化檢測(cè)survivin和NF-κB可用于評(píng)價(jià)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌臨床病理狀態(tài)，兩者存在協(xié)同作用共同促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。本文僅從蛋白水平對(duì)其進(jìn)行了研究，對(duì)乳腺癌中的survivin和NF-κB表達(dá)規(guī)律及相互作用的更深層次的研究，將有可能在分子水平上進(jìn)一步揭示乳腺癌發(fā)生的機(jī)制，并為其基因的靶向治療提供一定的理論依據(jù)。