顏永聰， 溫 凱， 毛 凱， 肖治宇， 王 捷

中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院 肝膽外科， 廣州 510120

原發(fā)性肝癌是最常見的致死性腫瘤之一，在常見的腫瘤類型中位列第六，死亡率排名第二[1]。國際癌癥研究機構(gòu)發(fā)布的《GLOBOCAN2018》報告稱，每年約有841 000例肝癌新發(fā)病例和782 000例肝癌死亡病例[2]。肝細胞癌(HCC，以下簡稱肝癌)占原發(fā)性肝癌的70%～90%[3]。我國肝癌的發(fā)病率和死亡率在腫瘤中分別位居第四位和第三位[4-5]，嚴重威脅我國人民群眾的生命健康。目前廣泛認為肝癌的發(fā)生發(fā)展與多種危險因素密切相關(guān)，包括肝炎病毒感染、黃曲霉素、酒精濫用和肝臟自身代謝的異常等[6]。HBV感染是肝癌的主要危險因素，特別是在東亞和撒哈拉以南非洲地區(qū)，其危險性明顯高于HCV感染、黃曲霉毒素污染的食品、大量飲酒、肥胖、吸煙和2型糖尿病[3]。在全球范圍內(nèi)，約有20億人感染HBV，超過3.5億人已成為慢性攜帶者[7]。盡管我國推廣針對HBV的免疫規(guī)劃，病毒性肝炎的新發(fā)病例數(shù)量在顯著下降，但是慢性乙型肝炎仍影響著將近9000萬人，是肝癌的主要病因，并且與肝癌的惡性進展、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]。鑒于HBV感染引發(fā)的肝癌在所有肝癌病例中占比大，而且HBV參與肝癌的發(fā)生發(fā)展有其特殊的病理過程，相應(yīng)的診療策略存在不同，所以HBV感染引發(fā)的肝癌有別于其他病因?qū)е碌母伟?，可以看作是肝臟的一種特殊的腫瘤，被稱為HBV相關(guān)肝癌(HBV-HCC)。

HBV-HCC發(fā)病機制錯綜復(fù)雜[9]。本文在近年來相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上，歸納總結(jié)HBV-HCC發(fā)生發(fā)展過程中的重要因素，包括HBV X蛋白(HBx)、免疫失衡以及病毒DNA整合等，同時結(jié)合本課題組的研究方向及成果，著重敘述HBx與細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成和凋亡的關(guān)系及其在HBV-HCC中的作用及機制，以期對HBV-HCC的防治工作帶來新的思考。

1 HBV基因組結(jié)構(gòu)和HBV-HCC的發(fā)生發(fā)展機制

HBV屬于嗜肝病毒科，是一種部分雙鏈環(huán)狀DNA病毒。它的基因組包含四個重疊的開放閱讀框，編碼四種蛋白質(zhì)，分別為pre-S/S(病毒表面蛋白)、C(病毒核心蛋白)、P(病毒聚合酶)和X (HBx蛋白)[10-11]。

HBV通常是通過HBx、免疫失衡以及病毒DNA整合入宿主基因組從而參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。(1)HBx是一種由HBV編碼的癌蛋白，研究[12-13]表明HBx可以作為癌基因或輔助因子，通過改變細胞的正常生理機制促進肝癌的發(fā)生發(fā)展；(2) HBV感染宿主后由免疫系統(tǒng)激活誘導(dǎo)T淋巴細胞攻擊被HBV感染的肝細胞，肝細胞壞死后引起炎癥，通過激活成纖維細胞導(dǎo)致肝纖維化進而導(dǎo)致肝硬化。此外由HBV感染導(dǎo)致的免疫反應(yīng)可引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)并產(chǎn)生活性氧(ROS)，對DNA造成氧化損傷，DNA損傷的累積會進一步導(dǎo)致肝癌的進展[14]；(3)在85%～90%的HBV-HCC病例中，HBV基因組會整合到宿主基因組中，經(jīng)過整合的基因還有進一步發(fā)生突變的可能，而這些會導(dǎo)致宿主基因組的不穩(wěn)定以及各種細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑的紊亂，進而促進肝癌的進展[15-16]。

