外泌體microRNA的生物學(xué)特征及在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用

張詩琬，喻雪琴，陳 芳，梅怡晗，梅小平

1 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 感染科，四川 南充 637000； 2 首都醫(yī)科大學(xué)朝陽醫(yī)院 感染科，北京 610041

肝纖維化是肝組織炎癥反應(yīng)發(fā)生后組織修復(fù)過程中細胞外基質(zhì)過度沉積后的一種病理結(jié)果，其具體發(fā)生機制尚不明確，但纖維化的發(fā)生與肝星狀細胞(HSC)的激活、成纖維細胞與其他細胞間信息傳遞失衡關(guān)系密切，如與一氧化氮酶活性程度、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)等細胞生長因子水平表達失衡等顯著相關(guān)。外泌體是通過細胞胞吐作用而釋放的一種膜性泡體，生物活性分子蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸等物質(zhì)包裹在膜性泡體內(nèi)，而且核酸內(nèi)包含mRNA、microRNA(miRNA)等信息物質(zhì)，在細胞間通過信號物質(zhì)傳輸、信息傳導(dǎo)與交互來參與對靶細胞的各種生理與病理活動[1]。外泌體miRNA作為細胞間信號傳導(dǎo)的橋梁之一，研究表明，其對細胞外基質(zhì)的形成與降解發(fā)揮了關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。作者認(rèn)為，外泌體miRNA有可能成為未來肝纖維化診治的潛在新型生物學(xué)指標(biāo)。本文就外泌體miRNA的形成與生物學(xué)特點及在肝纖維化發(fā)生機制中的作用做一綜述。

1 外泌體miRNA的形成與生物學(xué)特點

1.1 外泌體miRNA概述 來自于人體組織細胞可通過生物信號分子的傳導(dǎo)與漂移來介導(dǎo)細胞間交換，又稱細胞間通訊，是多細胞生物體信號交互的一種手段。細胞外囊泡作為一種重要的生物分子載體，在細胞通訊中起著非常重要的載體作用，可分為外泌體、微泡及凋亡小體三個亞群[2]。外泌體由科學(xué)家于1987年首次在綿羊網(wǎng)織紅細胞中發(fā)現(xiàn)并命名為“exosomes”[3]，其由細胞內(nèi)多囊泡體形成，多經(jīng)淋巴細胞、肝細胞、HSC、間充質(zhì)干細胞等分泌釋放到人體的內(nèi)環(huán)境中。Yez-M等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在人體血液、尿液、唾液、腦脊液等體液中均有外泌體miRNA等的表達與存在。細胞分泌的外泌體膜性囊泡內(nèi)含mRNA、miRNA等生物活性分子，人體外周血中miRNA的主要信號分子來源就是外泌體[5]，外泌體通過將其內(nèi)的miRNA等信號分子傳遞給其他細胞來完成細胞間的信號交換，從而調(diào)控靶器官或細胞內(nèi)(間)的各種生理與生化活動。

1.2 外泌體的形成 機體細胞內(nèi)的外泌體合成以細胞膜內(nèi)陷內(nèi)吞作用形成具有脂質(zhì)雙分子層的內(nèi)吞囊泡為起始步驟，隨后其核內(nèi)胞膜再次發(fā)生內(nèi)陷使之分隔成多腔內(nèi)小囊泡，其特異性的內(nèi)容物在重組與運轉(zhuǎn)蛋白作用下，選擇性地包裹胞內(nèi)mRNA、miRNA、脂質(zhì)等物質(zhì)形成終末期內(nèi)體，隨后終末期內(nèi)體以內(nèi)出芽模式形成管腔狀囊泡，即多囊泡體[6]，其細胞胞漿中miRNA等物質(zhì)與一些跨膜分子蛋白進入囊泡內(nèi)，囊泡膜隨之與胞膜融合，再次發(fā)生囊泡膜內(nèi)陷形成顆粒囊泡，隨之顆粒囊泡分泌釋放至胞外形成外泌體[7]。信號蛋白Rab、GTP蛋白及下游信號分子GEF和GAP等一些小分子蛋白參與了外泌體的形成與分泌，多囊泡體通過微管驅(qū)動蛋白及動力蛋白來供給動力以發(fā)生漂移，Rab7與下游靶蛋白Alix和TSG101來調(diào)節(jié)多囊泡體的運動方向[8]。

