氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定嬰幼兒配方奶粉中氯丙醇酯和縮水甘油酯

林麗珊，傅武勝,，張一可，高 博，藍麗華，龐 杰

（1.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350000；2.福建省人獸共患病研究重點實驗室，福建省疾病預防控制中心，福建 福州 350001；3.福建醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，福建 福州 350122；4.福建國際旅行衛(wèi)生保健中心，福建 福州 350003；5.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122）

氯丙醇酯（chloropropanols esters，MCPDE）和縮水甘油酯（glycidyl esters，GE）是在熱加工處理或氯離子作用下形成的一類食品加工過程污染物[1-3]。2012年國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）將3-氯丙醇（3-monochloropropane-1,2-diol，3-MCPD）和縮水甘油（glycidol，Gly）分別列為2B、2A類致癌物[4-5]。2017年，歐盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）確定了人體對3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯（3-chloro-1,2-propanediol fatty acid ester，3-MCPDE）的每日最大允許耐受量（tolerable daily intake，TDI）為2.0 μg/（kg·d），食品添加劑委員會將其暫定為4.0 μg/（kg·d）[6]。這些污染物普遍存在精煉食用油等油脂性食品中[7-8]，嬰幼兒配方奶粉（以下簡稱嬰配）含有約20%的脂肪，其主要來自于生產(chǎn)中添加的食用植物油，因此容易造成MCPDE和GE的污染[9]。對于嬰兒，配方乳粉是母乳的唯一替代品，因此此類物質(zhì)引起的食品安全問題一直倍受國際關注。2016年EFSA報道歐盟地區(qū)嬰配中3-MCPDE和GE的平均含量分別為0.108、0.087 mg/kg（以奶粉計）[10]。Arisseto等[11]報道巴西市售嬰配3-MCPDE和GE的平均含量分別高達0.150、0.220 mg/kg，由此評估0～5 月齡嬰兒3-MCPDE的平均攝入量達2.49 μg/（kg·d），超過EFSA提出的TDI，1 歲以下嬰兒GE的暴露邊界比（margin of exposure，MOE）為2 793～6 635，明顯小于界限值（25 000），顯示存在致癌風險。上述產(chǎn)品中GE均值也超過了歐盟制訂的限量值（0.050 mg/kg，以奶粉計）[12]。

目前有關MCPDE和GE測定方法的研究多集中于食用植物油，針對嬰配基質(zhì)的報道較少。由于嬰配生產(chǎn)中添加的配料種類多，加上生產(chǎn)工藝復雜且產(chǎn)品之間差異大，因此嬰配中該類物質(zhì)測定的難度較大，影響結果準確性的因素較多，尤其脂肪的提取和水解步驟影響較大。一般待測物MCPDE和GE隨脂肪一起從嬰配中提取出來，提取方法主要有加速溶劑提取法[13]或加壓溶劑提取法[14]、液-液萃取法[15]和堿水解法[16]。待測物定量的方法有直接法和間接法2 種，直接法采用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀測定各單體物質(zhì)的方式實現(xiàn)[15-17]，因此結果通常偏低且測定成本高；間接法能獲得總量，結果相對準確，但操作步驟較為繁瑣，需經(jīng)水解（酯交換反應）、衍生后再以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定，通過檢測水解產(chǎn)物的衍生物而得到MCPDE和GE的含量，水解方法有酸水解[18-19]、堿水解[20-22]以及酶解法[23]。目前國內(nèi)外均無此類物質(zhì)的法定強制性檢測方法，標準化方法僅有美國分析化學家協(xié)會（Association of Official Agricultural Chemists，AOAC）法[24]，該法一開始就在嬰配中加入內(nèi)標后提取，而更多報道采用在提取出的脂肪中加入內(nèi)標再進行預處理的做法。我國報道了嬰配中MCPDE[25]或GE[26]一類物質(zhì)的測定方法，無法實現(xiàn)3 類物質(zhì)的同時測定。為此，在本實驗室建立的食用油MCPDE和GEGE測定方法的基礎上，建立同時測定嬰配中這3 類物質(zhì)的方法，并對重要因素進行了優(yōu)化，取得較好效果，該方法已被編入我國食品安全風險監(jiān)測工作手冊，在全國推廣應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰配（編號為A及YL-34） 市售。

