利用全外顯子組測(cè)序技術(shù)對(duì)高度近視家系進(jìn)行致病基因的克隆研究

鄧妮妮

（防城港愛爾眼科醫(yī)院有限公司，廣西 防城港 538001）

近些年來，研究證實(shí)[1]，父母近視發(fā)生與子代近視發(fā)生率呈現(xiàn)正相關(guān)。隨著近些年來全外顯子測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，高度近視發(fā)病率高于人口總數(shù)的1%。因此，定位與克隆中國人群高度近視致病基因，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行功能學(xué)研究，對(duì)預(yù)防及改善近視人群健康水平、生活質(zhì)量具有重大科學(xué)價(jià)值及社會(huì)意義[2]。為此，文章就應(yīng)用全外顯子組測(cè)序技術(shù)測(cè)定高度近視家族致病基因克隆研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2017年1月—2018年12月期間采集了5個(gè)高度近視家系成員進(jìn)行病史采集、視力檢查、屈光度、眼軸長、角膜曲率、眼底照相、OCT、色覺檢查及繪制家系圖并收集外周血提取DNA。本次研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；所有檢查及采樣均告知被檢查對(duì)象，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 選取家系成員進(jìn)行外顯子組測(cè)序：選擇兩個(gè)遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)的患者和與其中一個(gè)患者親屬關(guān)系最近的一個(gè)正常人作為對(duì)照進(jìn)行外顯子組測(cè)序。

1.2.2 全基因外顯子組測(cè)序結(jié)果分析：選取HighSeq2000高通量雙末端進(jìn)行測(cè)序，對(duì)所獲取圖像文件，選取Illumina basecalling Software 1.7進(jìn)行堿基讀取，并獲取長為76bp雙末端序列。①據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)：比對(duì)軟件為bwa，對(duì)高質(zhì)量原始序列，對(duì)比到參考基因組上，包括hg19，NCBI b37，通過SNP標(biāo)注等分析，選取外顯子并捕獲相關(guān)樣本基本信息，能獲取捕獲數(shù)據(jù)，判斷是否符合要求。②SNP檢測(cè)和注釋：bwa軟件序列下所獲取結(jié)果，選取GATK工具重新對(duì)序列質(zhì)量評(píng)估，并過濾匹配值基因組相同起始位置，重復(fù)拷貝后，選取samtools開展SNP檢測(cè)。對(duì)SNP進(jìn)行檢測(cè)，此時(shí)選取質(zhì)量≥30Phred-like質(zhì)量、測(cè)序深度≥8的SNP后，并進(jìn)行注釋及功能預(yù)測(cè)。③插入/缺失檢測(cè)和注釋：選取GATK工具，對(duì)外顯子區(qū)插入與缺失檢測(cè)，產(chǎn)生indels 的*.bed文件，對(duì)后續(xù)Indels注釋。④標(biāo)注好結(jié)果與dbSNPR 129、Hapmap8等數(shù)據(jù)庫過濾，去除數(shù)據(jù)庫內(nèi)報(bào)道過的SNP，得到所有未報(bào)道過的NS/SS/Indel結(jié)果。⑤未報(bào)道NS/SS/Indel數(shù)據(jù)獲??；⑥家系內(nèi)患者共有未報(bào)道 NS/SS/Indel結(jié)果生物信息學(xué)分析和突變后的功能預(yù)測(cè)[PolyPhen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/)]，找到最有可能的候選致病基因。

1.2.3 致病基因在其他高度近視家系和散發(fā)患者中的突變篩查：設(shè)計(jì)引物，通過Sanger測(cè)序，在其他高度近視家系及散發(fā)病例中對(duì)上一步驟獲得的共分離突變的基因進(jìn)行突變篩查。

1.2.4 致病基因細(xì)胞模型的構(gòu)建和基因功能的初步探索：構(gòu)建相應(yīng)致病基因野生型蛋白和突變蛋白的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Hela或其他合適細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)野生型和突變型蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定細(xì)胞系中，觀察突變蛋白的亞細(xì)胞定位，了解其合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和成熟的過程是否對(duì)其行使正常生理功能有影響，突變蛋白的降解過程是否有異常。

2 結(jié) 果

5個(gè)高度近視家系成員中，家系1表現(xiàn)為無虹膜、后部脈絡(luò)膜缺失及黃斑發(fā)育不良。家系2眼底視網(wǎng)膜豹紋狀改變伴有斜視及眼球震顫。家系3、家系4、家系5視網(wǎng)膜豹紋狀改變、視盤顳側(cè)可見近視弧形斑，視網(wǎng)膜未見明顯色素沉著，黃斑中心凹反光可見，最佳矯正視力可達(dá)0.4～1.0。所有家系成員未出現(xiàn)全身系統(tǒng)性疾病。5個(gè)高度近視家系中選取了遺傳模式典型、家系成員多且表型特征明顯的1個(gè)家系進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序，成功鑒定了NYX基因的一個(gè)新突變位點(diǎn)與該高度近視家系的疾病表型共分離。

3 討 論

高通量測(cè)序應(yīng)用能發(fā)現(xiàn)可能與高度近視相關(guān)基因，涉及到神經(jīng)傳遞、視黃酸代謝及胞外基質(zhì)重建等基因，如GJD2、 RASGRF1、GRIA4等基因[3]。新一代測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，使外顯子組測(cè)序和靶向外顯子捕獲測(cè)序得到了快速發(fā)展，為尋找高度近視致病基因及其突變位點(diǎn)提供了契機(jī)。

廣西是多民族聚居的自治區(qū)，特殊的地理環(huán)境又使各民族長期隔離，這便形成了廣西少數(shù)民族遺傳結(jié)構(gòu)的多樣性和民族背景的單一性。2016年我們率先在廣西開展高度近視疾病樣本資源庫建設(shè)，期望能夠有效推動(dòng)對(duì)高度近視發(fā)病機(jī)制的研究。通過收集5個(gè)高度近視家系及60多個(gè)高度近視散發(fā)病人，登記了詳細(xì)的臨床資料和提取了高質(zhì)量的DNA樣本；從這5個(gè)高度近視家系中選取了遺傳模式典型、家系成員多且表型特征明顯的1個(gè)家系進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序，成功鑒定了NYX基因的一個(gè)新突變位點(diǎn)與該高度近視家系的疾病表型共分離。并且已將研究結(jié)果反饋給患者，并為患者家庭的下一代優(yōu)生優(yōu)育提供咨詢和指導(dǎo)[4]。隨著疾病資源庫標(biāo)準(zhǔn)化及流程規(guī)范化建設(shè)，對(duì)高度近視家系研究不斷深入，后續(xù)可能克隆新的遺傳性高度近視致病基因，為揭示遺傳性高度近視病因及致病機(jī)理、臨床基因診斷提供充分依據(jù)。

綜上所述，全外顯子組測(cè)序技術(shù)對(duì)高度近視家系進(jìn)行致病基因的克隆，為進(jìn)一步揭示遺傳性高度近視的病因和致病機(jī)理以及臨床基因診斷提供更充分的證據(jù)。