磁性三維還原石墨烯的制備及其在電化學(xué)免疫檢測牛乳中結(jié)核桿菌H37Ra的應(yīng)用

劉希雅，田春妹，鄭鷺飛，鐘平勝，張馨方，任佳麗,

（1.林產(chǎn)可食資源安全與加工利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081）

結(jié)核病是一種人畜共患病，其病原菌主要為人型結(jié)核桿菌和牛結(jié)核桿菌，可通過污染乳及乳制品感染人類[1]，成為繼艾滋病后嚴(yán)重威脅人類健康的最大殺手，在世界范圍內(nèi)有爆發(fā)之勢[2-4]。世界動物衛(wèi)生組織將其列為B類動物傳染病，我國將其列為二類動物傳染病。2018年世界衛(wèi)生組織在《全球結(jié)核病報(bào)告》中指出，全球結(jié)核病新增病例達(dá)1 000萬，其中死亡人數(shù)約157萬，中國成為世界排名第2的高發(fā)病率國家[5]。世界各國每年均花費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力去防制此病的發(fā)生。在原料乳收購現(xiàn)場進(jìn)行檢測可從源頭阻斷結(jié)核桿菌的傳播[6]。

目前常用的結(jié)核桿菌檢測技術(shù)主要包括細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等[7-9]。世界動物衛(wèi)生組織指定的檢測方法為結(jié)核菌素測試法，此法受生物、化學(xué)以及物理等因素的影響，導(dǎo)致結(jié)果敏感性和特異性均較低，細(xì)菌學(xué)方法是目前使用的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法，由于結(jié)核桿菌增代時(shí)間長，生長緩慢，需要2～6 周才能長出顆粒狀或絮狀的菌落[10]，極大延長了檢測時(shí)間（一般需要4～8 周），等結(jié)果出來，疫情已經(jīng)發(fā)生。對于原料收購環(huán)節(jié)和出入境檢驗(yàn)檢疫，乳及其制品中結(jié)核桿菌的現(xiàn)場快速檢測方法顯得尤為重要。因此，研制準(zhǔn)確、靈敏、快速而且價(jià)格便宜的便攜式方法迫在眉睫[11-13]。

電化學(xué)傳感器具有靈敏度高、檢測速度快、檢測成本低且檢測裝置可微縮化等優(yōu)點(diǎn)，為研制便攜式現(xiàn)場檢測設(shè)備奠定了基礎(chǔ)[14-15]。電化學(xué)電極在微縮化的同時(shí)降低了檢測能耗，但也降低了電子傳輸速率。石墨烯作為一種新興材料，憑借其超高的比表面積、良好的機(jī)械性能和電化學(xué)性質(zhì)[16-17]，在化學(xué)修飾電極方面得到了廣泛的應(yīng)用[18-21]。而三維結(jié)構(gòu)石墨烯材料不僅可降低電極阻抗，同時(shí)還彌補(bǔ)了電極微縮引起的比表面積下降的缺點(diǎn)，提高電子傳輸效率[22-24]。本研究制備了磁性三維還原石墨烯復(fù)合材料，對不同修飾材料進(jìn)行了表征和電化學(xué)性能探究，并在此基礎(chǔ)上建立了一種快速、靈敏、特異的乳品中結(jié)核桿菌H37Ra的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

結(jié)核桿菌（Mycobacterium tuberculosisH37Ra）、大腸埃希氏菌（Escherichia coliATCC 25922）、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidisATCC 14028）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 25923） 湖南省胸科醫(yī)院；石墨烯（graphene，G） 成都有機(jī)化學(xué)有限公司；牛血清蛋白 北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；結(jié)核桿菌多克隆抗體 上海滬崢生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI920D電化學(xué)工作站、玻碳電極、甘汞電極、鉑絲電極 上海辰華儀器有限公司；Sigma HD掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 德國Zeiss公司；Finder One微區(qū)激光拉曼光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；DHP-500電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 結(jié)核桿菌H37Ra母液制備

在無菌條件下，用接種環(huán)挑取結(jié)核桿菌于裝有吐溫/生理鹽水緩沖液的痰瓶中，在渦旋振蕩儀上振蕩打散5 min，制成菌懸液。吸取1～2 mL菌懸液加入蘇通液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)1～2 周得到母液，母液通過麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)節(jié)至1×108CFU/mL。