外泌體通過胞吐作用將miRNA、mRNA等信號物質(zhì)釋放至胞外并與靶細胞特異性融合，將其所含miRNA、mRNA等信號物質(zhì)傳遞給靶細胞以此來調(diào)節(jié)靶細胞中的蛋白表達、免疫功能、細胞增殖、分化及凋亡等各種生理病理過程。靶細胞可通過以下三種模式來發(fā)揮信息交換與傳導(dǎo)：(1)外泌體膜上磷脂酰絲氨酸與活化的T淋巴細胞及巨噬細胞膜上的T1MI、TIM4等受體結(jié)合形成復(fù)合體，再與靶細胞膜上的整合素αvβ3、αvβ5結(jié)合；(2)靶細胞直接發(fā)揮內(nèi)吞作用將外泌體吸收；(3)外泌體膜上特異性受體與靶細胞膜上相應(yīng)配體結(jié)合，從而將內(nèi)容物傳遞給靶細胞[9]。

多囊泡體內(nèi)miRNA、mRNA等信號物質(zhì)分泌釋放至細胞外被靶細胞吸收是多囊泡體在細胞內(nèi)的去向之一。另外，胞內(nèi)多囊泡體與溶酶體融合后的酸性水解酶可降解多囊泡體內(nèi)的miRNA、mRNA等信號物質(zhì)。最新研究[10]結(jié)果顯示，外泌體可以胞膜內(nèi)出芽模式釋放到細胞外，也可以細胞內(nèi)質(zhì)膜連接隔室發(fā)生出芽而延緩釋放?？傊?，外泌體的合成及釋放機制目前尚不明確，但可以肯定的是多囊泡體內(nèi)miRNA、mRNA等信號物質(zhì)可以外泌體形式釋放出細胞外，以外泌體為載體完成細胞間信息傳遞與交流，從而起到對疾病發(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用。

1.3 外泌體的生物學(xué)特點 研究發(fā)現(xiàn)，外泌體作為一種細胞分泌釋放的微型小囊泡，內(nèi)含miRNA、mRNA等信號物質(zhì)，外泌體作為信號物質(zhì)的載體，可通過配受體結(jié)合或細胞間直接接觸發(fā)生吞噬或融合作用,將mRNA、miRNA等信號物質(zhì)傳遞出去，是實現(xiàn)細胞間信號物質(zhì)與信息交流的重要載體。

由于來源于不同組織細胞的內(nèi)含物不同，外泌體間存在不同種類，但都有相同的蛋白分子，如膜轉(zhuǎn)運蛋白、融合蛋白、熱休克蛋白、整合素與跨膜蛋白超家族中的CD9、CD63及CD81等。其中CD9及CD81作為外泌體特有蛋白分子，可作為外泌體特有的生物學(xué)標(biāo)志物[11]。來源不同的外泌體miRNA功能差異較大[12]，如被病原菌感染過的細胞分泌的外泌體就包裹有病原體相關(guān)抗原；來源于T 、B淋巴細胞的外泌體，可表達T、B淋巴細胞相應(yīng)的受體，并具有黏附受體的作用。相對應(yīng)的，肝臟發(fā)生纖維化后，肝臟細胞分泌釋放的外泌體內(nèi)就含有與肝纖維化發(fā)生密切相關(guān)的信號分子，如miRNA-122、miRNA-19a、miRNA-214等，并且在脂肪堆積的脂肪肝中，肝細胞受到脂肪酸損傷后會產(chǎn)生一種類外體小泡，其內(nèi)含有miRNA-17-92，隨之被HSC內(nèi)吞，進而發(fā)生肝纖維化[13]，通過對外泌體中miRNA、mRNA等信號物質(zhì)的性質(zhì)、活性及表達量的分析將對肝纖維化等疾病的發(fā)生機制與診治有重要的指導(dǎo)作用。

外泌體內(nèi)容物所含核酸種類最多的是RNA，只有一些特定的RNA才會進入外泌體內(nèi)從而被分泌，外泌體所含RNA與細胞中RNA差別較大，外泌體RNA一般不超過200個核苷酸[14]，主要由miRNA、mRNA、tRNA、lncRNA等非編碼核苷酸構(gòu)成，這些外泌體所含RNA具有相應(yīng)的調(diào)節(jié)功能，在被轉(zhuǎn)運到靶細胞后，可翻譯成蛋白質(zhì)來發(fā)揮其特有功能，如外泌體所含特定miRNA被傳遞到靶細胞后，可通過修飾相應(yīng)的靶miRNA來調(diào)節(jié)其相應(yīng)基因的表達及功能。