2 HBx與HBV-HCC

HBx由HBV基因組的第四個開放閱讀框編碼，由145～154個氨基酸構(gòu)成，是一種分子量為17 kD的多功能蛋白質(zhì)，主要存在于HBV陽性肝細胞的細胞核中，細胞質(zhì)中也有一定的累積，在HBV-HCC患者的腫瘤中經(jīng)常被檢測到，目前研究認為HBx是HBV感染致癌的重要因素，雖然不能結(jié)合于宿主細胞DNA序列上，但可通過與多種轉(zhuǎn)錄因子作用、反式轉(zhuǎn)錄激活、蛋白相互作用、改變DNA甲基化狀態(tài)、翻譯后修飾等多種形式影響細胞周期和細胞轉(zhuǎn)化等關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終促進肝癌的發(fā)生與發(fā)展[17-18]。在這里，作者將結(jié)合近年來現(xiàn)有的研究，從以下不同角度闡明HBx在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用和相關(guān)機制。

2.1 HBx與細胞增殖 HBx可通過調(diào)控非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)促進肝癌細胞增殖。ncRNA主要包括長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和microRNA(miRNA)。盡管ncRNA不能編碼蛋白質(zhì)，但是越來越多的證據(jù)表明它們在細胞增殖、細胞周期控制、抗凋亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移中具有多種重要的生物學(xué)功能。

lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的ncRNA，其通過基因調(diào)控在遺傳、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上參與多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展。最近的研究表明，HBx通過調(diào)控lncRNA促進肝癌細胞增殖在癌變過程中起關(guān)鍵作用。本團隊報道了一種同時受HBx和SMYD3調(diào)控的新型lncRNA，并將其命名為lncIHS(HBx芯片與SMYD3芯片之間的lncRNA交集)，發(fā)現(xiàn)lncIHS在細胞質(zhì)和細胞核中均有分布，主要位于細胞核中。lncIHS可能通過激活ERK和AKT信號傳導(dǎo)及其下游分子(例如c-Myc，Cyclin D1和EMT相關(guān)基因)進而促進肝癌細胞遷移，侵襲和增殖；與癌旁組織相比，肝癌組織中l(wèi)ncIHS表達顯著增加(P<0.01)；肝癌中l(wèi)ncIHS的高表達與HBV感染(P=0.002)、腫瘤較大(P=0.018)、門靜脈侵犯(P=0.003)和TNM高分期 (P=0.002)相關(guān)。此外，具有高lncIHS表達的肝癌患者的總體生存期和無病生存期較短(P值均<0.01)；所以lncIHS可能是肝癌預(yù)后的候選生物標志物和潛在的治療靶點[19]。在Yu等[20]的研究中發(fā)現(xiàn)lncRNA-6195通過抑制ENO1的酶活性抑制肝癌的生長，而在HBV-HCC中HBx通過下調(diào)lncRNA-6195的表達促進肝癌的進展。

miRNA是一種21～23個核苷酸的RNA分子，可以調(diào)節(jié)靶mRNA的穩(wěn)定性或翻譯效率。miRNA在腫瘤生物學(xué)的幾乎所有方面都具有作用，例如增殖、凋亡、侵襲/轉(zhuǎn)移和血管生成等。HBx可通過調(diào)控miRNA促進肝癌細胞增殖。在本團隊早期的研究中，發(fā)現(xiàn)HBx在體外改變了肝癌細胞中miRNA表達譜，包括對miRNA-16家族的抑制。此外HBx介導(dǎo)的HepG2細胞中miRNA-15a/16的下調(diào)是通過c-Myc介導(dǎo)的，而體外表達的miRNA-15a/16通過誘導(dǎo)細胞周期阻滯和凋亡抑制HepG2-hbx細胞的增殖、克隆原性和不依賴于貼壁的生長[21]。此外，其他團隊的多項研究[22-33]表明，HBx通過下調(diào)miRNA-18b、miRNA-137、miRNA-548p、miRNA-1236、miRNA-329、miRNA-124以及上調(diào)miRNA-135b、miRNA-539、miRNA-3928v、miRNA-5188、miRNA-155、miRNA-520e和miRNA-181b促進肝癌細胞增殖。