氨水、乙醇、乙醚、石油醚（30～60 ℃）、硫酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；四氫呋喃、甲醇、正己烷、異辛烷、二氯甲烷（均為色譜純） 美國Fisher公司；七氟丁酰基咪唑衍生（N-heptafluorobutyrylimidazole，HFBI） 北京百靈威科技有限公司；高效脫水劑、硅藻土固相萃取小柱（1.5 g/45 mL，另含3.0 g硅藻土分散劑） 福州勤鵬生物科技公司；去離子水由實驗室制備。

3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸二酯（純度98%，CAS號51930-97-3）、2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸二酯（純度98%，CAS號267-56-4）、縮水甘油棕櫚酸酯（純度95%，CAS號7501-44-2）及對應同位素D5-3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸二酯（純度99%，CAS號1185057-55-9）、D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸二酯（純度99%）、D5-縮水甘油-棕櫚酸酯（純度97.5%） 加拿大TRC公司。

1.2 儀器與設備

7890A-7000B氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；G-560E型旋渦混合器 美國Scientific Industries公司；DKN602型電熱恒溫鼓風干燥箱 日本Yamato公司；CP225D電子天平（感量至0.01 mg） 德國Sartorious公司；YP202電子天平（感量至0.01 g）上海精密科學儀器公司；BM510-RE801旋轉蒸發(fā)儀日本Yamato公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器 常州金壇精達儀器制造公司；EFAA-DC24氮吹儀 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪的提取和測定

參考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》[27]并進行適當?shù)膬?yōu)化。嬰配稱樣量經(jīng)優(yōu)化由5.00 g減少為1.50 g，氨水用量為3.0 mL，其余有機溶劑用量也按照相應比例進行調(diào)整。

1.3.1.1 嬰配的稱樣量

分別稱取1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 g奶粉于15 支50 mL塑料離心管中，保持與GB 5009.6—2016[27]相同的料液比加入有機溶劑，每組（稱樣量）重復3 次實驗，以奶粉計。

1.3.1.2 氨水用量

準確稱取1.50 g嬰配于15 支50 mL離心管中，加入5 mL熱水（65±5）℃分散后，于對應的離心管中分別加入氨水1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，進行脂肪提取及后續(xù)目標含量的測定，每組重復操作3 次實驗，以奶粉計。

1.3.1.3 干燥方式

準確稱取1.50 g嬰配于9 支50 mL離心管中，將所得提取液濃縮后，采用3 種方式干燥脂肪，對比干燥方式對MCPDE和GE測定結果的影響，具體為真空干燥（50～60 ℃、2 h）、國標干燥法（105 ℃、2 h）[27]和高溫干燥法（120 ℃、2 h），每個條件重復實驗3 次。

1.3.2 MCPDE與GE含量的測定

準確稱取脂肪0.100 g（精確至1 mg），加入混合內(nèi)標液后渦旋，先進行溴代將GE轉化為3-溴丙醇酯，再采用酸水解法進行酯交換，將待測物水解為3-MCPD、2-MCPD和3-溴丙醇；水解液經(jīng)堿中和后，用基質(zhì)分散固相萃取法凈化，洗脫液充分脫水后濃縮，經(jīng)HFBI衍生后供氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，采用同位素內(nèi)標法對3-MCPDE、2-氯-1,3-丙二醇脂肪酸酯（2-chloro-1,3-propanediol fatty acid ester，2-MCPDE）和GE定量，具體操作步驟參考文獻[28]。