外泌體是人體循環(huán)血中miRNA的主要來源，外泌體中miRNA在脂質(zhì)雙分子膜保護下能夠不被RNA酶所降解，保持其在細胞、靶細胞與體內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，使其在人體血液等體液中結(jié)構(gòu)與表達水平能被穩(wěn)定地檢出，不同病生狀態(tài)下循環(huán)血清中miRNA水平表達的差異性較大。因此外泌體中miRNA可能成為肝纖維化等疾病診治、預(yù)后評估等可靠的潛在新型生物學(xué)指標(biāo)。

2 外泌體miRNA與肝纖維化

2.1 外泌體miRNA對肝纖維化發(fā)生的調(diào)節(jié)作用

2.1.1 外泌體miRNA對HSC的影響 有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNA相關(guān)基因表達與HSC活化、增殖、凋亡等生理活動密切相關(guān)。HSC是細胞外基質(zhì)的主要來源，是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，miRNA可通過其信號傳導(dǎo)與物質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑來調(diào)控靶細胞內(nèi)相關(guān)肝纖維化基因的轉(zhuǎn)錄及水平表達，來源于外泌體內(nèi)的miRNA對HSC激活、增殖、凋亡、漂移等生理過程有重要的調(diào)節(jié)作用，能誘導(dǎo)HSC的活化、增殖來促進肝纖維化的發(fā)生。

Seo等[15]研究發(fā)現(xiàn)，受損傷肝細胞可釋放眾多外泌體所有的自體RNA，并攜帶Toll樣受體3(TLR3)配體，能與HSC膜上的TLR3結(jié)合并誘導(dǎo)和促進HSC的激活、增殖，從而促進HSC表面的CC類趨化因子配體20(C-C motif chemokine ligand 20，CCL20)水平高表達，而CCL20可誘導(dǎo)高表達的CCR6+和γδT淋巴細胞聚集，抑制HSC凋亡，促進γδT淋巴細胞分泌大量的IL-17A，進而促進肝纖維化的形成。

Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，HSC可分泌外泌體miRNA-214并在CCL20等趨化作用下黏附在附近的HSC或肝細胞膜上，促進同一細胞或不同細胞間信息傳導(dǎo)，其研究發(fā)現(xiàn)，肝組織發(fā)生纖維化時，促纖維化的結(jié)締組織生長因子(CCN2)水平高表達，這與低水平表達的miRNA-214呈負(fù)相關(guān)，提示miRNA-214對HSC的活化、增殖發(fā)揮了抑制作用，作者認(rèn)為，通過外泌體miRNA-214與CCN2 3′-UTR的結(jié)合來抑制CCN2水平的表達，可下調(diào)其下游靶細胞基因表達。在肝組織纖維化時，HSC通過激活多條信號通路來下調(diào)miRNA-214水平表達，從而對CCN2的抑制作用減弱，因此，外泌體miRNA-214低水平表達可能是致肝纖維化發(fā)生的誘發(fā)因素之一。研究[17]發(fā)現(xiàn)，激活后的HSC可促進分泌釋放含轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Twist1外泌體的低水平表達，而Twist1可抑制miRNA-214的水平表達而減弱miRNA-214對CCN2的抑制作用，隨后受體細胞促進CCN2的表達水平上調(diào)，促進了α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及膠原蛋白水平高表達，誘導(dǎo)和促進了肝組織纖維化的發(fā)生發(fā)展[18]。

受損肝細胞、內(nèi)皮細胞不僅參與HSC的活化，還參與了HSC的漂移過程，內(nèi)皮細胞外泌體分泌鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase 1，SK1)，并通過纖連蛋白及整合素介導(dǎo)附著在HSC膜上，在動力蛋白2的作用下以內(nèi)吞模式進入HSC內(nèi)，從而激活HSC及與肝纖維化發(fā)生相關(guān)的AtK信號通路，外泌體miRNA的激活促進了致肝纖維化miRNA的漂移進而促進肝纖維化的發(fā)生[19]。而SK1的活化與成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)密切相關(guān)，有研究[20]結(jié)果顯示，F(xiàn)GF-2對外泌體miRNA的釋放有顯著的調(diào)節(jié)作用，SK1的靶蛋白是鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine 1-phosphate，S1P)，高表達的SK1可促進S1P水平高表達而趨化HSC的聚集與活化，同時還激活絲氨酸/蘇氨酸激酶來調(diào)控HSC的活化、增殖與漂移能力，從而發(fā)揮對肝纖維化發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)作用。有學(xué)者[21]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過四氯化碳處理后發(fā)生肝纖維化的小鼠，其循環(huán)血中來源于外泌體的miRNA水平明顯上調(diào)，促進了HSC的活化、增殖及細胞外基質(zhì)的形成，這可能與SK1/S1P有關(guān)，研究結(jié)果提示調(diào)控外泌體miRNA水平表達可能是抗肝纖維化治療的潛在手段和研究方向。