2.2 HBx與細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移 HBx通過多種機制促進肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。比如，Liu等[34]的研究表明HBx刺激NF-κB信號傳導(dǎo)并增加血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，后者進而促進肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Han等[35]研究發(fā)現(xiàn)HBx與過氧化物酶體的特定分布可能通過增加細胞ROS水平從而增加肝癌細胞的侵襲能力。除此之外， lncRNA和miRNA在HBx促進肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移中同樣發(fā)揮著重要作用。本團隊的研究[36]發(fā)現(xiàn)lncRNA WEE2-AS1在肝癌組織中過表達，尤其是在HBV陽性肝癌組織中明顯上調(diào)，Western Blot分析進一步證實WEE2-AS1可以上調(diào)FERMT3并激活PI3K/AKT/GSK3b信號通路，進而促進肝癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。另外還發(fā)現(xiàn)了一個新的lncRNA LINC01352，它在HBV/HBx陽性肝癌組織和細胞中顯著下調(diào)，作為腫瘤抑制基因參與HBx誘導(dǎo)的HBV-HCC進展，進一步的實驗發(fā)現(xiàn)HBx/ERα復(fù)合物通過調(diào)控LINC01352-miRNA-135b-APC軸參與肝癌進展的過程[27]。在Liang等[37]的研究中發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞中l(wèi)ncRNA-SOX2OT的上調(diào)可能導(dǎo)致肝癌微環(huán)境中PKM2含量升高，從而激活糖酵解途徑，最終促進腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，而miRNA-122-5p的表達可以抑制lncRNA-SOX2OT的表達。Xie等[38]的研究表明，miRNA-6875-3p表達升高，并可通過BTG2/FAK/Akt途徑促進肝癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。Zhao等[39]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-26a通過抑制PTEN促進肝癌的侵襲/轉(zhuǎn)移，并通過抑制肝癌中的EZH2抑制細胞增殖。

2.3 HBx與血管形成 眾所周知，肝癌是一種高度血管化的實體瘤，血管生成對于肝癌的生長和轉(zhuǎn)移非常重要。實際上，血管生成是血管生長和成熟的驅(qū)動因子之間失衡的結(jié)果，包括VEGF-A、B、C、和D,成纖維細胞生長因子，血小板源生長因子，血管生成素，肝細胞生長因子，內(nèi)皮素(CD105)和其他因子等。缺氧被認為是刺激腫瘤血管生成的強烈因素[40-41]。目前，大多數(shù)研究肝癌低氧介導(dǎo)機制的體外和體內(nèi)肝癌模型關(guān)注低氧誘導(dǎo)因子蛋白的上調(diào)，其誘導(dǎo)促血管生成因子表達上調(diào)，后者可通過MAPK和PI3K/Akt/mTOR途徑激活內(nèi)皮細胞酪氨酸激酶和隨后的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，進而導(dǎo)致肝癌腫瘤血管生成[42]。據(jù)報道[43-44]，HBx可上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性以及VEGF和血管生成素2的表達，從而促進血管生成。

2.4 HBx與細胞凋亡 HBx誘導(dǎo)的肝癌相關(guān)細胞凋亡可通過激活多個胞內(nèi)信號通路包括p53通路、MAPK通路等實現(xiàn)的。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子p53是一種抑癌基因,其主要功能是監(jiān)測DNA復(fù)制和細胞分裂，阻斷細胞周期進程并誘導(dǎo)凋亡以維持基因組完整性，當細胞受到內(nèi)源性或外源性刺激時，由抑癌基因p53及其下游靶基因包括p21CIP/WAF1、Bax、TGFα、EGFR組成的p53途徑被激活，p21CIP/WAF1抑制可誘導(dǎo)pRb磷酸化的cyclin-CDK復(fù)合物，隨后阻止E2F1的釋放，導(dǎo)致細胞周期停滯在G1期，最終誘導(dǎo)細胞凋亡[45]。p53與HBx之間的相互作用已被廣泛證實，在轉(zhuǎn)錄水平上，HBx可以抑制p53啟動子活性，并顯著下調(diào)HBx轉(zhuǎn)染細胞中p53的mRNA水平；在蛋白質(zhì)水平上，HBx可直接與p53相互作用并抑制p53功能，這可能對早期肝癌的發(fā)生至關(guān)重要。有研究[46-49]表明，HBx可抑制p53、TGFβ、Fas和TNF誘導(dǎo)的細胞凋亡，下調(diào)Wnt/catenin的表達；或通過p38/MAPK途徑和SATB1蛋白激活HURP的表達，導(dǎo)致抗凋亡蛋白積聚，最終抑制肝癌細胞凋亡。

