母體胚胎亮氨酸拉鏈激酶與婦科惡性腫瘤的相關(guān)研究

張釵紅，全昱沖，關(guān)德鳳，楊永秀

隨著腫瘤驅(qū)動基因[1-2]和癌癥生物學的深入研究，多組學整合工具[1-2]和智能數(shù)字系統(tǒng)[3]等精準醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，靶向藥物臨床試驗[4]和耐受研究[5]的廣泛開展，腫瘤研究已進入驅(qū)動基因精準診斷和靶向干預新時代。人類母體胚胎亮氨酸拉鏈激酶(maternal embryonic leucine zipper kinase， MELK)是蔗糖非發(fā)酵-1/磷酸腺苷依賴蛋白激酶相關(guān)激酶家族成員之一，是鼠人類絲/蘇氨酸蛋白激酶38(murine serine-threonine protein kinase 38， MPK38)和非洲爪蟾蛋白激酶Eg3的直系同源物。MELK作為一種重要的腫瘤驅(qū)動基因，以激酶依賴的方式參與調(diào)控細胞周期[6]、增殖[7]、分化[7]、有絲分裂[8-9]、凋亡[6]、細胞骨架[10]、細胞內(nèi)信號傳導[11]、癌細胞干性[12]、DNA損傷修復[13]和翻譯后修飾[6]等多種生物過程，在婦科主要惡性腫瘤的形成和進展中發(fā)揮重要作用。本文就MELK的結(jié)構(gòu)、功能、作用機制及其與婦科主要惡性腫瘤的關(guān)系進行綜述如下。

1 MELK概述

1.1MELK發(fā)現(xiàn)、定位和結(jié)構(gòu) 1997年Heyer等[11]使用差異顯示技術(shù)鑒定小鼠胚胎植入前階段優(yōu)先轉(zhuǎn)錄基因時發(fā)現(xiàn)一種新的母本轉(zhuǎn)錄基因——MELK。檢索NCBI基因數(shù)據(jù)庫，人類MELK定位于染色體9p13.2。

MELK的結(jié)構(gòu)：Ser/Thr激酶催化域包括N端半段結(jié)構(gòu)(非經(jīng)典泛素化結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點)[14]、C端半段結(jié)構(gòu)(與底物結(jié)合有關(guān)，參與激酶活化和活性調(diào)節(jié))[14]、鉸鏈區(qū)[15]和三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合位點[14-15]。非經(jīng)典泛素化結(jié)構(gòu)域包括調(diào)節(jié)激酶活性和維持激酶域的正確構(gòu)象[14]。C端調(diào)節(jié)區(qū)域包括TP二肽富集區(qū)(含多個磷酸化位點)和激酶相關(guān)區(qū)域1[14-16]。

1.2MELK激活和作用機制 未磷酸化MELK的C端半段結(jié)構(gòu)T-環(huán)中存在分子內(nèi)二硫鍵，不吸收外源底物，還原劑等可破壞二硫鍵，實現(xiàn)Thr167的自身磷酸化活化MELK[14,16]。MELK活性的影響因素：MELK自身磷酸化、外源底物磷酸化、還原或氧化狀態(tài)、分子內(nèi)二硫鍵及鈣離子劑量等[14]。MELK激活后可通過直接結(jié)合和底物磷酸化與蛋白質(zhì)靶標發(fā)生相互作用調(diào)控線粒體、凋亡、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)[17]、絲氨酸-蘇氨酸激酶受體相關(guān)蛋白(STRAP)/轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)[18]、JNK-cJUN、雌激素受體[19]、FAK/Paxillin[10]等信號通路發(fā)揮生物學功能[14]。Gong等[18]在結(jié)直腸癌組織中發(fā)現(xiàn)，MELK可特異性結(jié)合STRAP,具有較強的致癌潛力。Liu等[7]在髓母細胞瘤中發(fā)現(xiàn)，MELK結(jié)合并誘導Zeste基因增強子同源物2(EZH2)磷酸化調(diào)節(jié)癌干樣細胞增殖。

2 MELK與腫瘤

2.1MELK與腫瘤促進 MELK作為一種重要的腫瘤驅(qū)動基因，參與維持腫瘤起始細胞的生長，促進腫瘤發(fā)生[20]，在神經(jīng)母細胞瘤[21]、橋腦膠質(zhì)瘤[22]、腎上腺皮質(zhì)癌[23]、乳腺癌[19]、胃癌[10]和結(jié)直腸癌[18]等大多數(shù)癌癥中均呈顯著高表達，MELK高表達與更強的瘤體形成能力顯著相關(guān)[12]。MELK為腫瘤細胞提供生長優(yōu)勢[24],促進其生物學進展，促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，MELK高表達與腫瘤分期[18,21,25]、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[18]、治療后復發(fā)[26]及患者預后不良[7,21,25]顯著相關(guān)。