2.1.2 外泌體miRNA對肝纖維化標(biāo)志物水平的影響 肝細胞受損后分泌釋放的外泌體miRNA可提高HSC活化以及增殖的標(biāo)志性蛋白α-SMA、纖維化標(biāo)志物TGFβ受體Ⅱ、Ⅰ型膠原蛋白α2的高表達，這與外泌體miRNA-17-92[22]等高表達關(guān)系密切。有研究[13]表明，在肝細胞受到脂肪酸侵害時，就會分泌釋放含有miRNA-17-92的囊泡小體，HSC可進行吞噬從而激活肝纖維化。同時抗纖維化的miRNA水平表達與肝細胞受損程度及修復(fù)后肝纖維化水平密切相關(guān)，如外泌體miRNA-122可增強肝組織再生基因絲裂原活化蛋白激酶及低氧誘導(dǎo)因子等的水平表達來參與肝組織纖維化的發(fā)生[23]。Devhare等[24]研究發(fā)現(xiàn)，HBV、HCV感染后的肝細胞會釋放一種外泌體(HCV-exo)促使HSC發(fā)生內(nèi)吞作用以促進纖維化標(biāo)志物水平升高，特別是miRNA-19a的高表達。肝細胞與HSC之間通過外泌體miRNA來實現(xiàn)細胞間信息介導(dǎo)和表達并調(diào)節(jié)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

2.2 外泌體miRNA在肝纖維化診斷中的作用 外泌體與其他細胞膜接觸融合后將利用外泌體內(nèi)的脂質(zhì)雙分子層膜來保持miRNA結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，并傳遞到靶細胞內(nèi)完成細胞間的信息交換，從而發(fā)揮對HSC活化、增殖的調(diào)節(jié)作用。Devhare等[24]研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染后的肝細胞可釋放外泌體miRNA-19及靶向分子SOCS3至HSC膜上，并與相應(yīng)受體結(jié)合后促進HSC的激活與增殖，且慢性HCV感染所致的肝纖維化患者血清中miRNA-19a水平較健康體檢者明顯升高。有學(xué)者認(rèn)為，循環(huán)血清中外泌體miRNA-19a水平可能成為肝纖維化程度及預(yù)后評估的潛在新型生物學(xué)指標(biāo)之一。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNA-214在活化的HSC中低表達，對CCN2抑制作用減弱導(dǎo)致其表達上調(diào)，CCN2水平不僅受到外泌體miRNA-214水平影響與調(diào)控，且CCN2可被外泌體包裹，由HSC釋放到體液中，介導(dǎo)HSC活化與信息傳導(dǎo)，提示外泌體miRNA-214及CCN2、Twist1等信息分子間相互作用對肝纖維化發(fā)生過程具有調(diào)控作用。外泌體miRNA在人體尿液、血液、腦脊液等體液中雖然表達微量但均可檢測，因此外泌體miRNA-214有望成為肝纖維化程度評估指標(biāo)，可能成為一種新的肝纖維化診斷的非侵入性的潛在生物標(biāo)志物。研究[13]表明，纖維細胞也可分泌釋放外泌體，且包含miRNA-21、miRNA-142a、miRNA-125b、miRNA-126、miRNA-130a以及miRNA-132等活性分子，這些活性物質(zhì)對膠原纖維的產(chǎn)生有著促進作用，在人體組織損傷、傷口愈合的早期有利于膠原纖維的堆積，促進傷口愈合，因此在肝臟發(fā)生纖維化時，纖維細胞分泌的外泌體中這些信號分子的表達增高，可作為輔助診斷肝纖維化的生物學(xué)標(biāo)志物。

2.3 外泌體miRNA對肝纖維化治療的影響 外泌體miRNA可通過各種途徑影響HSC活化與增殖，抑制HSC凋亡可促進肝纖維組織增生，但有研究發(fā)現(xiàn)，來源于干細胞的外泌體可通過抑制肝纖維化相關(guān)因子及信號通路來發(fā)揮抗肝纖維化作用。