1.3.3 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定

氣相色譜條件：參考文獻[28]方法進行測定。色譜柱：DB-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；不分流進樣；進樣體積1.0 μL；進樣口溫度280 ℃；載氣為高純氦氣，恒流，流速0.8 mL/min；程序升溫：50 ℃保持1 min，然后以3 ℃/min升溫至100 ℃，再以40 ℃/min升溫至300 ℃，保持3 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源；電離能量70 eV；多反應監(jiān)測模式；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；傳輸線溫度280 ℃；溶劑延遲3.75 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

若未經(jīng)特別說明以脂肪計（脂肪干燥實驗結果），本實驗MCPDE及GE含量均以奶粉計。用Excel 2019進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，通過SPSS 17軟件進行顯著性分析，并以Origin 8.5軟件作圖。嬰配中MCPDE、GE的含量按下式計算：

式中：X為嬰配中MCPDE、GE的含量（分別以氯丙醇、縮水甘油計）/（μg/kg）；W為由標準曲線計算得到的脂肪中MCPDE和GE的質(zhì)量/ng；m為嬰配脂肪的質(zhì)量/g；f為嬰配中脂肪質(zhì)量分數(shù)/%。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的建立

圖1 嬰配基質(zhì)FAPAS 2656中MCPD與Gly衍生物的多反應監(jiān)測色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of MCPD and Gly derivatives in infant formula matrix FAPAS 2656

表1 MCPD和3-MBPD定量、定性離子對及碰撞電壓Table 1 Quantitative, qualitative ion pairs and collision voltage for MCPD and 3-MBPD

將MCPD、MBPD及其同位素用乙酸乙酯配制為20 μg/mL的單一標準液，用HFBI衍生后，用全掃描方式進行測定，以此獲得各物質(zhì)的特征離子。選擇特征離子對，在多反應監(jiān)測模式下進行監(jiān)測。如圖1、表1所示，目標物能從干擾雜質(zhì)中得到有效分離，確保了準確定量。

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 嬰配稱樣量

表2 稱樣量對MCPD和G的影響Table 2 ffect of sample mass on the determination of MCPD and G

表2 稱樣量對MCPD和G的影響Table 2 ffect of sample mass on the determination of MCPD and G

化合物 含量/（μg/kg）1.00 g 1.50 g 2.00 g 2.50 g 3.00 g 3-MCPDE 176 183 183 183 183 2-MCPDE 63.5 65.2 68.5 67.2 65.7 GE 15.3 11.0 11.6 12.7 12.2

如表2所示，樣品稱取量在1.00～3.00 g之間時，測得3-MCPDE、2-MCPDE和GE含量基本一致，平均值分別為181.6、66.0、12.6 μg/kg，重復測定的相對標準偏差（relative standard derivation，RSD）均小于10%（n=3）。在單因素方差分析中，P0.05分別為0.838、0.311、0.125均大于0.05，表明嬰配樣品的均勻度高，稱樣量對MCPDE和GE含量測定均無顯著性影響。但稱取1.00 g時，所得脂肪僅為0.20 g左右，無法滿足多次測定的用量；稱取1.50 g時，得到的脂肪約為0.30 g，可滿足后續(xù)2～3 次測定所需要的量。但樣品量過多時，有機溶劑使用量較多，同時影響操作效率，如無法使用50 mL離心管進行振蕩提取。因此確定最佳稱樣量為1.50 g。

2.2.2 氨水用量

表3 氨水用量對MCPD和G含量的影響Table 3 ffect of ammonia on the determination of MCPD and G

表3 氨水用量對MCPD和G含量的影響Table 3 ffect of ammonia on the determination of MCPD and G

化合物 含量/（μg/kg）1.0 mL 2.0 mL 3.0 mL 4.0 mL 5.0 mL 3-MCPDE 211 209 186 233 196 2-MCPDE 61.2 71.6 62.1 59.6 63.6 GE 25.3 31.4 28.9 23.6 23.7