1.3.2 磁性復(fù)合材料的制備

采用Hummers法制備氧化石墨烯（graphene oxide，GO）。稱取3.2 g FeCl3·6H2O加入到40 mL去離子水中，再稱取5.9 g C6H5Na3O7·2H2O加入到60 mL去離子水中。將配好的溶液在磁力攪拌下緩慢加入到已經(jīng)超聲分散2 h的氧化石墨烯中。然后，將6.0 mL的80%偏二甲肼溶液滴加到該溶液中，繼續(xù)攪拌30 min。將混合物分裝轉(zhuǎn)移至50 mL內(nèi)壁涂了聚四氯乙烯的高壓反應(yīng)釜中，在180 ℃高溫恒溫箱中反應(yīng)12 h，待冷卻后，冷凍干燥24 h，即可獲得四氧化三鐵/三維還原氧化石墨烯（ferroferric oxide/three-dimensional reduced graphene oxide，F(xiàn)e3O4@3D-RGO）復(fù)合材料。將復(fù)合材料制備過程中的各種中間材料如G、GO和Fe3O4@3D-RGO復(fù)合材料進(jìn)行SEM、光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）以及拉曼光譜表征。

1.3.3 修飾電極的制備與檢測

將裸玻碳電極拋光，晾干備用。分別用25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液配制修飾液，考察其成膜穩(wěn)定性，最終確定75%為乙醇溶液最佳體積分?jǐn)?shù)。同時(shí)參照文獻(xiàn)[25-26]，采用0.1% Nafion溶液作為修飾玻碳電極的保護(hù)膜。用電子分析天平稱取0.005 g Fe3O4@3D-RGO，以75%乙醇溶液和0.1% Nafion溶液為分散相配制5 mg/mL的修飾液。分別取15、20、25、30、35、40、45 μL修飾液滴涂于電極表面，將電極置于45 ℃恒溫箱中干燥后，以修飾的玻碳電極為工作電極、飽和甘汞電極為參比電極以及鉑電極作為對電極構(gòu)成三電極體系，置于含有0.1 mmol/L鐵氰化鉀的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.4）中進(jìn)行交流阻抗（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）測試，選擇合適的修飾液體積進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有的測量均在開路狀態(tài)下進(jìn)行，測量頻率為0.1～100 kHz，外加振幅為5 mV的交流擾動電壓。

1.3.4 電化學(xué)免疫傳感器的制備與結(jié)核桿菌H37Ra的檢測

用移液槍吸取30 μL Fe3O4@3D-RGO修飾液滴涂于玻碳電極表面并在室溫下干燥，再滴涂10 μL 1 mg/mL的結(jié)核桿菌抗體，使其覆蓋于玻碳電極表面，于室溫下保存2 h。然后，將電極置于45 ℃恒溫箱中干燥后，在超純水中浸泡5 min，使沒有固定的抗體溶解到水中，用超純水沖洗電極，氮?dú)獯蹈桑缓笥?% BSA進(jìn)行封閉，用同樣方法清洗電極并干燥，修飾電極制備完成，保存于4 ℃冰箱中備用。檢測時(shí)，將三電極體系置于含有不同濃度結(jié)核桿菌H37Ra（通過PBS稀釋結(jié)核桿菌母液獲得）的0.1 mmol/L鐵氰化鉀的PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）中進(jìn)行EIS測試。

1.3.5 電化學(xué)免疫傳感器重復(fù)性、穩(wěn)定性及特異性評估

分別配制不同濃度（104、105、106CFU/mL）的結(jié)核桿菌，用Fe3O4@3D-RGO復(fù)合修飾材料制備的電化學(xué)免疫傳感器進(jìn)行阻抗測定，每個(gè)濃度平行測3 次，評估該免疫傳感器的重復(fù)性；將制備的修飾電極保存在4 ℃冰箱中，每天測定105CFU/mL結(jié)核桿菌菌液，通過10 次測定的阻抗值評估所制備傳感器的穩(wěn)定性；采用結(jié)核桿菌和一些食品中常見的致病菌（包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌），均制備成約103CFU/mL的菌液，記錄電化學(xué)免疫傳感器的阻抗變化，以評估該傳感器的特異性。

1.3.6 電化學(xué)免疫傳感器檢測人工污染牛乳中結(jié)核桿菌H37Ra

用麥?zhǔn)媳葷岱ㄅ渲撇煌瑵舛鹊慕Y(jié)核桿菌菌懸液各10 mL。取100 μL用傳統(tǒng)方法涂布培養(yǎng)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中2 周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，做3 次平行。另取5 mL菌懸液4 000 r/min離心40 min，將得到的菌體分散于5 mL牛乳中，用Fe3O4@3D-RGO復(fù)合材料制備的電化學(xué)免疫傳感器進(jìn)行測定。牛乳樣品在混勻器上充分混合后，4 000 r/min離心40 min，棄去上清液，加入5 mL生理鹽水重懸沉淀，使用定性濾紙過濾，濾液經(jīng)4 000 r/min離心40 min，再棄去上清液，加入5 mL含有0.1 mmol/L鐵氰化鉀的PBS重懸沉淀，混勻待測，每組樣品測3 次，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出結(jié)核桿菌濃度，與平板計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比，并用SPSS軟件配對樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同納米材料的結(jié)構(gòu)表征