對于無法手術(shù)或已經(jīng)遠處轉(zhuǎn)移的肝癌患者，索拉非尼是目前的一線治療藥物。然而在索拉非尼的臨床應(yīng)用中，出現(xiàn)了獲得性耐藥的現(xiàn)象，尤其是在HBV-HCC中，其耐藥機制目前仍未清楚。本團隊研究發(fā)現(xiàn)HBV感染可通過調(diào)控miRNA-193b及其下游靶蛋白Mcl-1促進肝癌細胞對于索拉非尼的耐藥；過表達miRNA-193b能夠促進索拉非尼介導(dǎo)的肝癌細胞凋亡，改善耐藥現(xiàn)象[50]。另外作者首次提出HBx通過細胞內(nèi)聚積，可以上調(diào)P-Raf和P-Erk的活性，激活MAPK通路，參與Bortezomib在HBV相關(guān)肝癌中的靶向耐藥。進一步發(fā)現(xiàn)，PD98059可以拮抗HBx誘導(dǎo)的Bortezomib耐藥，且兩者聯(lián)合應(yīng)用在HBV-HCC中具有協(xié)同效應(yīng)。Bortezomib作為第一個臨床應(yīng)用的蛋白酶體抑制劑，PD98059作為一種MEK抑制劑，與其他已批準上市或正處于臨床試驗中具有MAPK通路抑制效果的藥物(如索拉非尼等)聯(lián)用，在HBV-HCC中也可能發(fā)揮協(xié)同作用[51]。

2.5 HBx與代謝 近年來，有關(guān)代謝重組機制的研究為解釋HBV-HCC的發(fā)生發(fā)展提供了新的視角。既往研究提示HBx可影響肝細胞脂質(zhì)代謝。Kim等[52]首次報道了HBx過表達可通過激活固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1和過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)的轉(zhuǎn)錄水平，進而導(dǎo)致肝細胞脂肪變性。Na等[53]進一步揭示了HBx聯(lián)合肝X受體促進肝細胞脂肪變性從而導(dǎo)致HBV-HCC發(fā)生的分子機制。最近研究[54]顯示，HBx通過抑制miRNA-384使得促癌因子多效生長因子的表達上調(diào)，后者通過增加固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c和脂肪酸合酶的合成引起肝脂質(zhì)代謝異常，進而促進肝癌發(fā)生。HBx還可通過激活P2X-Akt途徑導(dǎo)致肝異常脂質(zhì)代謝異常，而降脂藥阿伐他汀可抑制這一現(xiàn)象，并抑制肝癌細胞的增殖和侵襲能力[55]。在糖代謝方面，HBx可通過激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2,上調(diào)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的表達水平，改變肝的正常糖代謝過程[56]。最新研究[57]發(fā)現(xiàn)，HBx通過BNIP3L介導(dǎo)的線粒體自噬，重組糖酵解代謝過程，導(dǎo)致肝癌細胞干性增加。 除此之外，HBx還可通過lncRNA H19/miRNA-675/PPARα軸重組肝細胞損傷及能量代謝過程[58]。 總的來說，HBx通過代謝信號通路的調(diào)節(jié)對肝細胞代謝過程進行重組，為HBV復(fù)制提供所需要的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核苷酸和能量，進而促進了HBV相關(guān)的癌變進程。