如表3所示，當氨水用量在1.0～5.0 mL之間變化時，測得樣品中3-MCPDE、2-MCPDE和GE的含量分別為186～213、59.6～71.6 μg/kg和23.6～31.4 μg/kg。方差分析3-MCPDE、2-MCPDE的P值（概率）分別為0.057、0.140，表明提取過程中氨水用量對3-MCPDE、2-MCPDE測定無顯著影響（P＞0.05）；GE的P值為0.005（F0.05=7.18，組間差異），表明氨水用量對GE測定有顯著性差異（P＜0.05），但當氨水用量在1.0～3.0 mL之間時，GE測定值無顯著差異（P=0.075）。對于本實驗待測物而言，1.0～3.0 mL的氨水對測定均無顯著性差異，但考慮到Rose Gottlieb Method[29]、GB 5009.6—2016[27]中測定嬰配脂肪含量時，氨水的適宜用量為3.0 mL。因此采用3.0 mL的氨水量時，能充分滿足這些指標準確檢測的要求。

2.2.3 脂肪干燥

圖2 脂肪干燥對MCPD和G含量的影響Fig. 2 Effect of fat drying on the determination of MCPDE and GE

MCPDE和GE為食品加工過程中形成的污染物，溫度是極其重要的影響因素[30]。因此，在提取過程中，比較3 種脂肪干燥溫度方式對MCPDE和GE測定結果的影響，見圖2。3 種脂肪干燥溫度對其無顯著性影響（P＞0.05），重復3 次實驗時RSD均小于10%，這說明在120 ℃以下的溫度干燥脂肪，均不會造成目標物含量的顯著增加，但干燥溫度仍然對3-MCPDE測定具有一定的影響，隨溫度升高測定值略有增加；干燥溫度由低到高，測得平均含量分別為784、800 μg/kg和888 μg/kg，顯示120 ℃干燥1 h時導致3-MCPDE測定值明顯偏高，達13.3%，而在105 ℃干燥1 h時測定值800 μg/kg僅略高于真空干燥時測定值，增加2.0%，幾乎可忽略不計?？紤]到真空干燥設備不是通常配備的實驗室設備，因此選擇105 ℃常壓加熱1 h的條件對脂肪進行干燥。

2.3 方法學指標考察結果

2.3.1 線性范圍、檢出限和定量限結果

表43 -MCPD、2-MCPD與G的檢出限與線性方程Table 4 LODs and linear equations for 3-MCPD, 2-MCPD and G

表43 -MCPD、2-MCPD與G的檢出限與線性方程Table 4 LODs and linear equations for 3-MCPD, 2-MCPD and G

質(zhì)量濃度范圍/（μg/mL）化合物 線性方程 線性范圍/（μg/kg）檢出限/（μg/kg）定量限/（μg/kg）3-MCPDE y=0.006 6x＋0.022 100～2 000 0.01～0.20 5 15 2-MCPDE y=0.007 9x＋0.010 3 100～2 000 0.01～0.20 5 15 GE y=0.003 1x＋0.013 7 100～2 000 0.01～0.20 10 30

以不含待測物空白油為基質(zhì)，計算信噪比。檢出限（RSN=3）和定量限（RSN=10）[31]結果見表4。分別以3-MCPD、2-MCPD及Gly表示3-MCPDE、2-MCPDE及GE的含量。將3-MCPD、2-MCPD及GE與其各自內(nèi)標物峰面積的比值Y和脂肪中待測物的質(zhì)量X（ng，以醇計）進行線性回歸，相關系數(shù)在0.999以上。

2.3.2 精密度和準確度結果

嬰配（YL-34）的脂肪質(zhì)量分數(shù)為20.5%，3-MCPDE、2-MCPDE和GE的含量（以奶粉計）分別為21.3、8.20、5.34 μg/kg，本底值較低，因此適合加標實驗。向提取的脂肪中加入標準溶液，加標含量分別為100、400、1 000 μg/kg；以奶粉計時，加標含量分別為20.5、82.0、205 μg/kg，其中82.0 μg/kg與歐盟規(guī)定的GE限量值（75.0 μg/kg）較為接近。在上述最優(yōu)條件下進行實驗，考察測定的準確度和精密度，分別以重復6 次回收率和RSD表示，結果見表5。