圖1 G（A）、GO（B）、Fe3O4@3D-RGO（C）的SM圖Fig. 1 SEM images of graphene (A), GO (B), and Fe3O4@3D-RGO (C)

圖2 G（A）、GO（B）、Fe3O4@3D-RGO（C）的XPS圖Fig. 2 XPS profiles of graphene (A), GO (B), andFe3O4@3D-RGO (C)

圖3 G（A）、GO（B）、Fe3O4@3D-RGO（C）的拉曼光譜圖Fig. 3 Rammam spectra of graphene (A), GO (B), andFe3O4@3D-RGO (C)

圖1 ～3分別顯示了修飾材料在制備過程中的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、化學(xué)元素的含量變化以及石墨烯三維結(jié)構(gòu)的變化。由圖1和圖2可以看出，未經(jīng)修飾的石墨烯為平面單分子薄層結(jié)構(gòu)，含氧量約為14%；經(jīng)Hummer法制備的GO與石墨烯具有相似的層狀結(jié)構(gòu)，但更厚，這是由于氧化石墨烯表面嫁接了大量的活性基團(tuán)，如羧基（—COOH）、酯基（—COO－）、羰基（—C＝O）、環(huán)氧基[—CH(O)CH-]、羥基（—OH）等所造成的，其含氧量高達(dá)36%，約是石墨烯的3 倍，這也從另一方面證明了含氧官能團(tuán)的存在；用水熱一步還原法制備的Fe3O4@3D-RGO復(fù)合材料表面附著了許多直徑約50～300 nm的球狀顆粒，這是在制備過程中Fe3＋與Fe2＋一起附著到還原氧化石墨烯（RGO）表面所形成的Fe3O4納米顆粒，與氧化石墨烯相比，復(fù)合材料厚度減小，比表面積增大，使其能夠負(fù)載大量Fe3O4納米顆粒。由圖2C可知，RGO表面仍然存在部分—OH、—COOH等含氧基團(tuán)，使Fe3O4納米顆?？梢酝ㄟ^共價(jià)作用結(jié)合在RGO表面，同時(shí)，這種作用力也阻止了Fe3O4的團(tuán)聚，從而獲得了穩(wěn)定的Fe3O4@3D-RGO磁性復(fù)合材料。從不同修飾材料的拉曼圖譜（圖3）可以看出石墨烯在514 nm波長的激光激發(fā)下產(chǎn)生2 個(gè)強(qiáng)特征峰，從這2 個(gè)峰的位置及形狀可以大致推出石墨烯的層數(shù)，并依次可以推斷所制備的Fe3O4@3D-RGO復(fù)合材料具有三維結(jié)構(gòu)；氧化石墨烯具有較厚的堆積片層，這與石墨烯的氧化造成的結(jié)構(gòu)缺陷有關(guān)。

2.2 不同納米材料的電化學(xué)性能

測定裸玻碳電極（bare glassy carbon electrode，GCE）、氧化石墨烯修飾電極（GO/GCE）及復(fù)合材料修飾電極（Fe3O4@3D-RGO/GCE）在1 mmol/L鐵氰化鉀溶液中的交流阻抗譜。

圖4 不同修飾電極的電化學(xué)阻抗圖譜Fig. 4 Electrochemical impedance of different modified electrodes

一般情況下，修飾電極阻抗大小與阻抗圖譜半圓直徑呈正比。通過對比圖4中GCE、GO/GCE和Fe3O4@3DRGO/GCE的阻抗圖譜可知，GO/GCE的阻抗遠(yuǎn)大于GCE，而Fe3O4@3D-RGO/GCE的阻抗遠(yuǎn)小于GCE。這是因?yàn)镚O表面含有大量的含氧活性基團(tuán)，它們會阻礙電子傳遞，使阻抗增大。而對于Fe3O4@3D-RGO/GCE，含氧基團(tuán)不僅能夠增強(qiáng)復(fù)合材料的水溶性，減小信噪比，還可以與Fe3O4發(fā)生相互作用使修飾材料比表面積增大、導(dǎo)電性增強(qiáng)，阻抗減小。