3 免疫失衡與HBV-HCC

肝臟，實際上可被視為一個“一線免疫器官”，含有大量先天性和適應(yīng)性免疫細胞，包括巨噬細胞、自然殺傷細胞、自然殺傷性T淋巴細胞、樹突狀細胞、T淋巴細胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細胞等，它們可檢測、捕獲和清除病原體、招募白細胞、呈遞抗原并啟動免疫應(yīng)答反應(yīng)，在宿主防御、維持免疫穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用[59]。免疫激活和免疫耐受之間的平衡至關(guān)重要，在人類慢性HBV感染過程中，肝損傷并不是由病毒直接引起的，而是由試圖清除病毒的免疫反應(yīng)所致，肝臟免疫狀態(tài)從免疫耐受逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖呒せ?、失活、再激活，最終發(fā)生免疫衰竭，這可能是導(dǎo)致肝癌發(fā)生的免疫致病因素[60]。

數(shù)據(jù)顯示，90%的HCC發(fā)生與肝損傷及炎癥有關(guān)，因此HBV-HCC被普遍認為是炎癥相關(guān)腫瘤，這種炎癥實際上是由肝臟中長期存在的HBV持續(xù)招募免疫細胞而建立起來的慢性低水平炎癥狀態(tài)。HBV感染使得單核細胞及原髓細胞在肝組織中浸潤活化，產(chǎn)生IL-6、TNFα、IL-1β、IL-18等促炎因子[61-66]，并通過NF-κB、STAT3、Wnt/β-catenin等多個信號通路，影響ROS的產(chǎn)生，干擾正常的免疫調(diào)節(jié)機制，介導(dǎo)免疫逃逸形成[67-70]；同時還產(chǎn)生抗炎反應(yīng)(TGFβ、IL-10等)以抑制過度的炎癥損傷，干擾正常的損傷修復(fù)過程，最終導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化及HCC的發(fā)生[71]。

4 HBV DNA整合與HBV-HCC

HBV DNA整合入宿主基因組被認為是導(dǎo)致HBV-HCC發(fā)生發(fā)展的重要因素，然而其具體機制尚未完全明了[72]。一項針對1115個HBV整合位點的研究[73]發(fā)現(xiàn)，HBV容易整合在外顯子、內(nèi)含子、啟動子以及基因密集區(qū)域，進一步的功能注釋分析顯示，與鄰近非腫瘤組織相比，HCC腫瘤組織中的整合靶向宿主基因在與細胞死亡負調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、發(fā)育分化及腫瘤相關(guān)通路相關(guān)的功能方面顯著富集。Zhao等[74]采集426例HCC患者的腫瘤組織及癌旁組織，借助高通量病毒整合檢測和RNA測序分析識別出4225個HBV整合事件，發(fā)現(xiàn)HBV容易整合到罕見的脆弱位點和功能基因組區(qū)域，HBV在腫瘤組織和癌旁組織的優(yōu)先整合位點不一樣，HBV插入位點在腫瘤端粒附近顯著富集，具有男性及肝硬化依賴模式，最終驅(qū)動致癌轉(zhuǎn)化。而新近一則研究[75]發(fā)現(xiàn)，70%HBsAg陰性的HCC患者存在隱匿性HBV感染，其中69%患者的HBV DNA與肝細胞DNA融合，而這些患者中90%沒有肝硬化，此外，HBV DNA整合主要發(fā)生在肝癌相關(guān)基因附近，如端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因、賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2B基因和細胞周期蛋白A2基因，提示HBV基因整合可能是導(dǎo)致血清學(xué)陰性且無肝硬化背景的患者發(fā)生肝癌的重要機制，因此對于HBV感染消退、HBsAg缺失的患者，臨床上建議仍應(yīng)檢測其肝組織中的HBV DNA，以確定是否存在發(fā)生HCC的風(fēng)險。

5 結(jié)論

HBV-HCC的發(fā)生發(fā)展是一個多分子參與、多信號通路交織作用和多步驟的過程，涉及HBV蛋白HBx、免疫失衡以及病毒DNA整合入宿主基因組等機制，其中，重點闡述了HBx在HBV-HCC發(fā)生發(fā)展中的各種惡性生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成和凋亡以及相關(guān)分子機制等。未來方向應(yīng)進一步深化探索HBV-HCC發(fā)生發(fā)展的具體分子事件及作用機制，為發(fā)現(xiàn)新型治療靶點提供新的思路及堅實的理論依據(jù)。