Hyun等[25]研究發(fā)現(xiàn)，來源于絨毛膜板的間質(zhì)干細胞外泌體miRNA-125b可通過抑制Hedghog信號通路來阻止肝纖維化發(fā)生。Li等[26]在研究四氯化碳與小鼠肝纖維化關(guān)系的實驗中發(fā)現(xiàn)，來源于人臍帶的間充質(zhì)干細胞外泌體miRNA可通過抑制TGFβ/Smad信號通路、減弱p-Smad2水平表達來抑制α-SMA、細胞外基質(zhì)合成以降低其表達，同時也抑制肝細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，從而減輕肝細胞受損程度。Tan等[27]研究發(fā)現(xiàn)，來源于間充質(zhì)干細胞的外泌體miRNA可通過上調(diào)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝周期及肝細胞中增殖細胞核抗原表達來提高肝細胞的增殖，促進肝細胞的再生和肝功能的修復(fù)。

有研究[28]表明，來源于脂肪組織的間充質(zhì)干細胞(adipose tissue-derived mesenchymalstem cells，ADSCs)的外泌體miRNA可抑制TGFβ1的水平表達以調(diào)控肝纖維化的發(fā)生。由肝臟Kupffer細胞產(chǎn)生的TGFβ1，可促進HSC活化并誘導(dǎo)HSC增殖，活化的HSC可促進TGFβ1高表達，在成纖維細胞活化與增殖后可促進細胞外基質(zhì)水平升高從而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。TGFβ1的啟動子有兩個State3結(jié)合位點，在活化的HSC中，激活后的State3可促進TGFβ1水平升高導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。同時State3可通過MAPK/ERK信號通路上調(diào)Bcl-2的表達[29]，ADSCs來源的外泌體miRNA通過與靶細胞膜融合并向靶細胞傳遞信號后下調(diào)HSC中State3及Bcl-2水平表達，從而使TGFβ1水平下調(diào)，抑制HSC活化與增殖，外泌體miRNA下調(diào)下游靶基因TGFβ1水平來抑制TIMP-1和PAI-1等信號通路活性，從而抑制膠原蛋白、α-SMA、纖維黏連蛋白合成與水平表達，發(fā)揮抗肝纖維化作用[28]。Nong等[30]研究發(fā)現(xiàn)，來源于間充質(zhì)干細胞的外泌體miRNA對大鼠肝缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)可起到明顯的抑制作用，減輕了肝臟再灌注后的損傷程度。

肝組織受損后，不同細胞來源的外泌體miRNA通過各種途徑來促進肝纖維化的發(fā)生，同時肝纖維化過程也受到外泌體miRNA的抑制作用，減輕肝組織的纖維化進展，這可能與HSC的活化、增殖及細胞外基質(zhì)形成關(guān)系密切。上文提到CCN2是一種對HSC活化、增殖、遷移起著重要作用的促纖維化活性因子，其表現(xiàn)出非?；钴S的成纖維細胞特性，促進了細胞外基質(zhì)的沉積，加速了肝纖維化進程。miRNA-214與CCN2呈負(fù)相關(guān)，靜止型HSC會釋放出一種抑制HSC活化及纖維生成的外泌體，這些外泌體將miRNA-214、miRNA-199a-5p以及Twist1傳遞給受體HSC，直接抑制CCN2的轉(zhuǎn)錄，從而抑制下游靶基因的表達，膠原纖維生成受阻，并且使活化的HSC恢復(fù)到更安靜的表型[13]。由此可見，外泌體miRNA將來可能被用于肝纖維化的治療，也許會成為肝纖維化診治和預(yù)后評估的新指標(biāo)。

總之，外泌體miRNA作為一種新型信息分子，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有2838 種miRNA和3408種mRNA，其在肝纖維化中的表達變化及其與肝纖維化的關(guān)系和作用機制尚不清楚。外泌體miRNA對肝纖維化過程中炎性反應(yīng)、HSC活化、增殖與凋亡、細胞外基質(zhì)沉積都有明顯抑制與促進的雙重作用。外泌體miRNA在人體體液中易被穩(wěn)定檢出，因此其可能作為肝纖維化程度、診斷及預(yù)后評估的新型生物學(xué)標(biāo)志物。但目前對外泌體miRNA在肝纖維化發(fā)生機制中作用的研究較少，能特異性反映肝組織纖維化的外泌體miRNA也較少，未來還需要更多的加強基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用驗證。來源于干細胞的外泌體miRNA可對肝纖維化進程產(chǎn)生抑制作用，減輕肝組織炎癥，促進肝組織炎癥及功能恢復(fù)，作者認(rèn)為，干細胞源性的外泌體miRNA在肝纖維化治療方面有較好的研究前景，可能成為未來抗肝纖維化治療的潛在新靶點。