2.3 修飾液體積對電化學(xué)阻抗的影響

為獲得Fe3O4@3D-RGO磁性復(fù)合材料的最優(yōu)阻抗特征，以不同體積的修飾液（質(zhì)量濃度5 mg/mL）對電極進(jìn)行修飾，用交流阻抗譜進(jìn)行表征，獲得Fe3O4@3D-RGO修飾電極的導(dǎo)電性能。

圖5 不同體積三維磁性復(fù)合材料修飾電極阻抗譜Fig. 5 Electrochemical impedance of different electrodes modified with different volumes of Fe3O4@3D-RGO

由圖5可知，電極經(jīng)Fe3O4@3D-RGO磁性復(fù)合材料修飾后，阻抗隨修飾液體積的增大顯著減小。但由于修飾液體積為30 μL時(shí)即可在玻碳電極表面達(dá)到飽和，繼續(xù)滴加會造成修飾液浪費(fèi)，若分2 次滴加，又會使電極表面修飾膜太厚，不利于后期繼續(xù)滴涂抗體制備免疫傳感器，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，使用修飾液均為30 μL。

2.4 Fe3O4@3D-RGO復(fù)合材料修飾電極電化學(xué)性能

對免疫傳感器制備過程中不同階段的狀態(tài)，即GCE、Fe3O4@3D-RGO/GCE、結(jié)核桿菌抗體修飾的Fe3O4@3D-RGO/GCE（Fe3O4@3D-RGO/Ab/GCE）以及用BSA封閉后的Fe3O4@3D-RGO/Ab/GCE（Fe3O4@3DRGO/Ab/BSA/GCE）以及結(jié)核桿菌吸附后的修飾電極（Fe3O4@3D-RGO/Ab/BSA/H37Ra/GCE）在鐵氰化鉀電解液中的電化學(xué)行為進(jìn)行交流阻抗譜測試，它們的電子傳遞阻抗分別為85.76、34.62、39.31、49.62、115.00 Ω（圖6）。結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4@3D-RGO復(fù)合材料的修飾增加了電極表面積并加速了電子轉(zhuǎn)移，使得Fe3O4@3DRGO/GCE的阻抗遠(yuǎn)小于GCE。當(dāng)修飾電極表面覆蓋有結(jié)核桿菌抗體時(shí)，修飾膜的表面又增加了一層抗體膜，抑制了電子的傳遞，交流阻抗增大。用BSA對電極表面的非特異性部位進(jìn)行封閉后，電極阻抗進(jìn)一步增大，上述現(xiàn)象說明生物活性物質(zhì)極大地阻礙了電子轉(zhuǎn)移效率。盡管如此，修飾后的電極阻抗仍然小于裸電極，結(jié)果證明Fe3O4@3D-RGO復(fù)合材料可提高電子的傳輸效率。結(jié)核桿菌吸附后，電化學(xué)阻抗明顯增大，說明所制備的電化學(xué)免疫傳感器可以用來監(jiān)測抗體與目標(biāo)菌抗原結(jié)合所引起的阻抗變化。

圖6 電化學(xué)免疫傳感器檢測結(jié)核桿菌37Ra原理Fig. 6 Principle of electrochemical immunosensor for the detection of M. tuberculosis H37Ra

2.5 Fe3O4@3D-RGO復(fù)合修飾材料制備的電化學(xué)免疫傳感器檢測結(jié)核桿菌H37Ra

圖7 為Fe3O4@3D-RGO復(fù)合修飾材料制備的電化學(xué)免疫傳感器檢測不同濃度結(jié)核桿菌H37Ra的交流阻抗圖，其半圓曲線的直徑表示溶液阻抗Z，而橫縱坐標(biāo)Z’和Z’分別為阻抗Z的實(shí)部和虛部。在H37Ra濃度為1×103～1×108CFU/mL的范圍內(nèi)，電極阻抗與目標(biāo)檢測物濃度的對數(shù)呈現(xiàn)較強(qiáng)的線性關(guān)系，回歸方程為y＝19.77lgN－49.14，相關(guān)系數(shù)為0.982。檢出限為1×102CFU/mL，由D＝3SD/k計(jì)算得到，其中SD是空白樣品與檢測阻抗信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（圖8）。