2.1.1MELK促進腫瘤細胞增殖：MELK主要通過調(diào)控腫瘤細胞周期和凋亡促進增殖。Wang等[17]在人視網(wǎng)膜細胞瘤中發(fā)現(xiàn)，MELK聯(lián)合FoxM1的過表達可顯著降低經(jīng)科羅索酸處理后顯著上調(diào)的Y-79細胞的G2/M期細胞數(shù)量和凋亡細胞百分比，有效逆轉(zhuǎn)細胞周期阻滯和細胞凋亡，促進增殖。Li等[19]在三陰性乳腺癌(TNBC)細胞中通過沉默MELK導致G2停滯，Cyclin B和Cyclin D1表達顯著下調(diào)，抑制增殖。

2.1.2MELK促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移：MELK促進腫瘤細胞侵襲、遷移、腹膜轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。MELK敲低可抑制FAK和Paxillin的磷酸化,顯著減少遷移和侵襲的胃癌細胞數(shù)量[10]。MELK過表達可顯著增加胃癌移植瘤裸鼠腹膜內(nèi)結(jié)節(jié)數(shù)量，促進腹膜擴散和轉(zhuǎn)移[10]。Gong等[18]在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)，MELK高表達組較低表達組更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

2.2MELK與腫瘤治療

2.2.1MELK抑制劑：MELK抑制劑可靶向干預高度增殖的腫瘤細胞及其來源的腫瘤干細胞用于腫瘤治療[24]。高通量篩選：Chung等[20]使用IMAP法篩選AMRI化合物庫發(fā)現(xiàn)最有效的MELK抑制劑OTSSP 167，可有效抑制MELK活性及其底物類腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白(DBNL)和蛋白酶體亞基α1的磷酸化，降低癌細胞的侵襲性和干性[20]。Ren等[12]在頭頸部鱗癌(HNSCC)中發(fā)現(xiàn)，OTSSP 167可下調(diào)HNSCC細胞的SOX2表達靶向癌癥干細胞，影響癌細胞干性和致瘤性?；诮Y(jié)構(gòu)的虛擬篩選：Zhou等[27]從Vitas-M化學數(shù)據(jù)庫中篩選出對MELK抑制作用最強的化合物16可有效阻止FAK磷酸化，抑制SGC7901細胞遷移和侵襲。脫靶/交叉篩選：Edupuganti等[28]從已知激酶抑制劑文庫中篩選出最有效的MELK抑制藥物Nintedanib，在其5位上添加甲酯提高對MELK效能和選擇性，形成一種最有效的針對MELK催化域的吲哚酮抑制劑——IN17[29]，可抑制HCC70細胞Mcl-1的表達，優(yōu)先抑制MELK高表達TNBC細胞增殖。中醫(yī)中藥：血根堿在結(jié)腸癌HCT116細胞中下調(diào)和解離STRAP和MELK，激活Bax誘導凋亡，抑制增殖[18]。

2.2.2MELK與腫瘤治療耐受：MELK在mRNA和蛋白質(zhì)水平的高表達與腫瘤細胞的抗輻射性和化學耐藥性顯著相關(guān)[10,26]。MELK的抑制可削弱腫瘤生長，提高放射治療和化學治療敏感性。在神經(jīng)母細胞瘤中，OTSSP 167抑制MELK及其靶基因EZH2的表達，抑制放射治療和化學治療誘導的折疊復制叉的形成，提高細胞對喜樹堿或放射線的敏感性[21]。在乳腺癌中，MELK敲低或OTSSP 167顯著延遲放射治療后dsDNA斷裂的修復，增強放射敏感性[26]。在胃癌中，MELK敲低誘導氟尿嘧啶處理后的NCI-N87細胞凋亡，增加氟尿嘧啶敏感性[10]。

3 MELK在婦科腫瘤中研究進展

3.1MELK與宮頸癌 MELK促進宮頸癌發(fā)生和進展，經(jīng)免疫組織化學(IHC)測定顯示，從正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)到宮頸癌，MELK的表達率逐漸升高[13]。經(jīng)實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測發(fā)現(xiàn)，宮頸癌或?qū)m頸癌和CINⅢ組織中的MELK mRNA表達顯著高于正常組織[13，24，30]。經(jīng)qPCR和蛋白質(zhì)印跡(WB)檢測表明，宮頸癌SiHa、HeLa、C33A和CasKi細胞系中的MELK mRNA和蛋白表達水平均被上調(diào)[13]。