表5 嬰配的加標回收率和RSD結果（n=6）Table 5 Spiked recoveries and RSDs of 3-MCPD, 2-MCPD and Gfrom infant formula (n= 6)

表5 嬰配的加標回收率和RSD結果（n=6）Table 5 Spiked recoveries and RSDs of 3-MCPD, 2-MCPD and Gfrom infant formula (n= 6)

注：1～6為重復次數(shù)。

化合物 加標含量/（μg/kg）測定值/（μg/kg）回收率/% RSD/%1 2 3 4 5 6 3-MCPDE 20.5 22.8 103 108 104 96.9 111 114 8.5 82.0 83.5 97.3 98.4 106 102 104 114 6.0 205 204 93.2 104 100 102 97.1 99.4 3.7 2-MCPDE 20.5 18.2 103 106 98.4 90.4 89.0 81.5 10 82.0 72.0 95.9 96.9 95.5 92.4 87.8 91.6 3.6 205 194 95.3 98.2 94.8 95.5 101 100 2.6 20.5 19.8 96.6 107 90.5 91.9 94.0 89.4 6.7 82.0 78.3 94.4 94.8 93.8 100 91.5 84.7 5.5 205 204 101 103 98.0 104 96.6 94.3 3.9 GE

由表5可知，該嬰配在20.5～205 μg/kg水平下進行6 次加標實驗，3-MCPDE、2-MCPDE及GE的回收率分別為93.2%～114%、81.5%～106%和84.7%～107%，RSD在2.6%～10%之間，說明優(yōu)化后的方法具有較好的準確度和精確度，滿足方法學指標的要求。

2.4 FAPAS 2656考核樣品測定結果

采用所建立的測定方法參加2019年英國食品與環(huán)境研究院舉辦的國際能力驗證[32]，項目編號為FAPAS 2656，樣品基質(zhì)為嬰幼兒配方乳粉，由此更好地驗證了本方法的準確性。全球共29 個實驗室報名參加該次能力驗證，但結果提交率僅為81%；在提交結果的實驗室中，3-MCPDE和2-MCPDE的滿意率（|Z|＜2）較低，分別為56%（15/27）和68%（15/22）。3-MCPDE、2-MCPDE的指定值分別為44.0、16.4 μg/kg，采用本方法測得含量分別為35.2、17.7 μg/kg，對應Z值分別為－0.9和0.4，結果滿意（Z＜2.0），表明所建立的方法準確可靠。但本實驗測定GE含量為21.7 μg/kg，由于各實驗室報告的GE含量較為分散，無法用Z值進行評定和統(tǒng)計。

3 結 論

本實驗對嬰配脂肪提取、制備過程中的3 個因素進行研究，考察其對后期MCPDE和GE含量測定的影響，并對優(yōu)化后的方法進行系統(tǒng)評價和性能考察，重點是采用加標回收率實驗，對方法的準確度和精密度指標進行考察。結果表明，在脂肪提取過程中，嬰配稱樣量、氨水用量以及干燥方式對后續(xù)脂肪中MCPDE和GE含量測定均無顯著性差異，但考慮氨水添加量對GE以及干燥方式對3-MCPDE的影響，以嬰配稱樣量為1.50 g、氨水用量為3.0 mL、105 ℃干燥1 h為實驗最優(yōu)條件。優(yōu)化后方法的靈敏度、精密度和準確度均較為理想，同時參加國際能力考核（FAPAS 2656），測定結果Z值小于1.0，獲得滿意成績，更進一步驗證了本方法的精確度和準確度。該方法也被指定作為國家食品安全風險監(jiān)測工作手冊方法，在全國推廣應用，為有關監(jiān)測工作提供了可靠的技術支撐。