將Fe3O4@3D-RGO復(fù)合修飾材料制備的電化學(xué)免疫傳感器與其他相關(guān)方法[27-30]進(jìn)行比較，其結(jié)果如表1所示。本實(shí)驗(yàn)基于Fe3O4@3D-RGO復(fù)合材料的免疫電化學(xué)方法檢測結(jié)核桿菌H37Ra的線性范圍寬，檢出限略低，檢測時(shí)間更快速，且不需任何昂貴的儀器設(shè)備，操作簡單、無需樣品前增菌和預(yù)富集。制備的電化學(xué)免疫傳感器的優(yōu)良性能可歸因于多種因素：首先，F(xiàn)e3O4@3D-RGO磁性復(fù)合材料促進(jìn)了電極表面電子傳輸，提高了電化學(xué)性能。此外，水熱一步還原法制備的Fe3O4@3D-RGO磁性復(fù)合材料克服了石墨烯片層之間脫離溶劑后容易產(chǎn)生p-π堆疊而導(dǎo)致比表面積降低的缺陷，獲得更大的比表面積，使得所研制的電化學(xué)免疫傳感器具有較低的檢出限。

圖7 電化學(xué)免疫傳感器用于不同濃度結(jié)核桿菌37Ra的檢測Fig. 7 Detection of different concentrations of M. tuberculosis H37Ra using electrochemical immunosensor

圖8 修飾電極阻抗變化量與結(jié)核桿菌37Ra濃度對數(shù)關(guān)系圖Fig. 8 Relationship between impedance change and logarithmic concentration of M. tuberculosis H37Ra

表1 電化學(xué)免疫傳感器與其他方法比較Table 1 Comparison of the proposed electrochemical immunosensor with other methods

2.6 Fe3O4@3D-RGO復(fù)合修飾材料制備的電化學(xué)免疫傳感器重復(fù)性、穩(wěn)定性和特異性探究

傳感器的穩(wěn)定性、重復(fù)性和特異性是衡量其能否在實(shí)際檢測中應(yīng)用的關(guān)鍵指標(biāo)。如表2所示，3 組菌液的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，顯示了較高的精密度，表明Fe3O4@3D-RGO復(fù)合修飾材料制備的電化學(xué)免疫傳感器具有較好的重復(fù)性。電化學(xué)免疫傳感器穩(wěn)定性測試阻抗圖譜見表3，當(dāng)其阻抗響應(yīng)值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，表明修飾電極具有較好的穩(wěn)定性[31]。為了進(jìn)一步測試免疫傳感器的特異性，用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等非目標(biāo)菌進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖9所示，結(jié)核桿菌引起的阻抗變化約為非目標(biāo)菌的8 倍，說明該免疫傳感器的特異性較好。

表2 電化學(xué)免疫傳感器的重復(fù)性測試結(jié)果Table 2 Repeatability evaluation of the electrochemical immunosensor

表3 電化學(xué)免疫傳感器的穩(wěn)定性測試結(jié)果Table 3 Stability evaluation of the electrochemical immunosensor

圖9 電化學(xué)免疫傳感器特異性分析Fig. 9 Specificity analysis of the electrochemical immunosensor

2.7 人工污染牛乳樣品檢測結(jié)果

將所制備的電化學(xué)免疫傳感器用于人工污染牛乳樣品檢測，其結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)法進(jìn)行對比，并用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析（表4）。結(jié)果表明，電化學(xué)免疫傳感器檢測法與傳統(tǒng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)法結(jié)果一致（P=0.270＞0.05），電化學(xué)免疫傳感器法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.53%～8.19%，回收率在107%～118%之間。

表4 人工污染牛乳樣品中結(jié)核桿菌37Ra的檢測（n=3）Table 4 Detection of M. tuberculosis 37Ra in artificially contaminated milk (n= 3)

表4 人工污染牛乳樣品中結(jié)核桿菌37Ra的檢測（n=3）Table 4 Detection of M. tuberculosis 37Ra in artificially contaminated milk (n= 3)

樣品號 傳統(tǒng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)法/（CFU/mL）電化學(xué)免疫傳感法/（CFU/mL） RSD/% 回收率/%1 4.4×103 4.9×103 8.19 111 2 4.4×104 5.2×104 7.02 118 3 4.4×105 5.1×105 6.53 115 4 4.4×106 4.7×106 8.51 107

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用水熱一步還原法制備了Fe3O4@3D-RGO復(fù)合材料，利用75%的乙醇溶液和0.1% Nafion溶液作為分散體系，簡便、高效地制備了電化學(xué)免疫修飾電極，并將其應(yīng)用于牛乳中結(jié)核桿菌H37Ra的快速定量檢測。所制備的電化學(xué)免疫傳感器線性范圍寬、靈敏度高、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好、在15 min內(nèi)即可得到結(jié)果，與傳統(tǒng)檢測方法（2～8 周）相比，有效縮短了檢測時(shí)間，為便攜式傳感器的構(gòu)建及乳品中結(jié)核桿菌的現(xiàn)場快速檢測提供了技術(shù)支撐。