MELK促進宮頸癌增殖生長和早期轉(zhuǎn)移。通過細胞計數(shù)試劑盒(CCK)-8和集落形成實驗發(fā)現(xiàn)，MELK敲低抑制C33A和CasKi細胞增殖及C33A和HeLa細胞集落形成能力[13]。通過WB檢測顯示，MELK敲低顯著上調(diào)C33A細胞P53和Caspase-3表達，誘導凋亡[13]。通過IHC測定表明，MELK的高表達與宮頸癌的早期轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，有淋巴或血管轉(zhuǎn)移的Ⅱa期宮頸癌患者MELK的高表達率顯著高于無轉(zhuǎn)移者[13]。

MELK通過分子靶向干預、免疫療法和聯(lián)合療法參與宮頸癌治療，目前正處于臨床前研究和Ⅰ期臨床試驗階段[13，31-32]。分子靶向干預：OTSSP 167可抑制宮頸癌細胞增殖生長，加劇DNA損傷，誘發(fā)凋亡。經(jīng)OTSSP 167處理后，通過集落形成試驗發(fā)現(xiàn)C33A和HeLa細胞集落形成和致癌性生長能力降低，通過CCK-8和WB檢測發(fā)現(xiàn)C33A、SiHa和HeLa細胞的增殖抑制率，C33A細胞中DNA破壞點標記蛋白γ-H2AX和裂解Caspase-3的表達隨著OTSSP 167濃度的升高而升高[13]。癌癥免疫肽疫苗療法[31]：鉑類耐藥的人類白細胞抗原(HLA-A)單倍型2402的宮頸癌患者接種含MELK、FOXM1、HJURP、VEGFR-1、VEGFR-2的5肽疫苗的Ⅰ期劑量遞增試驗發(fā)現(xiàn)，患者進行疫苗接種是安全的，該疫苗可與MHC-1結(jié)合，在78%和89%的患者中觀察到強烈的抗MELK和FOXM1的特異性細胞毒性CD8+ T淋巴細胞反應。MELK和FOXM1是高度免疫原性抗原，是宮頸癌患者免疫治療的有希望的靶標。聯(lián)合療法：Budczies等[32]在宮頸癌組織癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)集中檢測到涉及程序性死亡受體-配體1(PD-L1)的9p染色體上的復發(fā)拷貝數(shù)增加和MELK mRNA表達顯著上調(diào)，并與免疫過程顯著相關(guān)，故有必要進一步研究MELK免疫療法聯(lián)合PD-L1阻斷劑治療宮頸癌的效果。

MELK可能通過調(diào)節(jié)化學治療藥物敏感性參與宮頸癌治療耐受過程。MELK敲低可通過同源重組途徑加劇C33A細胞DNA損傷，誘導凋亡，提高順鉑敏感性。經(jīng)MELK敲低聯(lián)合順鉑1 μg/ml處理C33A細胞后，與單獨使用順鉑相比，γ-H2AX和Caspase-3表達顯著上調(diào)，DNA損傷同源重組修復蛋白Mre11和Rad 50的表達顯著下調(diào)[13]。

MELK主要影響宮頸癌患者治療后的疾病狀態(tài)和生存時間。根據(jù)RECISTv1.1標準監(jiān)測患者接種包含MELK的5肽疫苗后的臨床反應發(fā)現(xiàn)，66.7%患者在3.0～10.3個月達到了疾病穩(wěn)定狀態(tài)，89.0%患者的中位無進展生存期為3.3個月[31]。

3.2MELK與卵巢癌 MELK促進卵巢癌發(fā)生和進展，GEO數(shù)據(jù)庫9個數(shù)據(jù)集分析顯示，MELK表達從漿液性良性腫瘤、交界性腫瘤到卵巢癌逐漸上調(diào)，漿液性良性腫瘤中MELK表達顯著高于正常組織[33]。TCGA數(shù)據(jù)集分析顯示，MELK表達隨著卵巢癌組織學分級的升高和病理分化程度的降低而上調(diào)[33]。qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，卵巢腫瘤組織中MELK mRNA表達顯著高于正常樣品[24]。WB檢測發(fā)現(xiàn)，MELK表達在上皮性卵巢癌SKOV3、OVCAR8、IGROV1、OVCAR4細胞系中最高，在正常卵巢細胞中幾乎檢測不到[33]。

MELK促進卵巢癌細胞致癌性生長和增殖。MELK敲低抑制卵巢癌OVCAR8細胞系集落形成和致癌性生長，誘導細胞凋亡，抑制增殖。經(jīng)集落形成實驗表明，MELK敲低抑制軟瓊脂中的OVCAR8細胞系集落形成和致癌性生長。經(jīng)WB檢測顯示，在MELK敲低的OVCAR8細胞中存在明顯的多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶 (PARP)-1裂解，誘導凋亡，抑制增殖[33]。

MELK通過小分子抑制劑靶向干預和聯(lián)合治療參與卵巢癌治療。小分子抑制劑：①OTSSP 167：OTSSP 167誘導G2/M期停滯抑制卵巢癌細胞增殖、集落形成和錨定依賴性和非依賴性生長，誘導細胞凋亡。通過流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，OTSSP 167處理后BG1和OVCAR8細胞的細胞核更大，可誘導明顯的G2/M過渡期轉(zhuǎn)換停滯，抑制增殖。通過3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)分析顯示，OTSSP 167抑制卵巢癌細胞增殖的效率是正常細胞的3倍。集落形成實驗表明，OTSSP 167抑制軟瓊脂上SKOV3、OVCAR8、OVCAR5細胞的錨定非依賴性生長和SKOV3、OVCAR8、OVCAR5、OVCAR4細胞的錨定依賴性生長。WB檢測顯示，經(jīng)OTSSP 167處理的卵巢癌細胞系存在明顯的PARP-1裂解，誘導凋亡[33]。②Nintedanib：Edupuganti等[28]進行脫靶/交叉篩選出最有效的MELK抑制藥物Nintedanib。Nintedanib在卵巢癌中的應用目前正處于臨床試驗階段，且多聯(lián)合其他療法使用[34-35]。Nintedanib在卵巢癌早期臨床試驗中具有較好的活性和安全性，在術(shù)后進展風險低的卵巢癌患者中的療效顯著，無進展生存期延長了7個月[35]。聯(lián)合治療：①OTSSP 167聯(lián)合化學治療藥物：MTT分析表明，在OVCAR8細胞中，OTSSP 167聯(lián)合卡鉑比單用卡鉑具有更高的療效和細胞毒性[33]。②免疫療法聯(lián)合PD-L1阻斷劑：在卵巢癌組織TCGA數(shù)據(jù)集[32]中檢測到涉及PD-L1的9p染色體上的復發(fā)拷貝數(shù)增加和MELK mRNA表達的顯著上調(diào)，并與免疫系統(tǒng)的熱微環(huán)境吸引效應細胞顯著相關(guān)，一旦PD-L1檢查點封鎖到位，該效應細胞就可以消除腫瘤細胞，故有必要進一步研究MELK免疫療法聯(lián)合PD-L1阻斷劑在卵巢癌中的療效。MELK抑制劑OTSSP 167可增強化學治療敏感性逆轉(zhuǎn)卵巢癌化學治療耐藥。OTSSP 167增強OVCAR 8細胞對卡鉑的敏感性，MTT分析表明，OTSSP 167聯(lián)合卡鉑比單用卡鉑更有效[33]。OTSSP 167在耐順鉑和紫杉醇的卵巢癌細胞中保留了其細胞毒性和有效性，MTT分析表明，耐順鉑的TYK-nu(R)細胞和耐紫杉醇的IGROV1-PXL細胞對OTSSP 167的敏感性顯著高于其親代細胞。OTSSP 167在抗藥性卵巢癌細胞系中仍然有效且不產(chǎn)生卡鉑、紫杉醇或阿霉素的交叉耐藥，是抗藥性卵巢癌治療的重要制劑[33]。

MELK主要影響卵巢癌患者治療后的生存時間。TCGA數(shù)據(jù)庫卵巢癌患者生存分析表明，上皮性卵巢癌中MELK高表達與較短的無進展生存期顯著相關(guān)，提示預后不良[33]。

綜上所述，MELK可直接結(jié)合和底物磷酸化靶蛋白參與調(diào)控多種生物過程，促進婦科惡性腫瘤的形成和進展，參與其綜合治療、治療后耐受和預后評估等過程，是一種重要的癌癥驅(qū)動基因，有望成為宮頸癌和卵巢癌分子治療的靶標和預后監(jiān)測的標志物。然而，MELK的功能及其在婦科惡性腫瘤中的分子機制仍未完全闡明，MELK靶標抑制劑目前正處于臨床前和臨床試驗階段，仍未得到美國食品藥品監(jiān)督管理局批準應用，且存在脫靶、特異性爭議[9]和缺乏大樣本臨床數(shù)據(jù)支持等問題。因此，應進一步深化MELK及其抑制劑在婦科惡性腫瘤中的功能、作用機制和調(diào)控途徑的認識，進一步優(yōu)化升級和合理使用現(xiàn)有精準醫(yī)療技術(shù)工具，進一步探討如何構(gòu)建和使用最有效的特異性最高的MELK靶向制劑，從而為婦科惡性腫瘤的臨床監(jiān)測、精準診治和預后判定提供重要思路。